侯麗雯　焦婷　謝明

上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院口腔修復科，上海市口腔醫(yī)學重點實驗室　上海 200011

血管內(nèi)皮生長因子與牙發(fā)生發(fā)育的關系

侯麗雯焦婷謝明

上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院口腔修復科，上海市口腔醫(yī)學重點實驗室上海 200011

血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）不僅在促進血管內(nèi)皮細胞分裂與增殖、胚胎發(fā)生發(fā)育、創(chuàng)傷愈合中發(fā)揮著重要的作用，而且在骨的生成與改建過程中，成骨細胞來源的VEGF作用于破骨細胞分化使破骨細胞發(fā)生趨化，使局部破骨細胞數(shù)目增加并促進局部骨吸收。上皮組織與外胚間葉組織的互相作用貫穿于牙胚發(fā)生發(fā)育到牙體組織形成的整個過程，內(nèi)外釉上皮細胞與牙乳頭細胞分泌的VEGF及其受體互相作用，促進成釉細胞與成牙本質(zhì)細胞的分化成熟，影響釉質(zhì)與牙本質(zhì)的形成。許多與牙發(fā)生相關的基因表達于牙胚中央的釉結中，這些基因涉及的信號轉導通路也參與牙的發(fā)生。VEGF基因表達受到無翅型小鼠乳房腫瘤病毒整合位點家族/β-連環(huán)蛋白信號轉導通路的調(diào)控。目前，有關VEGF和VEGFR在牙胚發(fā)生發(fā)育中的認識僅僅停留在表觀層面，對于功能及調(diào)控機制有待深入的研究。

血管內(nèi)皮生長因子；牙發(fā)生；骨生成

［Abstract］Vascular endothelial growth factor（VEGF） is not only involved in promoting vascular endothelial cell division and proliferation but also plays an important role in development，wound healing and bone formation and remodeling. Osteoblasts derived from VEGF are differentiated from osteoclasts through chemotaxis，resulting in increased number of local osteoclasts and enhanced local bone absorption. The interaction between epithelial and ecto mesenchymal tissues through the development of tooth germ occurs during dentin formation. The inner and outer enamel epithelia and dental papilla cells secrete VEGF and interact with its receptor，thereby promoting ameloblasts into odontoblast differentiation and maturation and influencing the formation of dentin and enamel. Genes involved in tooth occurrence are expressed in the enamel knot at the center of the tooth germ. Moreover，the signal transduction pathways associated with these genes are involved in tooth occurrence. VEGF gene expression is regulated by wingless-type mice mammary tumor virus integration site family/β-chain protein signal transduction pathway. Currently，the roles of VEGF and VEGFR in the development of tooth germ are only elucidated at the superficial level，and their functions and regulatory mechanism must be further investigated.

［Key words］vascular endothelial growth factor；odontogenesis；osteogenesis

血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）起初是從牛垂體濾泡星狀細胞的體外培養(yǎng)液中純化提取的一種特異性作用于血管內(nèi)皮細胞的糖蛋白，可促進血管內(nèi)皮細胞的有絲分裂和遷移，從而促進血管形成［1］。VEGF是由二硫鍵連接而成的同源二聚體糖蛋白，是一種多功能的細胞因子，等電點為8.5，對熱和酸穩(wěn)定，對血管內(nèi)皮細胞具有特異性的肝素結合能力。VEGF屬于血小板衍生生長因子家族成員之一，可由內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞以及一些間質(zhì)細胞分泌?，F(xiàn)有VEGF家族成員包括VEGFA～E以及胎盤生長因子6個亞型。血管內(nèi)皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）家族有VEGFR1～3，分別由fms樣酪氨酸激酶受體（fms-like tyrosine receptor，F(xiàn)LT）1、胎肝激酶（etal liver kinase，F(xiàn)LK）1-激酶結構域插入?yún)^(qū)（kinase domain region，KDR）和FLT4基因編碼［2］。每個VEGF亞型特異性地與VEGFR的特定組合結合。VEGFA在組織和細胞中質(zhì)量最豐富，故多數(shù)文獻中的VEGF即指VEGFA。

1　VEGF

VEGF在促進血管內(nèi)皮細胞分裂與增殖、胚胎發(fā)生發(fā)育、創(chuàng)傷愈合中發(fā)揮著重要的作用，其在骨的生成與改建中的研究取得了一定的成果。

Liu等［3］僅在小鼠的成骨細胞譜系細胞中敲除Vegf基因，小鼠表現(xiàn)出骨量減少與骨髓脂肪增加的現(xiàn)象，這不禁使人產(chǎn)生VEGF或VEGF信號轉導通路能否用于靶向治療骨質(zhì)疏松癥的疑問。進一步的研究顯示，VEGF通過作用于破骨細胞上的VEGFR，由胞內(nèi)分泌和旁分泌作用調(diào)節(jié)骨的動態(tài)平衡。VEGF刺激成骨細胞分化并通過胞內(nèi)分泌功能抑制脂肪細胞分化。成骨細胞來源的VEGF發(fā)揮旁分泌作用于破骨細胞使破骨細胞發(fā)生趨化，可以使局部破骨細胞數(shù)目增加，從而促進局部骨吸收［4］。圍絕經(jīng)期后婦女產(chǎn)生的VEGF的多少被報道可能與腰椎骨礦物質(zhì)密度的高低相關，但是沒有確切的證據(jù)表明外周循環(huán)中的VEGF的質(zhì)量濃度與骨礦物質(zhì)密度有明顯的關聯(lián)。對于這一現(xiàn)象Costa等［5］以為，可能與VEGF僅通過胞內(nèi)分泌的機制刺激成骨細胞分化及抑制脂肪細胞分化有關，并非通過旁分泌途徑。

