王凱軍　譚支良　張佩華　韓奇鵬

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,畜禽遺傳改良湖南省重點實驗室，長沙410128；2.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所,亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，長沙410125)

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奶牛內(nèi)毒素的產(chǎn)生、影響和防控技術(shù)

王凱軍1,2譚支良2張佩華1*韓奇鵬1,2

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,畜禽遺傳改良湖南省重點實驗室，長沙410128；2.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所,亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，長沙410125)

內(nèi)毒素也稱為脂多糖，是革蘭氏陰性細菌死亡后或快速繁殖時細菌細胞壁破裂后釋放的一種物質(zhì)，在動物機體中普遍存在，過量時導(dǎo)致機體產(chǎn)生免疫應(yīng)激。本文介紹了奶牛內(nèi)毒素產(chǎn)生的原因和作用機制及其對奶牛采食量，血液中蛋白質(zhì)、氨基酸，乳中乳蛋白、乳脂的影響，減少奶牛內(nèi)毒素的途徑，為降低內(nèi)毒素對奶牛生產(chǎn)的影響提供參考。

內(nèi)毒素；機制；奶牛；瘤胃酸中毒；防控技術(shù)

瘤胃酸中毒是奶牛生產(chǎn)中常見疾病之一，研究證實其與內(nèi)毒素密切相關(guān)。正常情況下，奶牛瘤胃內(nèi)和血液中普遍存在內(nèi)毒素，只是含量較低，對機體不會造成負面影響。不僅如此，內(nèi)毒素也存在于養(yǎng)殖場空氣、糞便和飼料中，有研究表明奶牛養(yǎng)殖場空氣中內(nèi)毒素含量高達4 243 EU/m3[1-2]。內(nèi)毒素是生物免疫系統(tǒng)最強的誘導(dǎo)因子，能夠誘導(dǎo)許多細胞因子、趨化因子和其他炎性介質(zhì)[3]。給奶牛飼喂高精料飼糧使瘤胃積聚大量揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)，造成亞急性瘤胃酸中毒(subacute rumen acidosis,SARA)，同時奶牛瘤胃液pH下降，從而導(dǎo)致革蘭氏陰性細菌(Gram-negative bacteria,GNB)快速、大量地崩解，釋放內(nèi)毒素[4-5]。內(nèi)毒素是許多哺乳動物細胞(巨噬細胞、單核細胞和內(nèi)皮細胞等)的促炎反應(yīng)的強效激活劑，引起全身性免疫反應(yīng)，并促進SARA的發(fā)生[6]。內(nèi)毒素對奶牛的危害很大，進入體內(nèi)的內(nèi)毒素可以導(dǎo)致奶牛發(fā)生一系列炎癥反應(yīng)。目前，內(nèi)毒素在奶牛體內(nèi)的遷移位點還不清楚，有待研究，相關(guān)研究將有望通過阻斷內(nèi)毒素的遷移來減少炎癥的發(fā)生。

1　奶牛內(nèi)毒素的產(chǎn)生及影響機制

1.1奶牛內(nèi)毒素的產(chǎn)生

目前我國大部分奶牛場選用玉米青貯和苜蓿作為奶牛粗料，為了滿足奶牛營養(yǎng)需要和高產(chǎn)奶量，普遍給奶牛飼喂高精料飼糧。高精低粗的飼糧結(jié)構(gòu)可引發(fā)瘤胃代謝異常[7-8]。大量精料被奶牛采食進入瘤胃后，豐富的碳水化合物發(fā)酵，進一步產(chǎn)生大量VFA和有機酸，引起奶牛瘤胃液pH降低。當pH下降至5.2～5.6并持續(xù)3～5 h/d，即發(fā)生SARA。同時VFA在酸性環(huán)境下的吸收率降低，若pH繼續(xù)下降并低于5.2時，奶牛產(chǎn)生更為嚴重的急性瘤胃酸中毒(ARA)[9-10]。而在發(fā)生瘤胃酸中毒后，瘤胃內(nèi)會產(chǎn)生大量的異常代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物中就包括內(nèi)毒素、乳酸、組胺、色胺和乙醇等[11-12]。瘤胃內(nèi)內(nèi)毒素的釋放可以解釋為是由高精料飼糧導(dǎo)致瘤胃液pH降低，引發(fā)革蘭氏陰性菌死亡造成的[13-14]。試驗表明，無論是瘤胃液體外培養(yǎng)還是給奶牛直接飼喂飼糧，高精料飼糧始終導(dǎo)致瘤胃液中內(nèi)毒素含量處在高水平，飼糧精粗比與內(nèi)毒素含量呈線性升高趨勢[4-5,11,15-18]。所以，奶牛產(chǎn)生內(nèi)毒素的原因是飼喂含大量碳水化合物的飼糧后，瘤胃微生物發(fā)酵產(chǎn)生大量VFA導(dǎo)致pH下降，結(jié)果引發(fā)SARA釋放大量內(nèi)毒素。

