美國沃倫·阿爾波特基金獎概覽(下)

朱安遠(yuǎn),郭華珍

(1.北京金自天正智能控制股份有限公司 市場營銷中心,北京 100070；2.中國康復(fù)研究中心北京博愛醫(yī)院 康復(fù)評定科,北京 100068)

美國沃倫·阿爾波特基金獎概覽(下)

朱安遠(yuǎn)1,郭華珍2

(1.北京金自天正智能控制股份有限公司 市場營銷中心,北京 100070；2.中國康復(fù)研究中心北京博愛醫(yī)院 康復(fù)評定科,北京 100068)

在美國頒發(fā)的知名國際生物醫(yī)學(xué)大獎中,沃倫·阿爾波特基金獎的權(quán)威性和名望聲譽(yù)僅次于享有“諾貝爾獎的風(fēng)向標(biāo)”之盛譽(yù)的拉斯克獎,1987年以來阿獎共頒發(fā)過28屆(1990年未頒獎,2008年和2009年合為1屆頒獎),獲獎?wù)吖灿?9人(其中女性得主5人,尚無雙料得主和組織機(jī)構(gòu)得主),其中諾獎得主8人,拉獎得主18人。2011年和2015年中國中醫(yī)科學(xué)院首席研究員屠呦呦先后摘取拉斯克臨床醫(yī)學(xué)研究獎和沃倫·阿爾波特基金獎,這是她日后最終成功問鼎諾醫(yī)獎的前奏曲,屠呦呦先生接連斬獲3項世界級大獎,從而鎖定了她在醫(yī)學(xué)科學(xué)界的“青蒿素之母”的崇高地位。對生命科學(xué)領(lǐng)域當(dāng)今炙手可熱的基因組編輯技術(shù)CRISPR-Cas9的發(fā)展軌跡及其發(fā)明專利權(quán)之爭予以概括性介紹。

哈佛大學(xué)；哈佛醫(yī)學(xué)院(HMS)；沃倫·阿爾波特基金會；沃倫·阿爾波特基金獎(WAFP/AFP,阿獎)；拉斯克獎(拉獎)；拉斯克基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究獎(LBM)；拉斯克臨床醫(yī)學(xué)研究獎(LCM)；諾貝爾獎(諾獎)；諾貝爾自然科學(xué)獎；諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎PM(諾醫(yī)獎)；諾貝爾化學(xué)獎CH(諾化獎)；諾貝爾和平獎PE(諾和獎)；屠呦呦；青蒿素；基因組編輯技術(shù)CRISPR-Cas9；發(fā)明專利權(quán)

5 基因組編輯技術(shù)CRISPR-Cas9與沃倫·阿爾波特基金獎及其發(fā)明簡史[1～5]

微生物分為真核類、原核類和非細(xì)胞類(如各種病毒)三大類。在生物學(xué)家們的顯微鏡下,酵母細(xì)胞是真核生物的代表,大腸桿菌則是原核生物的代表。日本分子細(xì)胞生物學(xué)家大隅良典(2016PM)通過對酵母細(xì)胞的深入研究,“因他發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬的機(jī)制”而獨(dú)享2016年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。

糖類(曾稱碳水化合物,如糧食中的淀粉)、蛋白質(zhì)、脂肪和核酸是構(gòu)成生命體的四大類大分子有機(jī)物(高分子化合物)。

基因(gene,即遺傳因子)是控制生物性狀的基本遺傳單位,是指具有遺傳效應(yīng)的脫氧核糖核酸(DNA)片段,部分病毒(如煙草花葉病毒和艾滋病毒HIV等)的遺傳物質(zhì)則是核糖核酸(RNA)?；蛑沃幕緲?gòu)造和性能,儲存著生命的種族、血型、孕育、生長和凋亡等過程的全部信息。

在分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)領(lǐng)域,基因組編輯(又稱基因組剪接、基因組修飾、基因組加工,genome editing)技術(shù)是一種可以在基因組水平上利用特異性核酸酶對目標(biāo)DNA序列進(jìn)行定點(diǎn)修飾加工的遺傳操作技術(shù)。這種技術(shù)的原理是構(gòu)建一個人工內(nèi)切酶EEN(內(nèi)切酶的全稱是限制性核酸內(nèi)切酶,又稱限制性核酸酶,engineered endonuclease)作介導(dǎo),在預(yù)定的基因組位置切斷DNA,被切斷的DNA在被細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)系統(tǒng)的修復(fù)過程中會產(chǎn)生突變,從而達(dá)到定點(diǎn)編輯改造目標(biāo)基因組的目的。核酸酶引起的DNA雙鏈斷裂DSB(double-strand breaks)可通過以下2種不同途徑予以修復(fù)：非同源末端連接NHEJ(non-homologous end joining)和同源重組型修復(fù)HDR(homology directed repair),由此基因組編輯技術(shù)可實(shí)現(xiàn)以下3種基因組改造目的：基因敲除、特異突變的引入和定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因。

