于新友，李天芝，苗立中

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院）

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)及其在鴨病病原檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

于新友1，李天芝1，苗立中2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院）

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)是一門(mén)新興的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，因其具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便和成本低等特點(diǎn)，越來(lái)越受到獸醫(yī)相關(guān)工作者的關(guān)注。目前，該方法已被廣泛應(yīng)用各種動(dòng)物病原的檢測(cè)。綜述LAMP技術(shù)在鴨傳染病病原檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展情況，以期為今后鴨病的診斷和防控工作提供參考。

LAMP；鴨??；病原；檢測(cè)；應(yīng)用

鴨傳染病對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)的威脅時(shí)刻存在，目前養(yǎng)殖場(chǎng)主要是將病料送專業(yè)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原分離鑒定或PCR檢測(cè)，一旦出現(xiàn)疫情，由于條件所限，很難實(shí)現(xiàn)對(duì)疫病的快速檢測(cè)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)不需要模板的熱變性、長(zhǎng)時(shí)間溫度循環(huán)、煩瑣的電泳和紫外觀察等過(guò)程，整個(gè)反應(yīng)在恒溫條件下進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后，結(jié)果可用肉眼直接觀察，在疫病診斷領(lǐng)域顯示了廣闊的應(yīng)用前景，筆者就LAMP技術(shù)及其在鴨病病原檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展綜述如下。

1　LAMP技術(shù)

1.1LAMP擴(kuò)增原理

LAMP技術(shù)是針對(duì)靶基因6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特殊引物，利用具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶，在65℃左右溫度下，啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng)，完成對(duì)目標(biāo)DNA的大量擴(kuò)增。在LAMP反應(yīng)中，內(nèi)引物雜交在目標(biāo)DNA區(qū)，啟動(dòng)互補(bǔ)鏈合成，導(dǎo)致啞鈴狀DNA產(chǎn)生。這種結(jié)構(gòu)很快以自身為板，進(jìn)行DNA合成延伸，形成莖-環(huán)DNA結(jié)構(gòu)，然后以此結(jié)構(gòu)作為L(zhǎng)AMP循環(huán)的起始結(jié)構(gòu)。由于內(nèi)引物雜交在莖-環(huán)的環(huán)上，引物鏈置換合成的DNA產(chǎn)生一個(gè)有缺口的莖-環(huán)DNA中間媒介，在莖上附有目標(biāo)序列。再通過(guò)外引物，在莖的末端形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，結(jié)果在同一鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成有很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖-環(huán)DNA混合物。

1.2LAMP引物設(shè)計(jì)

首先在靶基因的3’末端設(shè)定F3c、F2c、F1c三個(gè)區(qū)段，在5’末端設(shè)定B1、B2、B3三個(gè)區(qū)段。針對(duì)這六個(gè)區(qū)段設(shè)計(jì)四條引物，包括一對(duì)內(nèi)部引物和一對(duì)外部引物。上游內(nèi)部引物FIP：在3‘末端含有與F2c互補(bǔ)的F2區(qū)段，在5’末端含有與F1c相同序列的區(qū)段下游內(nèi)部引物BIP：在3‘末端含有與B2c互補(bǔ)的B2區(qū)段，在5’末端含有與B1c相同序列的區(qū)段。上游外部引物F3：含有與目標(biāo)DNA上的F3序列相同的區(qū)段。下游外部引物B3：含有與目標(biāo)DNA的B3相同序列的區(qū)段。引物的設(shè)計(jì)要注意以下幾個(gè)問(wèn)題：擴(kuò)增領(lǐng)域?yàn)镕2-B2區(qū)段間，應(yīng)該在200bp以內(nèi)；包含F(xiàn)2/B2在內(nèi)的環(huán)狀部分的長(zhǎng)度在40～60bp范圍內(nèi)；各區(qū)段的Tm值應(yīng)該在60～65℃之間；若只是為了鑒定靶基因存在與否，F(xiàn)1-B1的間距可以為零；引物應(yīng)避免二次結(jié)構(gòu)發(fā)生；各引物的3‘端不可含有與其他引物互補(bǔ)的序列。