1.2內(nèi)毒素對奶牛的影響機制

內(nèi)毒素的生物學(xué)作用并不由本身引起，而是通過血液循環(huán)進入機體后，誘導(dǎo)淋巴細胞、巨噬細胞等多種組織細胞，使其釋放大量炎癥介質(zhì)[白細胞介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)、凝血因子等)作用于機體，產(chǎn)生一系列反應(yīng)。研究表明，在奶牛酸中毒后，產(chǎn)生的異常代謝產(chǎn)物內(nèi)毒素首先進入血液，通過循環(huán)系統(tǒng)進入肝臟，肝臟的Kupfer細胞可以清除部分的內(nèi)毒素[19-20]。然而當內(nèi)毒素大量進入血液時，肝臟對其不能完全清除，進一步誘發(fā)奶牛發(fā)生免疫反應(yīng)[21]。其在體內(nèi)的具體機制是內(nèi)毒素先與內(nèi)毒素結(jié)合蛋白(LBP)結(jié)合在一起，形成內(nèi)毒素-LBP復(fù)合物。然后，內(nèi)毒素-LBP復(fù)合物轉(zhuǎn)移至細胞表面的CD14受體，CD14介導(dǎo)單核細胞、巨噬細胞等識別內(nèi)毒素，結(jié)合形成內(nèi)毒素-LBP-CD14復(fù)合體[20,22]。三者的復(fù)合體與之相應(yīng)的受體Toll樣受體4(TLR4)結(jié)合，然后激活核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)，介導(dǎo)大量促炎性細胞因子的基因表達，使炎性細胞因子(IL-l、IL-6和TNF-α等)被釋放，致使機體產(chǎn)生一系列的病理性反應(yīng)[23-25]。

2　內(nèi)毒素對奶牛采食量、血液指標和乳成分的影響

2.1干物質(zhì)采食量(DMI)

研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素造成的炎癥反應(yīng)既可使奶牛DMI降低，還進一步導(dǎo)致奶牛體重下降。Krajcarski-Hunt等[26]研究表明，健康奶牛對全混合日糧(TMR)的采食量比患SARA的奶牛高25%。Porter等[27]和Oetzel[28]研究證實，進入血液的內(nèi)毒素引發(fā)機體免疫反應(yīng)，刺激單核/巨噬細胞系統(tǒng)，釋放TNF-α、花生四烯酸代謝產(chǎn)物、組胺等炎性細胞因子，阻礙機體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，引起奶牛消化功能紊亂，不僅導(dǎo)致奶牛采食量下降，而且迫使機體大量利用體脂和糖原，二者結(jié)合使奶牛發(fā)生能量負平衡。能量負平衡可引發(fā)奶牛的消瘦病，奶牛的體重也會不斷下降[29]。

2.2血液中蛋白質(zhì)和氨基酸

奶牛飼喂高精料飼糧發(fā)生SARA時，瘤胃液中內(nèi)毒素含量升高，產(chǎn)生的內(nèi)毒素可轉(zhuǎn)運至血液中。因此，SARA可使外周血液中的內(nèi)毒素含量顯著升高[4-5,15]。奶牛血液中內(nèi)毒素含量隨飼糧中精料所占的百分比而升高[30]。