1989年首例采用同源重組HR(homologous recombination)技術(shù)產(chǎn)生的基因打靶小鼠(Mus musculus)問世,這是2007年諾醫(yī)獎的獲獎成果。雖然HR技術(shù)在小鼠模型中被廣泛使用,但這項技術(shù)效率很低且在大部分物種中難以推廣應(yīng)用。[6]

2016年3月9日阿獎官網(wǎng)發(fā)布公告,將當(dāng)年沃倫·阿爾波特基金獎授予以下對基因組編輯技術(shù)CRISPR-Cas9做出開創(chuàng)性基礎(chǔ)貢獻(xiàn)的5位科學(xué)家：①美國北卡羅來納州立大學(xué)的法國微生物學(xué)家巴蘭古(Rodolphe Barrangou,1975—)；②UCB美國女生物化學(xué)家杜德娜(Jennifer Anne Doudna,1964—)；③杜邦法國公司的法國營養(yǎng)和健康專家霍瓦特(Philippe Horvath,1970—)；④維爾紐斯大學(xué)生物技術(shù)研究所的立陶宛生物化學(xué)家斯克尼斯(Virginijusik?nys/Siksnys,1956—)；⑤馬克斯·普朗克感染生物學(xué)研究所(柏林)和瑞典于默奧大學(xué)的法國女微生物學(xué)家、遺傳學(xué)家和生物化學(xué)家卡彭蒂埃(又譯為卡彭蒂耶、夏龐蒂埃、夏邦杰,Emmanuelle Marie Charpentier,1968—),表彰“他們對CRISPR細(xì)菌防御系統(tǒng)的認(rèn)識及其適用于基因組編輯的革命性發(fā)現(xiàn)做出卓越貢獻(xiàn)”(for their remarkable contributions to the understanding of the CRISPR bacterial defense system and the revolutionary discovery that it can be adapted for genome editing)。哈佛醫(yī)學(xué)院院長兼阿爾波特基金會科學(xué)顧問委員會主席弗萊爾說“這5位科學(xué)家極具變革性的洞察力帶來了一項為全球所迅速擁抱的技術(shù),改變了我們研究和理解真核生物遺傳學(xué)的方式,為開發(fā)新的基因和細(xì)胞療法提供了巨大的潛力”?；敉咛睾桶吞m古發(fā)現(xiàn)細(xì)菌通過一種被稱為CRISPR的系統(tǒng)切掉入侵病毒的DNA特定片段來保護(hù)自己,避免遭受病毒等病原體的破壞；杜德娜、卡彭蒂埃和斯克尼斯則在他們發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上,認(rèn)識到CRISPR系統(tǒng)可在包括人類等眾多生物體的任意基因序列上進(jìn)行編程,這一極具目的性的“剪接”可用來隨意改變或替換靶向DNA。CRISPR技術(shù)的優(yōu)化者和延展應(yīng)用者(如張鋒和切奇等)則無緣阿獎。此前,UCB霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所(Howard Hughes Medical Institute)和勞倫斯伯克利國家實(shí)驗室(Lawrence Berkeley National Laboratory)的杜德娜以及德國感染研究赫爾姆霍茨中心(Helmholtz Center for Infection Research)和瑞典于默奧大學(xué)的卡彭蒂埃因這一貢獻(xiàn)已共享2015年度生命科學(xué)突破獎(Breakthrough Prize in Life Sciences,每年頒獎1次,始頒于2013年,因其獎金高于諾獎而被譽(yù)為“豪華版諾貝爾獎”),她倆將均分300萬美元獎金,其獲獎理由是“因利用細(xì)菌免疫性的古老機(jī)制而開發(fā)出基因組編輯這樣的一個強(qiáng)大而通用技術(shù),具有廣泛的跨生物學(xué)和醫(yī)學(xué)意義”(for harnessing an ancient mechanism of bacterial immunity into a powerful and general Technology for editing genomes,with wide-ranging implications across biology and medicine)。卡彭蒂埃/杜德娜還被列入2015年度化學(xué)領(lǐng)域的湯森路透引文桂冠名單(Thomson reuters citation laureates,始于1989年,素有“諾貝爾獎的風(fēng)向標(biāo)”之稱)。