1.3LAMP技術(shù)特點(diǎn)

LAMP技術(shù)特點(diǎn)具有以下特點(diǎn)：①操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、成本低，擴(kuò)增反應(yīng)在等溫下持續(xù)進(jìn)行，只需在恒溫水浴鍋中幾十分鐘即可完成，不需要特殊試劑，不需要預(yù)先進(jìn)行雙鏈DNA的變性，適合在基層養(yǎng)殖場(chǎng)的推廣應(yīng)用。②擴(kuò)增的效率高，沒(méi)有PCR反應(yīng)中溫模板的退火、復(fù)性過(guò)程，能滿足臨床病料樣本快速檢測(cè)的需要。③特異性高，由于是針對(duì)靶序列6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)的4種特異性引物，6個(gè)區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進(jìn)行核酸擴(kuò)增，故其特異性極高。針對(duì)六個(gè)區(qū)段使用四種不同的引物，可特異性擴(kuò)增靶基因序列。④靈敏度高，檢測(cè)的敏感性是常規(guī)PCR的10倍。⑤僅使用一種鏈置換型BstDNA聚合酶，因BstDNA聚合酶是一種不耐熱的DNA聚合酶，因此必須在模板預(yù)變性以后再加樣。⑥擴(kuò)增產(chǎn)物是在同一條DNA鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成大小不一的結(jié)構(gòu)。⑦當(dāng)模板是RNA時(shí)，僅需加入逆轉(zhuǎn)錄酶即可與DNA一樣進(jìn)行擴(kuò)增。

1.4反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)

LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)方法：①以2%的瓊脂糖凝膠電泳觀察是否有典型的梯狀條帶泳判定結(jié)果。②以擴(kuò)增產(chǎn)生的副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀的產(chǎn)生用肉眼直接判斷擴(kuò)增反應(yīng)是否進(jìn)行。③反應(yīng)體系中加入SYBRGreenⅠ等染料，通過(guò)觀察擴(kuò)增結(jié)果是否產(chǎn)生相應(yīng)顏色來(lái)判定是否有目的片段擴(kuò)增。④通過(guò)恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片實(shí)時(shí)觀察反應(yīng)結(jié)果。⑤運(yùn)用實(shí)時(shí)濁度儀監(jiān)測(cè)反應(yīng)結(jié)果。

2　在鴨病毒病檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1鴨病毒性肝炎病毒檢測(cè)

鴨病毒性肝炎是由鴨病毒性肝炎病毒（DHV）引起的一種急性、高度致死性傳染病，主要危害1～3周齡雛鴨，死亡率高達(dá)90%～95%，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病于1945年首次在美國(guó)發(fā)現(xiàn)，隨后相繼在世界多數(shù)國(guó)家報(bào)道了該病的流行。DHV可分為I型、Ⅱ型和Ⅲ型3種血清型，其中I型（DHV-Ⅰ）為臨床上常發(fā)的血清型。謝麗基等［1］根據(jù)基因庫(kù)中DHVⅠ基因的保守序列，設(shè)計(jì)特異性LAMP引物，建立了DHVI的RT-LAMP可視化檢測(cè)方法。該方法的敏感性可達(dá)10fg，高于常規(guī)PCR方法100倍，全部反應(yīng)可在1h內(nèi)完成，可以通過(guò)肉眼觀察顏色直接判定結(jié)果，對(duì)其他鴨常見(jiàn)病原體的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。胡成等［2］根據(jù)GenBank中登錄的DHV-IVPl基因的高度保守序列，設(shè)計(jì)了特異性的引物，建立了一種靈敏、特異、高效的可視化體外環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法。結(jié)果表明，該方法的靈敏性可達(dá)到10fg，是常規(guī)一步法RT-PCR方法的100倍以上。全部反應(yīng)可以在1.0～1.5h內(nèi)完成，并可以直接通過(guò)肉眼觀察頗色進(jìn)行結(jié)果判定，該方法對(duì)其他鴨常見(jiàn)的病原體檢測(cè)結(jié)果全部為陰性。