VEGF除了作用于血管內(nèi)皮細胞和成骨生成及改建的相關細胞外，還在其他類型的細胞中發(fā)揮作用。譬如VEGFA可以刺激單核細胞和巨噬細胞的移動趨化［6］，VEGFC參與大鼠前腦的視網(wǎng)膜神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生及功能運作［7］，VEGFC和VEGFD也共同參與支氣管周圍的淋巴系統(tǒng)的發(fā)生發(fā)育［8］。VEGFR主要在內(nèi)皮細胞中表達，除VEGFR3分布于淋巴內(nèi)皮細胞外，VEGFR1和VEGFR2主要在血管內(nèi)皮細胞中表達。VEGFR1可以在腎小球系膜細胞、單核細胞和滋養(yǎng)層細胞中表達，VEGFR2可以在造血干細胞、巨噬細胞和視網(wǎng)膜前體細胞中表達［9］。

2　VEGF在牙發(fā)生發(fā)育過程中的表達及作用機制

近年來，通過實時定量熒光聚合酶鏈反應和免疫組織化學染色等技術，VEGFA、C、D，VEGFR2、VEGFR3已陸續(xù)在小鼠和人的牙胚發(fā)生中被檢出。譬如Vegf mRNA及其上游調(diào)控因子蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）1和Pkc2 mRNA共同表達，經(jīng)時性地上調(diào)于大鼠帽狀期和鐘狀期的牙胚內(nèi)釉上皮之中［10］。VEGFC、D和VEGFR3蛋白表達于小鼠胎齡14 d（蕾狀期）和17 d（鐘狀期）的牙源性上皮細胞、外胚間葉細胞、內(nèi)釉上皮細胞和牙乳頭細胞中［11］。在鎖骨顱骨發(fā)生不全綜合征患者（核心結合因子-α1基因缺失）的牙髓細胞中，VEGFA mRNA、VEGFB mRNA、VEGFC mRNA的表達較健康人牙髓細胞中的VEGFA mRNA、VEGFB mRNA、VEGFC mRNA表達要高［12］。

上皮組織與外胚間葉組織的互相作用貫穿于牙胚發(fā)生發(fā)育到牙體組織形成的整個過程，內(nèi)外釉上皮細胞與牙乳頭細胞分泌的細胞因子互相作用，促進成釉細胞與成牙本質(zhì)細胞的分化成熟。VEGFA在上皮-外胚間質(zhì)相互作用的細胞之間，作為信號轉導因子發(fā)揮重要的作用［13］。在人的乳牙胚成釉細胞、星網(wǎng)狀層細胞、成牙本質(zhì)細胞以及基底側的成牙本質(zhì)細胞突之中存在著VEGFA和VEGFR2蛋白，Miwa等［14］推測VEGF從血管被分泌到牙乳頭上皮-外胚間葉組織交界（基膜）的細胞基質(zhì)中，主要以VEGF-纖連蛋白復合物的形式儲存于基膜的細胞外基質(zhì)，通過基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）剪接，被釋放的VEGF作用于釉質(zhì)上皮細胞、成釉細胞和成牙本質(zhì)細胞表面的VEGFR2，進而影響釉質(zhì)與牙本質(zhì)的形成。

在釉質(zhì)和牙本質(zhì)基質(zhì)的形成過程中，成釉細胞和成牙本質(zhì)細胞不僅受牙胚中生長因子的調(diào)節(jié)，還受到全身激素，如生長激素和褪黑激素的作用［15］。在鐘狀期的牙乳頭上1/3部分，成釉細胞和成牙本質(zhì)細胞附近存在著較多的CD31和CD34陽性血管內(nèi)皮細胞［16］。這些發(fā)現(xiàn)強烈表明，成釉細胞、成牙本質(zhì)細胞和牙乳頭細胞分泌的VEGFA可在牙體組織形成階段誘導血管生成，以便獲得更多養(yǎng)分和接收來自外周血的信號分子。