在血液蛋白質(zhì)方面，許多研究表明，瘤胃酸中毒可引起血液中急性期蛋白如C-反應(yīng)蛋白(CRP)、結(jié)合珠蛋白(Hp)、LBP、血清淀粉樣蛋白A(SAA)的含量上升[15-16,31]。值得一提的是，內(nèi)毒素誘發(fā)機體產(chǎn)生急性期反應(yīng)后，血液鈣能夠穩(wěn)定急性期反應(yīng)所表達的急性期蛋白結(jié)構(gòu)，最突出的是穩(wěn)定SAA的結(jié)構(gòu)。同時血液鈣促進SAA積聚在組織器官上，消除血液中一部分內(nèi)毒素[17,32-33]。Zebeli等[13]研究表明，乳脂的產(chǎn)量與CRP含量呈負相關(guān)；而瘤胃液中內(nèi)毒素含量與CRP含量呈正相關(guān)[17]。有研究者認為，這與CRP直接參與脂質(zhì)和脂蛋白的代謝有關(guān)，而且有劑量效應(yīng)[34]。

在血液氨基酸方面，內(nèi)毒素的釋放使血液中的天冬酰氨(Asn)、谷氨酸(Glu)、色氨酸(Trp)、蛋氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、絲氨酸(Ser)、賴氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、蘇氨酸(Thr)和纈氨酸(Val)的含量下降，而半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asp)和組氨酸(His)的含量基本不變[35-36]。Gln是第一限制性氨基酸，對燒傷小鼠的研究表明，當小鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)激后會減少能量的攝入，導(dǎo)致分解機體自身組織，Gln含量因此降低[37]，但在奶牛方面還沒有報道。動物產(chǎn)生免疫反應(yīng)后血液中的氨基酸要先用于合成急性期蛋白，由于急性期蛋白含有較多的Trp、Phe、Lys、Ser和Cys[38]，從而導(dǎo)致這幾種氨基酸含量下降，而Ile、Leu和Val含量的下降可能是由于它們影響能量的產(chǎn)生與抗體的生成[39]。由于Thr是免疫球蛋白的組成成分，所以可能導(dǎo)致了Thr含量的下降[40]。綜上，內(nèi)毒素誘發(fā)奶牛產(chǎn)生免疫應(yīng)激，導(dǎo)致奶牛血液中急性期蛋白含量上升和部分氨基酸含量下降。由于奶牛發(fā)生SARA后內(nèi)毒素對血液中氨基酸含量的變化規(guī)律研究很少，對于內(nèi)毒素影響氨基酸的機制屬于空白領(lǐng)域，有待進一步研究。

2.3乳脂和乳蛋白

內(nèi)毒素進入機體后引起的免疫反應(yīng)可導(dǎo)致營養(yǎng)素進行重新分配，使營養(yǎng)素更多用于免疫反應(yīng)，從而減少進入乳腺的營養(yǎng)素，因此干擾了乳腺中乳成分的合成[41]。Zebeli等[13]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素含量的升高導(dǎo)致乳脂率和乳脂產(chǎn)量均下降。Waldron等[42]證實內(nèi)毒素誘導(dǎo)產(chǎn)生的促炎因子引發(fā)嗜中性粒細胞和巨噬細胞的溶酶體破裂，導(dǎo)致體細胞蛋白酶的釋放，造成了乳中的酪蛋白被降解。原利榮[43]研究表明，不同含量的內(nèi)毒素均極顯著降低奶牛乳腺組織中乳脂合成相關(guān)基因[乙酰輔酶A羧化酶-α(ACACA)、脂肪酸合成酶(FASN)和長鏈酯酰輔酶A合成酶3(ACSL3)]的表達量。當內(nèi)毒素含量達到10 ng/mL后，乳腺組織中酪蛋白合成量極顯著降低，并且內(nèi)毒素極顯著降低了奶牛乳腺組織中乳蛋白基因[αS1-酪蛋白(CSN1S1)、β-酪蛋白(CSN2)]的表達量。一方面，乳脂的降低是由于內(nèi)毒素能刺激肝臟產(chǎn)生促炎因子如IL-1、IL-6和TNF-α，這些促炎因子反過來激活肝功能受體，通過TLR4和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶激酶1/2(MEK1/2)-細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)路徑刺激脂肪細胞加速脂質(zhì)的水解，降低乳脂的合成[24,44]。另一方面，內(nèi)毒素影響蛋白質(zhì)合成通路哺乳動物雷帕霉素靶點(mTOR)和Janus激酶2/轉(zhuǎn)錄激活因子5(JAK2/STAT5)通路，干擾了乳蛋白合成所需的氨基酸，降低了乳蛋白率[45]。奶牛發(fā)生SARA后，內(nèi)毒素促進脂解作用和影響蛋白質(zhì)通路的機制目前雖未解釋清楚，但研究結(jié)果表明內(nèi)毒素增加了機體的脂類代謝，以抵抗內(nèi)毒素對奶牛引起的炎癥反應(yīng)，其結(jié)果導(dǎo)致乳脂率和乳蛋白率均降低。