5.1 CRISPR系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)

科研人員后來通過文獻(xiàn)檢索追溯才發(fā)現(xiàn),早在1987年日本大阪大學(xué)微生物學(xué)家和分子生物學(xué)家石野良純(Yoshizumi Ishino,1957—)小組在克隆K12大腸桿菌堿性磷酸酶同工酶(alkaline phosphatase isozyme=iap)的基因編碼序列時,就意外地發(fā)現(xiàn)編碼序列附近存在特殊的串聯(lián)間隔重復(fù)(5個)的DNA片段,每個重復(fù)片段含29個保守堿基且具有內(nèi)部堿基互補(bǔ)的回文結(jié)構(gòu),這些保守片段之間由32個堿基的居間序列隔開,當(dāng)時人們對這種結(jié)構(gòu)的生物學(xué)功能還是一無所知。[7]1993年西班牙阿利坎特大學(xué)微生物學(xué)家馬丁內(nèi)斯·莫奇卡(Francisco Juan Martínez Mojica,1963—)小組在對地中海極嗜鹽菌(Haloferax mediterranei)和沃爾卡尼極嗜鹽菌(Haloferax volcanii)的研究中發(fā)現(xiàn)了這種串聯(lián)間隔重復(fù)序列[8～9],1990年代中后期科學(xué)家們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)這種類似結(jié)構(gòu)廣泛存在于古細(xì)菌和細(xì)菌的基因組中(現(xiàn)有基因測序結(jié)果表明,約90%的古細(xì)菌綱和40%的細(xì)菌綱的基因組或質(zhì)粒中至少存在1個CRISPR位點(diǎn)/基因座,有的甚至含有2個或3個位點(diǎn)),2000年稱其為短規(guī)律性間隔重復(fù)SRSR(short regularly spaced repeat)序列[10],2002年荷蘭烏得勒支大學(xué)揚(yáng)森(Ruud Jansen)等人將其正式命名為成簇規(guī)律性間隔短回文重復(fù)CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)序列[11],它構(gòu)建一種特殊的防御系統(tǒng),能有效地抵抗噬菌體和外界各種基因元件(如質(zhì)粒)對其造成的干擾。CRISPR因其在結(jié)構(gòu)上的特殊性和在功能上的特異性正逐漸成為細(xì)菌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。[12]在研究CRISPR序列過程中還發(fā)現(xiàn)許多與這些序列功能存在關(guān)聯(lián)的核酸酶或螺旋酶,統(tǒng)稱為CRISPR—相關(guān)因子Cas(CRISPR-associated),從而在細(xì)菌中鑒定出一個全新的CRISPR-Cas系統(tǒng)。

5.2 CRISPR系統(tǒng)生物學(xué)功能和免疫機(jī)制的闡明

因缺乏病毒和質(zhì)粒的序列信息,初期對CRISPR系統(tǒng)的研究進(jìn)展緩慢,其行使的確切功能一直未能闡明。隨著測序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展,2005年3個研究小組都發(fā)現(xiàn)CRISPR的居間序列(spacer)并非細(xì)菌自身染色體所擁有,反而和細(xì)菌病毒(噬菌體)以及染色體外DNA(質(zhì)粒)序列更為相似,即與宿主菌的染色體外的遺傳物質(zhì)高度同源。據(jù)此科學(xué)家們推測CRISPR-Cas的功能可能與細(xì)菌抵抗外源遺傳物質(zhì)入侵的適應(yīng)性防御系統(tǒng)(免疫系統(tǒng))有關(guān)：細(xì)菌通過特定方式獲取噬菌體DNA片段并將其整合到自身CRISPR序列,從而對外源入侵病毒產(chǎn)生“記憶”,當(dāng)噬菌體再次感染時,細(xì)菌利用這些序列信息來識別入侵者并將其破壞。[13]

2007年法國科學(xué)家霍瓦特和巴蘭古小組在研究生產(chǎn)酸奶的乳酸桿菌對噬菌體的抗性時首次發(fā)現(xiàn)并證明了細(xì)菌可利用CRISPR系統(tǒng)抵抗噬菌體的入侵。[14]他們在研究中發(fā)現(xiàn)：感染烈性噬菌體后的細(xì)菌大部分死亡,保留下來的“幸運(yùn)”細(xì)菌則獲得對同株噬菌體再次感染的抗性。對這些細(xì)菌基因組分析發(fā)現(xiàn)其CRISPR居間序列中存在噬菌體序列,去除這些序列可造成細(xì)菌噬菌體抗性消失；而將這些序列直接整合到未感染過噬菌體的細(xì)菌CRISPR,則細(xì)菌對首次噬菌體感染也擁有抗性,從而證實(shí)了CRISPR居間序列的重要作用。進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn),細(xì)菌獲得抗性的原因在于具有內(nèi)切酶活性的Cas蛋白可特異性地將與居間序列互補(bǔ)配對的噬菌體DNA雙鏈在特定位置切開,從而造成噬菌體DNA雙鏈斷裂,以消除潛在威脅。[15]他們的突出貢獻(xiàn)是發(fā)現(xiàn)了Cas7和Cas9(Cas protein-9 nuclease,一種分子質(zhì)量很大的多功能蛋白,由crRNAs介導(dǎo)在DNA中產(chǎn)生的DSB。在早期的CRISPR文獻(xiàn)中,如今大名鼎鼎的Cas9曾被稱作Cas5或Csn1)蛋白在CRISPR中的重要作用：Cas7產(chǎn)生間隔和重復(fù)序列,Cas9則是內(nèi)切酶(核酸酶)。通過一系列研究表明CRISPR-Cas是一種全新的細(xì)菌獲得性免疫系統(tǒng),細(xì)菌通過該系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)自我保護(hù),這一現(xiàn)象的直接用途就是通過改造細(xì)菌基因組而獲得抵抗噬菌體能力,減少工程菌死亡,而更為重要的用途則是隨后發(fā)明的基因組編輯技術(shù)。因CRISPR系統(tǒng)在食品發(fā)酵工業(yè)和醫(yī)學(xué)中的巨大潛在價值而使其迅速成為研究熱點(diǎn)。