2.2鴨坦布蘇病毒檢測(cè)

鴨坦布蘇病毒（DTMUV）可引起鴨的坦布蘇病，感染鴨群的發(fā)病率高達(dá)100%，死亡率在5%～15%，臨床表現(xiàn)為高熱、蛋鴨產(chǎn)蛋率嚴(yán)重下降、部分感染鴨拉綠色稀便并出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，病理剖檢主要表現(xiàn)為卵巢充血、出血、萎縮、壞死，卵泡破裂，心內(nèi)膜出血，脾臟腫大，該病給養(yǎng)鴨業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)十億元［3］。張偉等［4］參考NCBI中已收錄的DTMUVE基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)了6條引物，通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系中各組分和條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了DTMUVLAMP檢測(cè)體系，并應(yīng)用熒光顯色劑（SYBRGreenⅠ和鈣黃綠素、錳離子）對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行可視化判定。結(jié)果顯示，以SYBRGreenⅠ為染料，顯色敏感性為10copies/μl的病毒，比普通PCR高100倍，以鈣黃綠素和錳離子組合作為顯色劑，其顯色極限為1000copies/μl的病毒，雖低于SYBR GreenⅠ的顯色敏感性，但能有效地避免氣溶膠造成的空氣環(huán)境污染。董嘉文等［5］根據(jù)DTMUVE基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)了一套引物，建立了檢測(cè)DTMUV的RT-LAMP方法，該法的最低檢測(cè)限可達(dá)7.8copies，其靈敏度是普通RT-PCR的100倍，對(duì)其他常見(jiàn)鴨源病毒核酸擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。

2.3鴨瘟病毒檢測(cè)

鴨瘟是由鴨瘟病毒（DPV）引起的鴨、鵝等水禽的敗血性、高度致死性傳染病，其特征為兩腿麻痹、下痢、流淚和部分病鴨頭頸腫大，是危害養(yǎng)鴨業(yè)最嚴(yán)重的傳染病之一［6］，是OIE規(guī)定的B類(lèi)傳染病，給世界各國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)造成了較大經(jīng)濟(jì)損失。許宗麗等［7］根據(jù)GenBank中DPVUI6基因的保守序列設(shè)計(jì)一套特異性引物，并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立DPV的LAMP可視化檢測(cè)方法。結(jié)果：建立的LAMP方法對(duì)其他鴨常見(jiàn)病原體無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)，可通過(guò)肉眼觀察顏色直接判定結(jié)果，敏感性可達(dá)0.1fg，是常規(guī)PCR方法的100倍，擴(kuò)增反應(yīng)只需在常規(guī)水浴鍋中進(jìn)行，可在1h內(nèi)完成。張坤等［8］根據(jù)GenBank中登錄的DPV基因組序列，設(shè)計(jì)3對(duì)特異性的LAMP引物，經(jīng)優(yōu)化反應(yīng)體系，建立了LAMP快速檢測(cè)方法。結(jié)果表明，LAMP方法能夠在63℃恒溫下，1h內(nèi)實(shí)現(xiàn)目的核酸的大量擴(kuò)增。結(jié)果判定時(shí)只需要在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入SYBRGreenⅠ染料，就可以直接在可見(jiàn)光或紫外光下觀察顏色變化。該方法敏感性可達(dá)0.245μg/L，比普通PCR靈敏性高10倍，對(duì)DHV、H9N2亞型禽流感病毒、鴨副黏病毒、鴨源偏肺病毒等的核酸無(wú)交叉反應(yīng)。

2.4鴨流感病毒檢測(cè)