3　奶牛內(nèi)毒素的防控技術(shù)

3.1乳酸處理飼料

由于高精料飼糧引起的SARA導(dǎo)致革蘭氏陰性菌的崩解而釋放大量內(nèi)毒素，所以主要手段是調(diào)控奶牛瘤胃液pH，減少SARA的發(fā)生。有研究表明，乳酸處理法既安全又便宜，乳酸能夠改變淀粉的結(jié)構(gòu)使其在瘤胃不易消化，用乳酸浸濕過的玉米飼喂奶牛后，縮短了瘤胃液pH低于5.8的時間，有效防止了SARA的產(chǎn)生[46-47]。此處理方法是在精料中加入同體積的水，再用0.5%～1.0%的乳酸浸泡一段時間，也可以在溫度為55 ℃時熱處理48 h，之后配成TMR飼喂奶牛。該方法使谷物在瘤胃中的發(fā)酵速率減緩，增加過瘤胃淀粉的含量，因此可降低瘤胃液VFA含量，維持瘤胃液pH在較高水平。革蘭氏陰性菌在瘤胃液高水平的pH下保持相對穩(wěn)定，最終瘤胃產(chǎn)生的內(nèi)毒素減少。此外，高水平的pH促進了瘤胃壁對LPS的屏障作用。該研究也指出長期用乳酸浸泡的谷物飼喂奶牛無不利影響。而且用乳酸處理過的飼料，精料含量即使達到干物質(zhì)的45%也不會誘發(fā)SARA，與之相反，奶牛乳脂率、產(chǎn)奶量、利用年限等都將得到提升。

3.2飼糧含有充足的物理有效中性洗滌纖維(peNDF)

Mertens[48]將peNDF定義為：飼糧中能夠促進瘤胃液相和固相分層并影響反芻動物咀嚼的中性洗滌纖維(NDF)。史仁煌等[49]研究證實，peNDF影響反芻動物咀嚼和瘤胃緩沖，是穩(wěn)定瘤胃液pH的重要因素。Caccamo等[50]和郭勇慶等[51]研究指出，降低飼糧粗料比例或減少粗料長度可以減少peNDF，低peNDF可使唾液分泌量和瘤胃中和能力下降，減少反芻時間，最終使瘤胃液pH下降，增加了SARA發(fā)生的概率。為保證飼糧peNDF的需求，按照NRC(2001)[52]奶牛飼糧中至少應(yīng)含25%NDF，其中飼草所含NDF占75%。Mertens[48]指出泌乳奶牛飼糧peNDF應(yīng)大于15%。Hall等[53]試驗表明，以干物質(zhì)為基礎(chǔ)，當?shù)矸邸每扇苄岳w維∶糖類為40∶20∶1時，飼喂效果最好。所以，奶牛應(yīng)采用TMR飼喂，以保證飼糧中的peNDF水平，充足的peNDF有利于瘤胃液pH的穩(wěn)定，進而減少了SARA的發(fā)生，最終影響內(nèi)毒素的釋放。

