IL-6基因634C/G多態(tài)性與糖尿病周圍神經(jīng)病變相關性研究

安新煥，丁俊彩，武彥峰，梁干雄

(1.中山市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東 中山 528400；2.中山市人民醫(yī)院兒科，廣東 中山 528400；3.北京市理化分析測試中心，北京 100094)

IL-6基因634C/G多態(tài)性與糖尿病周圍神經(jīng)病變相關性研究

安新煥1，丁俊彩2，武彥峰3，梁干雄1

(1.中山市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東 中山 528400；2.中山市人民醫(yī)院兒科，廣東 中山 528400；3.北京市理化分析測試中心，北京 100094)

目的 探討白細胞介素-6(IL-6)基因啟動子區(qū)-634C/G多態(tài)性與廣東地區(qū)漢族人群糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)的關系。方法 收集2014年1月至2015年1月我院收治的125例2型糖尿病無周圍神經(jīng)病變患者(DPN0組)，83例2型糖尿病周圍神經(jīng)病變患者(DPN組)及101例健康對照者(NC組)，采用聚合酶鏈反應限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法檢測其IL-6基因啟動子區(qū)-634C/G多態(tài)性，比較分析各組間基因型頻率、等位基因頻率以及相關臨床資料。結果 DPN0組的GG基因型頻率(16.0%)明顯高于NC組的4.0%(P＜0.05)，DPN0組(34.4%)、DPN組(33.1%)的G等位基因頻率均明顯高于NC組的22.3%(P＜0.05)，但DPN0和DPN兩組間G等位基因頻率差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結論 IL-6基因啟動子區(qū)-634 G/G基因型不是廣東漢族人群DPN發(fā)生的遺傳危險因素，但G等位基因可能是DPN發(fā)生的遺傳危險因素之一。

白細胞介素-6；基因；啟動子區(qū)；多態(tài)性；糖尿病周圍神經(jīng)病變

糖尿病性周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者最常見的慢性并發(fā)癥之一。10年以上糖尿病病程的患者常有明顯的臨床糖尿病神經(jīng)病變，2001年對國內(nèi)住院患者調(diào)查發(fā)現(xiàn)，61.8%的2型糖尿病患者并發(fā)神經(jīng)病變[1]，國外學者報道24.7%～81.8%的糖尿病患者發(fā)生周圍神經(jīng)病變[2]。IL-6是一種炎性細胞因子，可促使氧化應激增強，而氧化應激及低度炎癥狀態(tài)是DPN發(fā)生的機理之一，本文旨在檢測IL-6基因-643C/G的多態(tài)性，以探討在中國廣東地區(qū)漢族人中此基因多態(tài)性與DPN之間是否有關聯(lián)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2014年1月至2015年1月我院收治的2型糖尿病患者。診斷標準：根據(jù)1999年 WHO診斷標準診斷2型糖尿病；依據(jù)中華醫(yī)學會糖尿病學分會.中國2型糖尿病防治指南2013年版糖尿病周圍神經(jīng)病變診斷及排除標準診斷糖尿病周圍神經(jīng)病變。根據(jù)上述標準將入選的208例T2DM患者分為無糖尿病周圍神經(jīng)病變組(DPN0)125例，其中男性63例，女性62例，平均年齡(56.38±14.91)歲,糖尿病周圍神經(jīng)病變組(DPN)83例，其中男性37例，女性46例，平均年齡(60.82±15.11)歲。以體檢血糖、血脂、血生化指標正常，無糖尿病、高血壓病家族史的101例作為健康對照組(NC組)，其中男性56例，女性45例，平均年齡(47.5±8.21)歲，彼此間無親緣關系。

1.2 方法 模板DNA用QIAamp DNA Mini Kit試劑盒提取。PCR-RFLP方法檢測基因多態(tài)性。北京市理化分析測試中心合成引物，上游引物5'-GAGAC-GCCTTGA AGTAACTG-3'，下游引物5'-AACCAAAGATG TTCTGAA CTGA-3'。PCR反應體系：50 μL反應體系中引物濃度為30 μmol/L，56 μmol/L的dNTP濃度，加入5 U的Taq酶，94℃預變性5 min，然后94℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸60 s，共30個循環(huán)，終末72℃延伸5 min。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳證實后，在20 μL酶切體系中加4 μL產(chǎn)物用5 U的酶消化9 h，在紫外檢測系統(tǒng)中觀察結果(見圖1)。PCR擴增的目的片段長度為180 bp，CC基因型只有180 bp一條片段，CG基因型有180 bp、120 bp、60 bp三條片段，GG基因型有120 bp和60 bp兩條片段(60 bp片段看不到)。并測序確定CC基因型和GG基因型(見圖2)。