2008年科學(xué)家們又發(fā)現(xiàn)細(xì)菌CRISPR系統(tǒng)能阻止外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移, 首次利用實(shí)驗驗證了CRISPR系統(tǒng)的底物是DNA, 進(jìn)一步明確了其作用機(jī)制, 并意識到它可能被應(yīng)用于DNA編輯。[16]

CRISPR系統(tǒng)同時具有“搜索”和“摧毀”2種機(jī)制：使用遺傳物質(zhì)RNA來尋找特定序列的DNA,同時使用Cas9中的內(nèi)切酶來剪接DNA。CRISPR系統(tǒng)介導(dǎo)的免疫機(jī)制分為3個階段：獲得(acquisition)、表達(dá)(expression)和干擾(interference)。獲得階段又稱信息處理階段,后2個階段又合稱執(zhí)行階段。

5.3 CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)的發(fā)明

卡彭蒂埃的研究重點(diǎn)是感染性疾病分子生物學(xué),她更多地關(guān)注細(xì)菌抵御病毒侵染的分子機(jī)制,CRISPR-Cas系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)后,其研究小組迅速投入該研究領(lǐng)域,他們初步闡明CRISPR來源RNA(CRISPR-derived RNA=crRNA)的生成和作用,發(fā)現(xiàn)一種反式激活crRNA(trans-activating crRNA=tracrRNA)可與Cas蛋白參與RNA酶Ⅲ,對CRISPR轉(zhuǎn)錄生成序列的選擇性酶切而產(chǎn)生crRNA,隨后Cas蛋白、tracrRNA和crRNA形成的復(fù)合物可對與crRNA配對的外源DNA實(shí)施剪接。[17]杜德娜的主要研究方向是RNA介導(dǎo)基因調(diào)節(jié)的分子機(jī)制,她擁有完美的學(xué)術(shù)生涯：1989年以核酶(ribozyme)方面的論文《面向RNA復(fù)制酶的設(shè)計》(TowardsthedesignofanRNAreplicase)獲哈佛大學(xué)生物化學(xué)PhD,其博導(dǎo)是“因發(fā)現(xiàn)端粒酶和端粒保護(hù)染色體的機(jī)理”而榮獲諾醫(yī)獎的哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院和霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所的加拿大和美國(雙重國籍)生物學(xué)家紹斯塔克(Jack William Szostak,1952—,2009PM33)；其博士后指導(dǎo)教師則是因“獨(dú)立發(fā)現(xiàn)RNA的生物催化作用(即核酶)”而榮獲諾化獎的科羅拉多大學(xué)的美國生物化學(xué)家切赫(Thomas Robert Cech,1947—,1989CH22)。杜德娜的優(yōu)勢在于擁有堅實(shí)的分子生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物化學(xué)等研究基礎(chǔ)。2007年杜德娜小組開始研究CRISPR-Cas系統(tǒng),重點(diǎn)在于闡明Cas酶催化、crRNA形成和靶位DNA雙鏈斷裂過程中的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和分子機(jī)制。[18]

2011年斯克尼斯小組在大腸桿菌中重組了嗜熱鏈球菌的CRISPR系統(tǒng),證實(shí)該系統(tǒng)的充分必要組分包括Cas9核酸酶、crRNA和tracrRNA。[19]至此細(xì)菌獲得性免疫系統(tǒng)CRISPR-Cas的作用機(jī)制被基本闡明,CRISPR系統(tǒng)被證實(shí)可用作準(zhǔn)確和高效的基因組編輯工具,從而為其進(jìn)一步的實(shí)際應(yīng)用奠定了堅實(shí)基礎(chǔ)。CRISPR-Cas發(fā)揮作用主要分為3個步驟：①外源DNA部分短序列作為間隔序列插入到細(xì)菌染色體DNA而形成CRISPR；②CRISPR轉(zhuǎn)錄生成crRNA前體,借助RNA酶Ⅲ完成crRNA加工成熟；③crRNA區(qū)間序列與外源DNA互補(bǔ)配對啟動Cas蛋白催化的DNA剪接?？茖W(xué)家們在研究中共發(fā)現(xiàn)存在3類CRISPR-Cas系統(tǒng),其中Ⅱ類系統(tǒng)最為簡單,只需要一種Cas蛋白(即Cas9)就可完成DNA的識別和剪接,更適宜于實(shí)際操作。

