劉睿華（湖北省恩施州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖北 恩施 445000）

血凝和血凝抑制試驗(yàn)的影響因素分析

劉睿華
（湖北省恩施州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖北 恩施 445000）

血凝和血凝抑制試驗(yàn)在疫病防控中應(yīng)用非常廣泛，但影響試驗(yàn)結(jié)果的因素較多。針對(duì)試驗(yàn)中緩沖液、紅細(xì)胞、抗原、樣品、溫度和時(shí)間、試驗(yàn)器材和耗材、結(jié)果判定等因素對(duì)試驗(yàn)的影響進(jìn)行了分析。

血凝血凝抑制影響因素分析

某些病毒能夠與哺乳類或禽類的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，利用這一特性可以檢測(cè)樣品中是否有病毒存在，或測(cè)定病毒的效價(jià)，即血凝試驗(yàn)。這種紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象可被特異性抗體所抑制，即血凝抑制試驗(yàn)。這兩種方法可用于病毒鑒定、病毒性疾病的診斷、動(dòng)物群體性疫情的監(jiān)測(cè)、抗體效價(jià)的監(jiān)測(cè)以及病毒抗原變異的監(jiān)測(cè)。HA-HI試驗(yàn)具有可比較性和可重復(fù)性、特異性好、操作方便、對(duì)試驗(yàn)環(huán)境要求不高等優(yōu)點(diǎn)，但試驗(yàn)中也收到很多因素影響，其中一些因素甚至能嚴(yán)重影響試驗(yàn)結(jié)果?，F(xiàn)總結(jié)一些經(jīng)驗(yàn)，供大家參考。

1　PBS緩沖液

PBS緩沖液在配制紅細(xì)胞懸液、抗原、試驗(yàn)過程中都需要用到，并且應(yīng)保持一致性。PBS緩沖液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，并將pH值調(diào)到7.2，如果配制時(shí)間過長(zhǎng)，pH值會(huì)發(fā)生變化，影響試驗(yàn)結(jié)果。

2　紅細(xì)胞

2.1來源

配置紅細(xì)胞最好選用成年SPF公禽，但大多地區(qū)很難購(gòu)買，也可選用非免疫健康公禽。如果僅采集一只禽制作紅細(xì)胞，可能產(chǎn)生自凝現(xiàn)象，因此應(yīng)至少采集3～4只禽血液混合后制作。紅細(xì)胞的采集最好選用與待檢血清同種禽類，否則會(huì)出現(xiàn)非特異性凝集現(xiàn)象，有時(shí)會(huì)嚴(yán)重影響結(jié)果判定。

2.2配制

2.2.1濃度血凝和血凝抑制試驗(yàn)一般配制1%濃度紅細(xì)胞懸液。不同濃度的紅細(xì)胞對(duì)效價(jià)有一定影響，當(dāng)紅細(xì)胞濃度過高，沉降的血點(diǎn)過大，測(cè)出的血凝效價(jià)可能偏低，血凝抑制效價(jià)可能偏高；當(dāng)紅細(xì)胞濃度過低，沉降的血點(diǎn)過低，且沉降速度較慢，測(cè)出的血凝效價(jià)可能偏高，血凝抑制效價(jià)可能偏低。

2.2.2溶血采血時(shí)過度搖晃容器或離心紅細(xì)胞時(shí)速度過快、時(shí)間過長(zhǎng)，容易導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂，紅細(xì)胞懸液濃度變低，影響試驗(yàn)結(jié)果的觀察。

2.3保存

配制好的紅細(xì)胞懸液應(yīng)保存于2～8℃，且不超過2 d，以免保存時(shí)間過長(zhǎng)或受細(xì)菌污染均可發(fā)生自凝，影響試驗(yàn)結(jié)果。

3　抗原

3.1配制

抗原的配置濃度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響很大。如果抗原濃度降低，測(cè)得的抗體效價(jià)增大；抗原濃度升高，測(cè)得的抗體效價(jià)減小。因此在測(cè)樣品效價(jià)之前應(yīng)對(duì)配制好的抗原進(jìn)行滴定試驗(yàn)，如果抗原濃度不準(zhǔn)確，應(yīng)進(jìn)行校正。

3.2保存

抗原應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，配制好的抗原應(yīng)保存于2～8℃，且不超過2 d，也可-70℃保存，隨用隨取，切忌反復(fù)凍融，否則抗原效價(jià)會(huì)降低。

4　樣品

被檢樣品要求新鮮、透明、無雜質(zhì)、無溶血、不腐敗。當(dāng)血清被細(xì)菌嚴(yán)重污染或腐敗后，血清會(huì)變渾濁，變質(zhì)的血清會(huì)發(fā)生凝集反應(yīng)，使含較高抗體的血清在血凝抑制試驗(yàn)中出現(xiàn)前幾孔凝集［1］，而后幾孔凝集被抑制的現(xiàn)象。