3.3其他相關(guān)研究進展

Van Vugt等[54]研究表明，莫能菌素通過影響乳酸和VFA含量改變瘤胃液pH，控制瘤胃發(fā)酵，并且在動物體內(nèi)殘留量少，安全性比較高。精料中添加30 mg/kg莫能菌素可降低SARA的發(fā)生。但韓金濤[55]研究指出，莫能菌素在降低乳酸產(chǎn)生菌活性的同時降低了乙酸與丁酸的比例，因此減少了乳腺合成脂肪酸的前體物質(zhì)，所以莫能菌素也會影響乳脂率。McLaughlin等[56]和Speight等[57]研究指出，添加阿卡波糖可降低VFA含量，有效降低瘤胃中的乳酸含量，提高瘤胃液pH。Blanch等[58]研究表明，奶牛飼糧中添加0.75 g/d的阿卡波糖能有效地減少瘤胃液pH<5.6的持續(xù)時間。王立志[59]試驗表明，每千克干物質(zhì)飼糧補飼4 g酵母培養(yǎng)物和0.3 g酵母硒能顯著增加奶牛產(chǎn)奶量和乳蛋白率，同時降低血液中內(nèi)毒素含量。Gln是一種高效抗氧化劑，其代謝產(chǎn)物谷胱甘肽發(fā)揮抗氧化作用。谷胱甘肽能阻止炎性介質(zhì)進入機體細胞，同時減少內(nèi)毒素，提高機體免疫力[60]。幼鼠腹腔注射Gln試驗表明，Gln可阻礙內(nèi)毒素-LBP與CD14形成復(fù)合物，使NF-κB不被激活，進而阻止TLR與內(nèi)毒素結(jié)合，抑制炎癥介質(zhì)的合成與釋放，使腸黏膜免受損傷[61]，但在減少奶牛內(nèi)毒素方面還未見報道。以上研究雖然在控制內(nèi)毒素方面做出了努力，但目前沒有一種很實用且有效的方法去規(guī)避內(nèi)毒素的釋放，有待于進一步探究。

4　小　結(jié)

綜上所述，內(nèi)毒素導(dǎo)致奶牛采食量、體重下降，產(chǎn)奶量和乳蛋白率、乳脂率降低。內(nèi)毒素與奶牛SARA息息相關(guān)，雖然關(guān)于奶牛酸中毒與SARA產(chǎn)生內(nèi)毒素的文獻報道為數(shù)不多，但該病卻普遍存在并對奶牛業(yè)帶來巨大損失。從防控奶牛體內(nèi)內(nèi)毒素的方法可知，雖然用乳酸處理飼料試驗結(jié)果很有效，但還缺乏大量的試驗數(shù)據(jù)去支撐。因此，有必要研究內(nèi)毒素的致病機理和信號通路，從源頭上規(guī)避內(nèi)毒素的產(chǎn)生，為解決內(nèi)毒素引起的一系列病理生理等炎癥反應(yīng)提供依據(jù)。

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*Corresponding author, associate professor, E-mail: peiqin41-@163.com

(責(zé)任編輯王智航)

Endotoxin in Dairy Cattle: Production， Effects and Control Technology

WANG Kaijun1,2TAN Zhiliang2ZHANG Peihua1*HAN Qipeng1,2

(1. Hunan Provincial Key Laboratory for Genetic Improvement of Domestic Animal, College of Animal Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128 ,China 2. Institute of Subtropical Agriculture, Key Laboratory of Agro-Ecological Processes in Subtropical Region, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125,China)

Endotoxin, also known as lipopolysaccharide, is produced when the gram-negative bacteria are dead or multiply rapidly. It commonly exists in ruminants and results in immunological stress when overdose. This article elaborated the production and action mechanism of endotoxin in dairy cattle, the effects on feed intake, proteins and amino acids in blood, milk protein and milk fat, and the ways to decrease endotoxin in dairy cattle, which will give help for decreasing endotoxin in dairy cattle production.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(9)：2695-2701]

endotoxin; mechanism; dairy cattle; ruminal acidosis; control technology

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.09.005

2016-03-21

國家自然科學(xué)基金面上項目(31372342)；國家科技支撐計劃課題(2012BAD14B17)；中國科學(xué)院科技服務(wù)網(wǎng)絡(luò)計劃(STS計劃)課題(KFJ-EW-STS-071)

王凱軍(1992—)，男，甘肅天水人，碩士研究生，從事動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)研究。E-mail: kj-wang@foxmail.com

張佩華，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail: peiqin41-@163.com

S823

A

1006-267X(2016)09-2695-07