有學者在對大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，VEGF表達于大鼠牙囊細胞，其表達水平與大鼠牙胚萌出過程中破骨細胞形成的二次高峰期密切相關，即VEGF可能是參與牙萌出調(diào)控的重要的細胞因子。也有學者發(fā)現(xiàn)，VEGF mRNA可表達于體外培養(yǎng)的人牙囊細胞，牙囊細胞內(nèi)有VEGF蛋白的表達。他們在牙囊細胞培養(yǎng)上清液中也檢測到了VEGF蛋白。這些證據(jù)表明，體外培養(yǎng)的人牙囊細胞可合成和分泌VEGF，考慮到上述VEGF在骨改建中的作用，提示VEGF在人牙萌出過程中可能發(fā)揮重要的作用。Janebodin等［17］經(jīng)過一系列的研究后發(fā)現(xiàn)，牙髓干細胞具有血管內(nèi)皮周細胞的特性，可誘導血管形成。此外，牙髓干細胞誘導血管生成的能力具有VEGFR2依賴性，牙髓干細胞通過分泌VEGF配體與血管周細胞相關聯(lián)，增強血管生成。

3　VEGF與牙發(fā)生相關的信號轉導通路

許多與胚胎發(fā)生相關的基因在牙胚中央的釉結中都有表達，這些基因涉及的信號轉導通路也參與牙的發(fā)生，例如轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）β1～3，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）2、4、6、7，成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）4，無翅型小鼠乳房腫瘤病毒整合位點家族（wingless-type mice mammary tumour virus integration site family，WNT）/β-連環(huán)蛋白信號轉導通路等。楊海兵等［18］構建重組質(zhì)粒pcDNA3.1 hisA-VEGF165，經(jīng)酶切及測序驗證正確后，將其和pcDNA3.1 hisATGFβ1轉染人根尖乳頭細胞，采用實時定量熒光聚合酶鏈反應檢測轉染效率和骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）、牙本質(zhì)涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）、骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白（dentin matrix protein，DMP）1的表達。結果顯示，VEGF165和TGFβ1可促進人根尖乳頭細胞DSPP和OCN mRNA的表達，抑制DMP1 mRNA的表達，對BSP mRNA的表達沒有明顯影響，而且VEGF165和TGFβ1間并未無明顯的協(xié)同作用。他們分析后推測，這可能與VEGF165和TGFβ1的轉染效率有關，過高或過低的轉染率均不利于以上因子的表達，兩者間的協(xié)同作用可能在VEGF165和TGFβ1適量表達時才存在。

BMP2、4通過刺激同源盒轉錄因子來調(diào)節(jié)牙的發(fā)生發(fā)育。VEGF可以通過誘導牙髓成纖維細胞產(chǎn)生的堿性成纖維細胞生長因子來刺激牙髓細胞增殖。在胚胎大鼠顱骨破骨細胞的原代培養(yǎng)中，BMP2可將破骨細胞中的Vegf mRNA表達提高，而且兩者之間存在著時限和劑量依賴性關系。

在FGF的信號轉導通路中，F(xiàn)GF與細胞膜表面的酪氨酸激酶型受體FGFR結合并發(fā)生二聚化，從而激活酪氨酸激酶，在激活含SH2結構的蛋白質(zhì)/ Frs-Raf/促絲裂原激活蛋白激酶激酶激酶-促絲裂原激活蛋白激酶激酶-促絲裂原激活蛋白激酶信號轉導通路的基礎上，通過大量釋放PKC、磷脂酶C、磷脂酰肌醇-3-激酶系統(tǒng)和Ca2+，向細胞內(nèi)轉導信號。PKC是VEGF mRNA的上游調(diào)控子，由此可以認為FGF可間接地促進VEGF的表達。

WNT/β-連環(huán)蛋白信號轉導通路是牙發(fā)生過程中誘導釉結形成、上皮間質(zhì)相互作用的信號轉導通路之一［19］。當WNT信號激活后，β-連環(huán)蛋白的磷酸化受影響。非磷酸化的β-連環(huán)蛋白不能被蛋白酶體降解，從而導致β-連環(huán)蛋白在細胞質(zhì)內(nèi)積聚并移向核內(nèi)；當游離的β-連環(huán)蛋白進入細胞核內(nèi)，即與T細胞因子（T cell factor，TCF）/淋巴細胞樣增強因子結合，激活TCF轉錄活性，調(diào)節(jié)靶基因的表達。在VEGF基因啟動子上游805 bp位點有TCF4結合元件，VEGF基因表達受到WNT/β-連環(huán)蛋白信號轉導通路的調(diào)控。有學者［20］利用siRNA靶向沉默β-連環(huán)蛋白以阻斷WNT/β-連環(huán)蛋白信號轉導，明顯地抑制了子宮內(nèi)膜異位癥裸鼠模型異位子宮內(nèi)膜中VEGF和MMP9的表達。

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（本文采編王晴）

Relationship between vascular endothelial growth factor and tooth occurrence development

Hou Liwen，Jiao Ting，Xie Ming. （Dept. of Oral Prosthodontics，The Ninth People's Hospital，School of Medicine，Shanghai Jiao Tong University；Shanghai Key Laboratory of Stomatology，Shanghai 200011，China）

Q 51

A

10.7518/gjkq.2016.05.024

2015-12-12；［修回日期］2016-06-03

侯麗雯，學士，Email：wendy_0606@163.com

焦婷，副主任醫(yī)師，博士，Email：jiao_ting@126.com