禽流感是由禽流感病毒（AIV）引起的禽類(lèi)一種急性、高度接觸性傳染病。主要侵害禽類(lèi)的呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)及消化系統(tǒng)等。AIV根據(jù)糖蛋白血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）的不同分為16個(gè)HA亞型和10個(gè)NA亞型，理論上可形成160種不同的禽流感病毒亞型，且不同亞型的病毒基因組會(huì)發(fā)生片段重組，造成病毒變異。王辰雨等［9］參考AIV基質(zhì)蛋白（M）基因設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，特異性識(shí)別其6個(gè)不同位點(diǎn)，建立了基于顏色判定的LAMP方法。試驗(yàn)對(duì)不同禽源病毒進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法僅特異性地檢出禽流感病毒（H9和H5亞型）核酸，對(duì)AIV病毒的檢測(cè)極限為10EID50。石霖等［10］針對(duì)AIVM基因設(shè)計(jì)了4個(gè)不同區(qū)段的特異性引物，并對(duì)反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，建立了AIV的RT-LAMP方法。結(jié)果表明，該方法對(duì)AIVH1-H16亞型的檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，而對(duì)其他禽類(lèi)病毒的擴(kuò)增均為陰性，具有良好的特異性。對(duì)AIV的最低檢測(cè)限為13.43EID50/ml，靈敏度為普通一步RT-PCR的10倍，擴(kuò)增反應(yīng)可以在恒溫水浴內(nèi)60min內(nèi)完成，在反應(yīng)體系中添加熒光染料后，肉眼即可判定檢測(cè)結(jié)果。該檢測(cè)方法與RT-PCR方法和熒光定量RT-PCR方法對(duì)臨床樣品檢測(cè)的符合率均為81.8%。

2.5鴨細(xì)小病毒檢測(cè)

番鴨細(xì)小病毒病是由番鴨細(xì)小病毒（MPV）引起急性傳染病。該病主要危害3周齡內(nèi)雛番鴨，病鴨臨床表現(xiàn)為張口呼吸、喘氣，消瘦、拒食、蹲伏，病例表現(xiàn)為十二指腸內(nèi)容物呈松散栓子狀，表層有脫落的黏膜附著，胰臟呈點(diǎn)狀壞死，死亡率可達(dá)80%以上［11］，是目前番鴨飼養(yǎng)業(yè)中危害最嚴(yán)重的傳染病之一。謝麗基等［12］根據(jù)GenBank登錄的MDPV基因的保守序列，設(shè)計(jì)一套特異性LAMP引物，建立了MDPV的LAMP可視化檢測(cè)方法。該方法的敏感性可達(dá)10fg，高于常規(guī)PCR方法10倍，全部反應(yīng)可在1h內(nèi)完成，可通過(guò)肉眼觀察顏色直接判定結(jié)果，對(duì)其他鴨常見(jiàn)病原體的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

2.6鴨新城疫病毒檢測(cè)

新城疫是一種由新城疫病毒引起的急性、高度傳染性病，是禽類(lèi)養(yǎng)殖中的重要疫病之一，在世界各地廣發(fā)流行，各日齡鴨均可感染新城疫病毒發(fā)病，雛鴨最為嚴(yán)重，死亡率可達(dá)100%，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失.鞠小軍等［13］選取鴨源新城疫病毒NP基因的相對(duì)保守區(qū)序列，利用PrimerExplorerV4在線軟件設(shè)計(jì)了3對(duì)RT-LAMP引物，建立鴨源新城疫病毒RT-LAMP快速檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，該法能夠在63℃下1h內(nèi)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)核酸區(qū)段的大量擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)果可直接用肉眼判斷，特異性強(qiáng)，靈敏度高，與其他病毒，如H9N2亞型AIV、鴨呼腸孤病毒（DRV）、禽偏肺病毒、傳染性支氣管炎病毒等的核酸無(wú)交叉反應(yīng)，可檢測(cè)到1×10-3稀釋度的目標(biāo)RNA（0.1pg/ml），較普通RT-PCR的靈敏性高10倍。

2.7鴨圓環(huán)病毒檢測(cè)