CRISPR-Cas系統(tǒng)與細(xì)菌限制—修飾系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用過程具有異曲同工之妙。限制—修飾系統(tǒng)是細(xì)菌對自身DNA進(jìn)行修飾(甲基化),對外源DNA則借助限制性內(nèi)切酶識別(不識別修飾后的自身DNA)和剪接而抵御感染。后來發(fā)現(xiàn)也存在3類限制性內(nèi)切酶,而Ⅱ類內(nèi)切酶由于識別和剪接在相同位置而被廣泛應(yīng)用。發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶及其在分子遺傳學(xué)方面的應(yīng)用是1978年諾醫(yī)獎的獲獎成果,而利用限制性內(nèi)切酶首次實(shí)現(xiàn)DNA重組則是美國生物化學(xué)家保羅·伯格(Paul Berg,1926—,DNA重組技術(shù)之父,1980CH31●)榮獲諾化獎的研究成果。

2011年5月卡彭蒂埃和杜德娜在波多黎各召開的美國微生物學(xué)會會議上相識,研究方向的一致性和研究內(nèi)容的互補(bǔ)性使她倆決定強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)手,密切合作進(jìn)行細(xì)菌CRISPR-Cas系統(tǒng)應(yīng)用于DNA編輯的深入研究,果然2012年便率先取得重大突破：[20]聯(lián)合小組對天然CRISPR-Cas系統(tǒng)在體外進(jìn)行適當(dāng)改造(重組),將tracrRNA和crRNA雙組分利用基因工程整合為一條鏈,稱為單鏈介導(dǎo)RNA(single guide RNA=sgRNA)。改造后用于特定DNA編輯技術(shù)的CRISPR-Cas9基本原理是：sgRNA與靶位DNA相應(yīng)序列互補(bǔ)配對可啟動內(nèi)切酶Cas9的雙鏈剪接活性,Cas9中的HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)剪接sgRNA互補(bǔ)鏈DNA,RuvC樣結(jié)構(gòu)域則負(fù)責(zé)剪接非互補(bǔ)鏈DNA?？ㄅ淼侔?杜德娜聯(lián)合小組在試管內(nèi)利用II型CRISPR-Cas系統(tǒng)首次實(shí)現(xiàn)了目的DNA特定位點(diǎn)的DSB,為CRISPR-Cas系統(tǒng)應(yīng)用于基因組定點(diǎn)編輯奠定了基礎(chǔ),開辟了一個全新領(lǐng)域,這項重大突破便成為CRISPR-Cas9技術(shù)發(fā)明史的一個重要里程碑。實(shí)際上斯克尼斯小組稍早一點(diǎn)已取得類似結(jié)果,2012年4月6日他們投稿于《細(xì)胞》雜志,6天后被拒稿(事后《細(xì)胞》雜志編輯部承認(rèn)此文確實(shí)很重要),作者將文稿壓縮后的精煉版于5月21日改投PNAS并被發(fā)表。[21]2013年卡彭蒂埃/杜德娜聯(lián)合小組進(jìn)一步利用CRISPR-Cas9技術(shù)在細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)DNA精確定位編輯,隨后迅速引發(fā)井噴式發(fā)展,通過改造還可實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的激活或抑制調(diào)控。[22]

CRISPR-Cas9技術(shù)不僅可用于探索生命奧秘，而且其應(yīng)用領(lǐng)域?qū)拸V，商業(yè)前景十分廣闊，包括細(xì)胞和動物模型建立、功能基因組篩選(如修改奶牛基因提高產(chǎn)奶量和修改植物基因提高抗蟲性等)、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)表觀調(diào)控、細(xì)胞基因組活性成像和靶向基因治療等。[23]因其技術(shù)本身存在脫靶效應(yīng),在臨床應(yīng)用安全性方面尚待進(jìn)一步完善和改進(jìn),但其強(qiáng)大的作用效果將為單基因甚至多基因遺傳病治療(基因療法)提供全新模式。

5.4 CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)明專利權(quán)之爭

生命科學(xué)領(lǐng)域國際三大知名學(xué)術(shù)期刊是指美國《細(xì)胞》(Cell)、英國《自然》(Nature)和美國《科學(xué)》(Science),合稱CNS。2016年1月14日,《細(xì)胞》雜志發(fā)表麻省理工學(xué)院(MIT)教授、博德研究所(Broad Institute,由MIT和哈佛大學(xué)合作創(chuàng)辦于2004年)所長、國際基因測序先驅(qū)、數(shù)學(xué)家和遺傳學(xué)家埃里克·蘭德(Eric Steven Lander,1957—)關(guān)于基因組編輯技術(shù)CRISPR發(fā)明歷程的綜述文章《CRISPR英雄譜》,重點(diǎn)介紹這一技術(shù)發(fā)展史上重要節(jié)點(diǎn)的科學(xué)家群英榜。[24]該文的發(fā)表引起軒然大波,在美國生命科學(xué)界引發(fā)一場激辯,紛爭和異議不斷,業(yè)內(nèi)不少人認(rèn)為該文有失客觀和公正。