圖1 酶解后瓊脂糖凝膠電泳圖注：M為DNA分子量標記；1、4為GG基因型，2、8為CG基因型，3、5、6、7為CC基因型。

圖2 GG、CC基因型的測序圖譜注：箭頭所指為多態(tài)性位點，三角形所指為酶切位點。

1.3 觀察指標 體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)，收縮壓(systolic blood pressure，SBP)，舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)，空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)，餐后2 h血糖(two hour postprandial plasma glucose，2 hPG)，糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin A1c，HbA1c)，甘油三酯(TG)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。

1.4 檢測方法 應用全自動生化分析儀檢測血糖和血脂變化，用親和層析法測HbA1c。應用全自動生化分析儀檢測血糖和血脂變化，采用終點法進行檢測，終點法(Endessay)完全被轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物，不再進行反應達到終點，取反應終點的吸光度來計算血糖和血脂的濃度。生化檢驗中除酶和BUN、CRE外幾乎都用終點法來進行檢測。(1)一點終點法：取反應達終點時的一個點的吸光度來計算結果；(2)二點終點法：取反應尚未開始時讀取一個點的吸光度，待反應達終點時再取第二點的吸光度。用第二點吸光度減去第一點吸光度的差值來計算結果。主要用于扣除試劑和樣品空白。保證結果的準確性。一般雙試劑用。利用親和層析法測HbA1c，將具有特殊結構的親和分子制成固相吸附劑放置在層析柱中，當要被分離的蛋白混合液通過層析柱時，與吸附劑具有親和能力的蛋白質(zhì)就會被吸附而滯留在層析柱中。那些沒有親和力的蛋白質(zhì)由于不被吸附，直接流出，從而與被分離的蛋白質(zhì)分開，然后選用適當?shù)南疵撘?，改變結合條件，將被結合的蛋白質(zhì)洗脫下來，利用共價連接有特異配體的層析介質(zhì)分離蛋白質(zhì)混合物中能特異結合配體的目的蛋白或其他分子。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DPN0組和DPN組患者的生化指標和臨床資料比較 兩組患者在臨床資料及各種生化指標方面比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 DPN0組和DPN組患者的臨床資料比較(±s)

表1 DPN0組和DPN組患者的臨床資料比較(±s)

注：1 mmHg=0.133kPa。

指標DPN0組DPN組t值P值63/62 56.38±14.91 5.58±4.99 23.45±3.53 142.38±20.82 8.92±3.24 81.84±12.77 14.68±5.51 9.65±2.74 4.99±1.63 2.36±2.49 2.67±0.99 1.08±0.38性別(男/女，例)年齡(歲)病程(年) BMI(kg/m2) SBP(mmHg) FPG(mmol/L) DBP(mmHg) 2 hPG(mmo1/L) HbA1c(%) CHOL(mg/mL) TG(mmo1/L) LDL-C(mmo1/L) HDL-C(mmo1/L) 37/46 60.82±15.11 6.15±5.08 23.54±4.06 141.57±22.14 8.76±3.38 81.7±12.66 14.7±5.2 9.79±2.97 5.12±2.09 2.29±3.01 2.42±0.94 0.99±0.3 0.12 0.45 0.56 0.12 0.45 0.72 0.95 0.43 0.85 0.43 0.96 0.12 0.19＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05

2.2 各組間基因型頻率和等位基因頻率比較 DPN0組的GG基因型頻率明顯高于NC組(χ2= 8.699，P=0.013；χ2=7.941，P=0.019)，DPN組和NC組的GG基因型頻率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.766，P= 0.381)。DPN0組、DPN組的G等位基因頻率都明顯高于NC組(χ2=7.519，P=0.006；χ2=5.426，P=0.02；χ2=8.404，P=0.004)，但DPN0和DPN兩組間G等位基因頻率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.033，P=0.855)，見表2。

表2 各組IL-6基因頻率和等位基因[例(%)]

3 討論

DPN是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，對患者生活質(zhì)量影響頗大。隨著人口老齡化的加重，糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)病率逐步升高，糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)病率也急劇升高[3]。國外研究報道DPN發(fā)病率隨年齡和病程增加，T2DM病程到達25年后周圍神經(jīng)病變的發(fā)生率可達50%以上[4]。國內(nèi)外報道糖尿病周圍神經(jīng)病變發(fā)病率的不同，與其診斷標準有相應關系[5]，肌電圖是糖尿病周圍神經(jīng)病變診斷的“金標準”，但其僅反映有髓鞘的大神經(jīng)纖維的功能狀態(tài)，而神經(jīng)末梢和小纖維改變常是糖尿病周圍神經(jīng)病變的早期改變，因此單獨使用金標準時，?？蛇z漏部分患者。