鴨圓環(huán)病毒是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的病毒之一，主要臨床表現(xiàn)為生長(zhǎng)遲緩、羽毛凌亂、體質(zhì)量減輕等癥狀，更重要的是可感染禽類(lèi)的免疫系統(tǒng)，引起免疫抑制。趙光遠(yuǎn)等［14］根據(jù)GenBank中鴨圓環(huán)病毒基因序列，在保守區(qū)設(shè)計(jì)了6條特異性引物，并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了一種適用于鴨圓環(huán)病毒的LAMP檢測(cè)方法。該方法對(duì)H9亞型AIV、小鵝瘟、DPV、DHV、鴨副黏病毒均無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)，且擴(kuò)增反應(yīng)只需在常規(guī)水浴鍋中進(jìn)行，1h內(nèi)即可完成反應(yīng)，對(duì)鴨圓環(huán)病毒模版DNA的最小檢測(cè)限為10fg，靈敏度是一步法PCR的1000倍。

2.8鴨呼腸孤病毒檢測(cè)

引起鴨發(fā)病的呼腸孤病毒有新型鴨呼腸孤病毒（NDRV）和番鴨呼腸孤病毒（MDRV），鴨感染后主要臨床表現(xiàn)為軟腳、腹瀉等，有的能夠引起高達(dá)98%的死亡率，病理變化則主要以肝、脾灰白色局灶性壞死為特征［15］。馬利等［16］建立了一種基于熒光顯色的禽呼腸孤病毒LAMP檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法使用針對(duì)禽呼腸孤病毒的p10基因8個(gè)區(qū)域的6條LAMP引物，能夠在63℃恒溫條件下1h內(nèi)完成反應(yīng)，具有良好的敏感性和特異性，最低能夠檢出102個(gè)拷貝的病毒，敏感性比普通PCR高100倍，而對(duì)其他病毒檢測(cè)結(jié)果為陰性。在熒光顯色中分別應(yīng)用SYBR GreenⅠ和鈣黃綠素作為顯色劑，其結(jié)果與瓊脂糖凝膠電泳一致。于可響等［17］建立適于基層實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)NDRV的一步RT-LAMP方法?；谛滦网喓裟c孤病毒S3基因的6個(gè)保守區(qū)域設(shè)計(jì)了4條LAMP引物，利用Bst DNA聚合酶在63℃恒溫保持45min即可完成反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng)，由此建立了RT-LAMP檢測(cè)方法。該方法具有良好的特異性，除NDRV外對(duì)其他6種常見(jiàn)鴨病的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。該方法對(duì)病毒RNA的最低檢出量為0.1pg，是常規(guī)RT-PCR方法的100倍。

3　在鴨細(xì)菌病檢測(cè)中的應(yīng)用

3.1鴨疫里默氏桿菌檢測(cè)

鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌感染引起的一種接觸性傳染性疾病，又稱為鴨傳染性漿膜炎、新鴨病、鴨敗血癥、鴨疫綜合征、鴨疫巴氏桿菌病等。該病主要侵害鴨等水禽類(lèi)動(dòng)物，臨床表現(xiàn)主要為神經(jīng)癥狀、纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎，2-7周齡雛鴨受到的危害最嚴(yán)重，發(fā)病率可達(dá)90%以上，死亡率高達(dá)75%以上，給養(yǎng)鴨造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［18］。吳彤等［19］根據(jù)鴨疫里默氏菌16SrRNA基因設(shè)計(jì)引物，在建立了檢測(cè)鴨疫里默氏菌的LAMP方法，該法在63℃60min即能完成反應(yīng)，通過(guò)監(jiān)測(cè)反應(yīng)液濁度判斷結(jié)果。在此基礎(chǔ)上，用煮沸10min的方法代替試劑盒提取DNA方法，并用顯色方法代替濁度檢測(cè)和瓊脂糖凝電泳方法判斷結(jié)果，通過(guò)敏感性、特異性、病原消長(zhǎng)規(guī)律試驗(yàn)驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示，顯色法、濁度檢測(cè)和瓊脂糖凝電泳方法判斷結(jié)果的敏感性和特異性相同。細(xì)菌分離法共獲得201株鴨疫里默氏菌，且經(jīng)LAMP與PCR法檢測(cè)均呈陽(yáng)性，LAMP與PCR法檢出陽(yáng)性樣本總數(shù)分別為271份和254份，LAMP方法陽(yáng)性檢出率高于PCR方法。