2011年9月16日美國總統(tǒng)奧巴馬簽署對專利法進(jìn)行全面修訂的《美國發(fā)明法案》,其生效日期2013年3月16日是美國專利系統(tǒng)的一個關(guān)鍵時間節(jié)點(diǎn)。此前,美國專利和商標(biāo)局(USPTO/PTO)授予發(fā)明專利權(quán)實(shí)施“發(fā)明優(yōu)先”原則,此后則實(shí)施“申請(提交)優(yōu)先”原則。若申請日在2013年3月16日之后,但發(fā)明時間早于這一天,發(fā)明專利權(quán)的歸屬則依照舊規(guī)則執(zhí)行。

博德研究所美籍華裔生物學(xué)家張鋒(Zhang Feng,1982—,自述遲至2011年2月尚不知CRISPR為何物)首次使用CRISPR系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了對人類和哺乳動物細(xì)胞的DNA編輯。[25]同期雜志還發(fā)表了1篇得到類似結(jié)果的文章,其領(lǐng)銜者(通訊作者)是哈佛大學(xué)美國遺傳學(xué)家、分子工程師和化學(xué)家切奇(George McDonald Church,1954—)。[26]稍后杜德娜小組亦發(fā)表類似結(jié)果。[27]

近年來,張鋒所在的博德研究所/MIT和杜德娜所在的UCB霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所就CRISPR技術(shù)的相關(guān)專利權(quán)歸屬問題展開激烈爭執(zhí)。2014年4月15日USPTO依照所謂“發(fā)明優(yōu)先”原則將CRISPR技術(shù)的首項相關(guān)專利權(quán)授予博德研究所/MIT的張鋒而不是早于2013年3月15日便提交申請的杜德娜/卡彭蒂埃[28],不少人認(rèn)為出現(xiàn)這種結(jié)果的一個重要的原因就是博德研究所的專利律師申請了快速審查(fast-track patent)而抄了近道。為了支持自己獲取發(fā)明專利權(quán),張鋒表示他對杜德娜/卡彭蒂埃小組的工作知之甚少(2011年2月時張鋒對CRISPR技術(shù)還一無所知),并提交實(shí)驗室筆記本的照片,以證明自己在2012年年初就開始了這方面的研究工作,時間上要早于對方。截至2015年11月,張鋒實(shí)驗室和博德研究所關(guān)于CRISPR-Cas9技術(shù)的相關(guān)專利權(quán)在美國已有14個獲得授權(quán),在歐洲亦有4個被批準(zhǔn),控制著CRISPR技術(shù)的每個重要商業(yè)應(yīng)用。

UCB經(jīng)精心準(zhǔn)備之后,于2015年4月請求USPTO啟動干預(yù)程序,重新審核CRISPR技術(shù)首項相關(guān)專利權(quán)的歸屬,此請求已于翌年1月獲得同意,3月10日干預(yù)程序正式啟動,這意味著雙方又站在了同一起跑線上,都需要拿出最強(qiáng)有力的證據(jù)來證明自己就是CRISPR技術(shù)的第一發(fā)明人。在啟動重新審核專利權(quán)的節(jié)骨眼上,深陷發(fā)明專利權(quán)苦戰(zhàn)的張鋒略顯意外地落選阿獎,這無疑又是一記沉重打擊,很可能為這場爭執(zhí)埋下不利伏筆甚或是禍根,筆者認(rèn)為杜德娜/卡彭蒂埃一方翻盤的可能性很大。

5.5 基因組編輯技術(shù)的新突破及質(zhì)疑

CRISPR-Cas9是繼鋅指核酸酶ZFN(zinc-finger nuclease,2002年首次應(yīng)用于敲除目的基因)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶TALEN(transcription activator-like effector nuclease,2011年成功應(yīng)用于目標(biāo)基因的編輯[29])之后問世的第3代人工核酸酶和基因組編輯技術(shù),被譽(yù)為基因組編輯的一把“魔剪”。與前兩代技術(shù)相比,它具有成本低、制作簡便和快捷高效等優(yōu)點(diǎn),因其擁有無可比擬的技術(shù)優(yōu)勢而迅速風(fēng)靡于世界各地的生命科學(xué)實(shí)驗室,人類的諸多遺傳性疾病有望通過CRISPR-Cas9技術(shù)而得以解決。