糖尿病周圍神經(jīng)病變病理改變主要表現(xiàn)為周圍神經(jīng)的脫髓鞘和或軸索變性。發(fā)病機制涉及多個方面：缺血缺氧、糖基化終產(chǎn)物的增多和氧自由基過多等。張媚等[6]研究發(fā)現(xiàn)用糖基化終產(chǎn)物對雪旺細胞體外干預，其干預組雪旺細胞增殖遷移能力減弱，凋亡增加，并且該組中TNF-α、IL-6水平明顯高于空白對照組及牛血清清蛋白組，初步提示雪旺細胞的損害可能通過促炎癥細胞的表達來實現(xiàn)。焦洋等[7]發(fā)現(xiàn)炎癥因子與糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)生有關，其通過抑制IL-6等炎癥因子的表達從而實現(xiàn)對糖尿病周圍神經(jīng)病變的保護。糖尿病痛性神經(jīng)病變的發(fā)生與促炎性細胞因子有關，對糖尿病周圍神經(jīng)病變進展性的患者進行腓腸神經(jīng)活檢，與炎癥反應相關的大多數(shù)基因表達均上調(diào)[8]。因此，炎癥和氧化應激的病理生理變化在糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。糖尿病發(fā)生時，血糖升高，導致氧化應激增強，NF-кB活性增強，ROS增多，從而產(chǎn)生一系列促炎癥反應，引起炎癥反應放大的惡性循環(huán)。

Kitamura等[9]發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)單核細胞，IL-6基因型及等位基因不同，IL-6含量及分泌能力也有所差異，其中GG基因型、G等位基因攜帶者在體外培養(yǎng)的單核細胞IL-6含量及分泌能力均明顯增加。國內(nèi)學者對于IL-6在糖尿病周圍神經(jīng)病變發(fā)生發(fā)展中的作用的研究結果都存在差異，不同藥物治療前后IL-6的變化也存在差異。張麗等[10]研究發(fā)現(xiàn)，IL-6在DM和DPN組較健康對照組均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，IL-6在DM組和DPN組間的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，阮園等[11]的研究與張麗等[10]相似。宋慶芳等[12]研究提示：IL-6是導致糖尿病周圍神經(jīng)病變發(fā)生的危險因素，而在糖尿病周圍神經(jīng)病變治療中，采用度洛西汀和甲鈷胺聯(lián)合治療糖尿病痛性神經(jīng)病變，治療后，測定IL-6水平明顯低于治療前[13]，而前列腺素E1治療前后差異無統(tǒng)計學意義[10]。

本研究顯示：DPN0組和DM組的G/G基因型頻率均明顯高于NC組，而DPN組和NC組的G/G基因型頻率差異無統(tǒng)計學意義，這表明IL-6基因啟動子區(qū)-634G/G基因型與糖尿病的發(fā)生有關，與糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)生無明顯聯(lián)系。DPN0組、DPN組及DM組的G等位基因頻率均明顯高于NC組，但DPN0和DPN兩組間G等位基因頻率差異無統(tǒng)計學意義，這表明G等位基因與糖尿病及糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)生均有關系，但在糖尿病進展為糖尿病周圍神經(jīng)病變的過程中作用不大。IL-6及基因多態(tài)性對糖尿病周圍神經(jīng)病變影響的精確機理并不十分清楚，尚待深入探討。

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Correlation between 634C/G polymorphism of IL-6 gene and diabetic peripheral neuropathy.

AN Xin-huan1, DING Jun-cai2,WU Yan-feng3,LIANG Gan-xiong1.1.Department of Endocrinology,the People s Hospital of Zhongshan City,Zhongshan 528400,Guangdong,CHINA;2.Department of Pediatrics,the People's Hospital of Zhongshan City, Zhongshan 528400,Guangdong,CHINA;3.The Physical and Chemical Analysis and Testing Center of Beijing City,Beijing 100094,CHINA

Objective To investigate the association of IL-6 gene promoter region-643C/G polymorphism with diabetic peripheral neuropathy(DPN).Methods The polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)was applied to detect the polymorphism of IL-6 gene promoter region-634 C/G in 125 cases of type 2 diabetes mellitus without DPN(DPN0 group)and 83 cases of type 2 diabetes mellitus with DPN(DPN group),which were treated in our hospital from Jan.2014 to Jan.2015,as well as 101 normal controls(NC group).The relative clinical data, genotype frequency and allele frequency were compared between groups.Results The GG genotype frequency was significantly higher in DPN0 group than NC group(16.0%vs 4.0%,P＜0.05).The G allele frequency was significantly higher in DPN0 group(34.4%)and DPN group(33.1%)than NC group(22.3%),P＜0.05,with no statistically significant difference between DPN0 group and DPN group(P＞0.05).Conclusion The IL-6 promoter region-643G/G genotype is not a genetic risk factor of DPN development,and IL-6-634G allele may be one of the risk factors in DPN development.

IL-6;Gene;Promoter region;Polymorphism;Diabetic peripheral neuropathy(DPN)

R587.2

A

1003—6350（2016）15—2435—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.15.008

2016-03-15)

廣東省中山市科技局基金資助項目（編號：2006A035）

安新煥。E-mail：axh1998@sina.com