3.2禽多殺性巴氏桿菌檢測(cè)

禽霍亂是一種由禽多殺性巴氏桿菌引起家禽和野禽發(fā)病死亡的接觸性傳染病，常表現(xiàn)為敗血型，發(fā)病率和死亡率都很高，但有時(shí)表現(xiàn)為慢性經(jīng)過(guò)。早在18世紀(jì)歐洲各地的禽類(lèi)就常發(fā)生此病，目前該病在世界大多數(shù)國(guó)家都有分布，呈散發(fā)性或流行性，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，多年來(lái)一直都被國(guó)內(nèi)外學(xué)者所重視，被列為重點(diǎn)防治的家禽疫病之一。

4　小結(jié)

LAMP技術(shù)作為一種快速基因擴(kuò)增技術(shù)，自發(fā)明以來(lái)，在國(guó)內(nèi)外疾病、衛(wèi)生、食品及環(huán)境等多個(gè)領(lǐng)域都取得了重大成就，近年來(lái)受到了越來(lái)越多的關(guān)注，LAMP是整個(gè)過(guò)程均在恒溫條件下進(jìn)行，不需要昂重儀器設(shè)備，而易在基層部門(mén)普及的檢測(cè)技術(shù)，避免了常規(guī)PCR對(duì)于溫度循環(huán)的特殊要求所帶來(lái)的各種不便，可快速、準(zhǔn)確地做出傳染性病病原學(xué)診斷，從而及時(shí)有效控制疫情，使養(yǎng)殖場(chǎng)損失降到最低。但LAMP檢測(cè)技術(shù)同樣存在一些不足，一是LAMP對(duì)于引物設(shè)計(jì)要求很高，需要設(shè)計(jì)的引物數(shù)目多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜。二是檢測(cè)靈敏度太高，易因空氣中的氣溶膠污染而產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。三是在LAMP擴(kuò)增結(jié)果判定方面也存在一定的問(wèn)題，當(dāng)以瓊脂糖凝膠電泳法法判定結(jié)果時(shí)，結(jié)果為梯形條帶，不易鑒別非特異性擴(kuò)增。當(dāng)焦磷酸鎂白色沉淀和體系中添加染料法判定結(jié)果時(shí)，可能存在因結(jié)果顏色不明顯而造成肉眼觀察不便捷及誤判，另外，當(dāng)有非特異擴(kuò)增時(shí)，染料也可結(jié)合，影響結(jié)果判定。當(dāng)微流控芯片和實(shí)時(shí)濁度儀法判定結(jié)果時(shí)，則需要購(gòu)置昂貴的分析儀器，隨著研究的不斷深入，研究人員還將其原位雜交、免疫捕獲、核酸雜交等技術(shù)進(jìn)行聯(lián)合，開(kāi)發(fā)了很多有效的檢測(cè)方法，尤其是將環(huán)介導(dǎo)橫溫?cái)U(kuò)增與橫向流動(dòng)試紙條技術(shù)結(jié)合，發(fā)展起來(lái)的新的將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）與橫向流動(dòng)試紙條（LFD）聯(lián)合應(yīng)用，建立一種新的病原快速檢測(cè)技術(shù)，即LAMP-LFD技術(shù)。使得LAMP現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)結(jié)果的觀察更加方便、直觀和準(zhǔn)確。并解決了擴(kuò)增產(chǎn)物形成氣溶膠污染環(huán)境，導(dǎo)致樣品間交叉污染的問(wèn)題，開(kāi)啟了基因檢測(cè)技術(shù)步入了基層養(yǎng)殖場(chǎng)的應(yīng)用新時(shí)代，極具推廣前景。目前已經(jīng)有科研人員在CSFV的檢測(cè)方面［20］進(jìn)行了一些探索，并取得了一定的成績(jī)，筆者認(rèn)為這將是LAMP-LFD技術(shù)是未來(lái)LAMP檢測(cè)技術(shù)將來(lái)的發(fā)展的方向，在一些基層實(shí)驗(yàn)室和流行病學(xué)調(diào)查等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

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