2016年5月2日,河北科技大學(xué)(石家莊)生物科學(xué)與工程學(xué)院副教授韓春雨[通訊作者,1974年出生于石家莊,1996年本科畢業(yè)于河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,2000年獲中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物遺傳育種專業(yè)碩士學(xué)位,2003年獲中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)(2007年起已更名為北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院)生物化學(xué)與分子生物學(xué)ScD。其主要合作者沈嘯系浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系研究員]小組在國際頂級期刊英國《自然·生物技術(shù)》雜志在線發(fā)表論文《利用格氏嗜鹽堿桿菌的Argonaute蛋白實(shí)現(xiàn)DNA介導(dǎo)的基因組編輯工具》[30],他們另辟蹊徑,利用古細(xì)菌——格氏嗜鹽堿桿菌中的一種Argonaute蛋白作為內(nèi)切酶,采用短鏈單鏈DNA作介導(dǎo),發(fā)明一種對基因組位點(diǎn)編輯范圍更廣更精準(zhǔn)的基因組編輯新技術(shù)NgAgo-gDNA(NgAgo=Natronobacterium gregoryi Argonaute),它不同于以RNA作介導(dǎo)的CRISPR-Cas9-sgRNA技術(shù),可真正實(shí)現(xiàn)對基因組的任意位置進(jìn)行剪接,將基因組編輯技術(shù)的可能性推進(jìn)到更廣泛的境地,它還規(guī)避了令人頭痛的RNA易于形成復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)而帶來的失效或脫靶效應(yīng),其性能優(yōu)于當(dāng)今西方的熱門技術(shù)CRISPR-Cas9,該研究成果打破了外國基因組編輯技術(shù)的發(fā)明專利壟斷,實(shí)現(xiàn)了中國尖端生物技術(shù)原創(chuàng)零的突破。

2014年2月韓春雨偶然閱讀到荷蘭瓦格寧根大學(xué)(Wageningen University)科學(xué)家小組在《自然》雜志發(fā)表的論文報道TtAgo(Thermus thermophilus Argonaute)可在高溫條件下體外切割DNA(該項成果已申請英美和PCT國際專利)[31]，受此啟發(fā)才著手利用Argonaut進(jìn)行相關(guān)課題研究。

2015年12月21日，韓春雨小組的相關(guān)研究申請了題為“以Argonaute核酸酶為核心的基因編輯技術(shù)”的中國專利(專利權(quán)人：浙江大學(xué)，發(fā)明人：沈嘯、韓春雨，申請?zhí)枺篊N201510971234.5，公開號：CN105483118A，公開日：2016.04.13，國際專利分類IPC號：C12N15/10)，2016年5月11日該專利已進(jìn)入實(shí)質(zhì)審查階段。該項成果尚未申請包括PCT國際專利在內(nèi)的國外專利。

2016年6月30日,著名科普作家、學(xué)術(shù)打假斗士和中國獨(dú)立新聞人的先驅(qū)方舟子先生(原名方是民,1990年獲中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生物系BSc,1995年獲美國密歇根州立大學(xué)生物化學(xué)PhD,曾先后在美國羅切斯特大學(xué)生物系和索爾克生物研究院做博士后研究,研究方向是分子遺傳學(xué))在網(wǎng)絡(luò)上公開發(fā)文質(zhì)疑韓春雨小組所謂“諾貝爾獎級”實(shí)驗成果存在“不可重復(fù)性操作”問題,懷疑該科研成果的可靠性和真實(shí)性。[32]國內(nèi)外實(shí)驗室的科學(xué)家們甚至無法檢測出NgAgo的內(nèi)切酶活性,還有人擔(dān)心韓春雨小組是否故意隱瞞了一些數(shù)據(jù),把偶然現(xiàn)象當(dāng)作了一種常態(tài)(即科研上的所謂假陽性結(jié)果)。

韓春雨小組論文所稱可有效編輯內(nèi)源性基因組的研究成果發(fā)表以后，在該領(lǐng)域影響很大，因NgAgo基因組編輯技術(shù)的實(shí)驗始終無法重復(fù)，國內(nèi)外有關(guān)專家學(xué)者紛紛提出質(zhì)疑，2016年11月11日南通大學(xué)劉東小組在英文期刊《細(xì)胞研究》(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院主辦)以“致編輯信”(Letter)形式在線發(fā)表《基于NgAgo的fabp11a基因敲低引起的斑馬魚眼睛發(fā)育缺陷》一文，提出NgAgo系統(tǒng)無法用于編輯斑馬魚基因組。[33]同年11月15日中外20名專家學(xué)者聯(lián)名在英文期刊《蛋白質(zhì)與細(xì)胞》(由中國科學(xué)院北京生命科學(xué)研究院、中國生物物理學(xué)會和高等教育出版社聯(lián)合創(chuàng)辦)以Letter形式在線發(fā)表《有關(guān)NgAgo的問題》一文，反映各自所在的研究小組均無法重現(xiàn)韓春雨小組在NgAgo論文中所述及的結(jié)果，呼吁原始論文的作者澄清NgAgo技術(shù)的不確定性。[34]緊接著，11月28日刊載韓春雨小組論文的原始期刊《自然·生物技術(shù)》以“編輯部關(guān)注”(To the Editor)形式在線發(fā)表韓德美3個獨(dú)立團(tuán)隊10名主流科學(xué)家聯(lián)名的通信論文《利用NgAgo未能檢測到DNA引導(dǎo)的基因組編輯》[35]，他們都無法重復(fù)韓春雨小組原論文中圖4的結(jié)果，這一關(guān)鍵圖表展示了對哺乳動物細(xì)胞內(nèi)源性基因位點(diǎn)的編輯。這些團(tuán)隊無一能在任何位點(diǎn)，或在任何高于檢測方法敏感度的條件下觀察到NgAgo所誘導(dǎo)的變異，未能檢測到成功編輯靶向序列的證據(jù)。