5　溫度和時(shí)間

試驗(yàn)要求反應(yīng)溫度在20～25℃，溫度低反應(yīng)時(shí)間變長(zhǎng)，出現(xiàn)結(jié)果變慢；溫度高反應(yīng)時(shí)間變短，出現(xiàn)結(jié)果變快?？乖贵w反應(yīng)時(shí)，如果溫度在20～25℃，必須反應(yīng)30 min以上。加入紅細(xì)胞反應(yīng)時(shí)，溫度低于4℃，紅細(xì)胞易發(fā)生自凝；高于37℃，凝集的紅細(xì)胞易洗脫。當(dāng)溫度為4℃時(shí)，反應(yīng)時(shí)間25 min為最佳讀取結(jié)果時(shí)間；25℃時(shí)，反應(yīng)時(shí)間20 min為最佳讀取結(jié)果時(shí)間；37℃時(shí)，反應(yīng)時(shí)間15 min為最佳讀取結(jié)果時(shí)間。試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)后，應(yīng)及時(shí)讀取結(jié)果。如不及時(shí)讀取，則紅細(xì)胞開始解凝，溫度越高，解凝越快。4℃反應(yīng)50 min開始解凝，25℃反應(yīng)40 min開始解凝，37℃反應(yīng)30 min開始解凝。

6　試驗(yàn)器材和耗材

6.1反應(yīng)板

反應(yīng)板有U型和V型兩種，V型有90°和120°兩種。一般選擇96孔90°V型反應(yīng)板進(jìn)行HA-HI試驗(yàn)。使用一次性反應(yīng)板可以避免使用有機(jī)反應(yīng)板因清洗不凈或過度磨損而影響結(jié)果。使用有機(jī)反應(yīng)板需在每次試驗(yàn)完畢后立即將反應(yīng)板用自來水反復(fù)沖洗，放到2%～3%的鹽酸溶液中浸泡24 h以上，撈出用自來水反復(fù)沖洗，甩干，再用蒸餾水反復(fù)沖洗，甩凈蒸餾水放入37℃干燥箱中烘干備用。底部磨損嚴(yán)重的反應(yīng)板應(yīng)及時(shí)淘汰。

6.2移液器

移液器首先要經(jīng)過檢定計(jì)量準(zhǔn)確。如果移液器移取的液體量、吸取的液體量或排出的液體量不準(zhǔn)確必然會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。因此在使用微量移液器前，要檢查所用移液器量程是否與要移加的液體量相匹配，刻度是否準(zhǔn)確，吸頭是否牢固，操作時(shí)要做到慢吸快放。

6.3恒溫培養(yǎng)箱

能精確保持設(shè)定溫度。

7　結(jié)果判定

試驗(yàn)成功與否根據(jù)陰陽性對(duì)照和空白對(duì)照來判斷。HI試驗(yàn)中，如果陽性對(duì)照不超過標(biāo)準(zhǔn)值的±1個(gè)效價(jià)，陰性對(duì)照在2log2以下時(shí)為100%凝集，空白對(duì)照100%陰性，則試驗(yàn)結(jié)果正確。HI試驗(yàn)結(jié)果判斷時(shí)，需將反應(yīng)板傾斜45°，孔底沉淀的紅細(xì)胞流動(dòng)性好，呈淚珠樣流淌，邊緣無凝集顆粒的為凝集完全抑制［2］。試驗(yàn)結(jié)果觀察要及時(shí)，最好每5 min觀察一次，避免反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)，已凝集的紅細(xì)胞被釋放，影響結(jié)果的判斷。

8　結(jié)語

影響血凝和血凝抑制試驗(yàn)的因素很多，因此，在進(jìn)行檢測(cè)的過程中要注意質(zhì)量控制，考慮各方面因素，規(guī)范操作程序，以降低試驗(yàn)誤差。只有獲得真實(shí)可靠的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，才能科學(xué)評(píng)價(jià)疫苗免疫質(zhì)量和免疫效果，為疫病防控提供有力的技術(shù)支撐。

［1］趙明娟，趙俊勇.溫度和時(shí)間對(duì)血凝試驗(yàn)測(cè)定禽流感病毒H5N1亞型Re-6株抗原亞型的影響［M］.畜牧與飼料科學(xué)，2014，（35）.

［2］杭柏林，胡建和，劉麗艷，等.影響血凝抑制試驗(yàn)因素的研究發(fā)展［M］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（3）.

（編輯：晏兵兵）

S852

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1006-799X（2016）09-0108-02

劉睿華（1987-），女，內(nèi)蒙古呼和浩特人，助理獸醫(yī)師，，主要從事動(dòng)物防疫工作。