NgAgo-gDNA新技術(shù)具有編輯對象受限更小、介導(dǎo)設(shè)計制作簡便、特異性高和脫靶率低等明顯優(yōu)勢,盡管該技術(shù)尚處于初級階段，但它能否如愿發(fā)揮出其優(yōu)勢和潛力,蓬勃興起并迅速占領(lǐng)市場,從而擔(dān)當(dāng)起第4代基因組編輯技術(shù)之重任,最終取代一度席卷全球的CRISPR-Cas9技術(shù)抑或與其并駕齊驅(qū),人們現(xiàn)只能拭目以待,此事尚需等待時間的檢驗。

6 結(jié)束語

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)是循證醫(yī)學(xué)EBM(又稱實(shí)證醫(yī)學(xué)、證據(jù)醫(yī)學(xué),evidence-based medicine),意即“遵循證據(jù)的醫(yī)學(xué)”,其核心思想是醫(yī)療決策(即病人的處理、治療指南和醫(yī)療政策的制定等)應(yīng)在現(xiàn)有的最好的臨床研究依據(jù)基礎(chǔ)上作出,同時也重視結(jié)合醫(yī)生個人的臨床經(jīng)驗。循證醫(yī)學(xué)不同于以經(jīng)驗醫(yī)學(xué)為主的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)。

中國工程院院士樊代明先生認(rèn)為人類醫(yī)學(xué)經(jīng)歷了經(jīng)驗醫(yī)學(xué)時代、科學(xué)醫(yī)學(xué)(或稱生物醫(yī)學(xué))時代,現(xiàn)在則是整合醫(yī)學(xué)時代。整合醫(yī)學(xué)HIM(holistic integrative medicine)是把全科醫(yī)學(xué)、轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)(translational medicine)、循證醫(yī)學(xué)和互補(bǔ)醫(yī)學(xué)(即補(bǔ)充和替代醫(yī)學(xué),包括世界各地的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)和民間療法,如印度醫(yī)學(xué)、催眠療法、傳統(tǒng)的中醫(yī)藥和針灸療法等)等精髓加以整理整合而成,使之適應(yīng)、符合病人的全身整體治療,它與整體醫(yī)學(xué)(holistic medicine,有學(xué)者認(rèn)為它是循證醫(yī)學(xué)和補(bǔ)充醫(yī)學(xué)的結(jié)合)亦有所不同。整合醫(yī)學(xué)作為新的醫(yī)學(xué)體系,是未來醫(yī)學(xué)發(fā)展的必然方向和必由之路。[36～37]

屠呦呦先生因發(fā)現(xiàn)青蒿素和雙氫青蒿素的重大原創(chuàng)性貢獻(xiàn),于2011年和2015年先后摘取拉斯克臨床醫(yī)學(xué)研究獎和沃倫·阿爾波特基金獎,這為她稍后贏取諾醫(yī)獎(2015PM31●)奠定了堅實(shí)基礎(chǔ)。屠呦呦接連斬獲3項世界級大獎,從而鎖定了她在醫(yī)學(xué)科學(xué)界的“青蒿素之母”的崇高地位,也使得頗受關(guān)注的青蒿素發(fā)現(xiàn)發(fā)明權(quán)之爭終于塵埃落定。鑒此筆者認(rèn)為,在不久的將來屠呦呦先生將眾望所歸地登頂成為國家最高科學(xué)技術(shù)獎得主。

去年學(xué)界失湯斯(Charles Hard Townes,1915.07.28—2015.01.27),今年吾家逝慈父。家父朱堯天先生(譜名：在昭,筆名：牧夫,1934.11.13今湖南省邵東縣—2016.08.03深圳市龍華新區(qū))已駕鶴西歸,特謹(jǐn)致無限的深情哀思。對于飛秒化學(xué)之父(Father of femtochemistry)、埃及和美國(雙重國籍)物理化學(xué)家和化學(xué)物理學(xué)家澤維爾(Ahmed Hassan Zewail,1946.02.26埃及Damanhur—2016.08.02加利福尼亞州帕薩迪納市,1999CH,埃及歷史上迄今唯一的諾貝爾科學(xué)獎得主,諾獎歷史上的第580位逝者)以及美籍華裔生物化學(xué)家錢永健先生(Roger Yonchien Tsien,1952.02.01紐約州紐約市—2016.08.24俄勒岡州尤金市,2008CH33,錢學(xué)森先生的堂侄,首位逝世的華裔諾獎得主,諾獎歷史上的第582位逝者)的不幸仙逝,特順致深切哀悼。截至2016年9月底,已逝諾獎得主逝世于8月份者為最多(64/584人),逝世于11月份者為最少(38/584人),均值是48.67±7.95人,僅2016年8月全世界就損失4位諾獎得主,痛乎矣!悲乎哉!!

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