張改霞，金 鉞，賈 靜，石林春＊＊，孫稚穎

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 濟(jì)南 250355；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所 北京 100193）

中藥材北沙參種子DNA條形碼鑒定研究＊

張改霞1，2，金 鉞2，賈 靜2，石林春2＊＊，孫稚穎1＊＊

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 濟(jì)南 250355；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所 北京 100193）

目的：本研究旨在建立鑒定北沙參種子的新方法，確保藥材生產(chǎn)種植中種質(zhì)基原準(zhǔn)確。方法：對北沙參不同產(chǎn)地種子經(jīng)初步形態(tài)特征鑒定后，取單粒種子為一份樣品，提取基因組DNA、PCR擴(kuò)增、雙向測序拼接獲得ITS2序列，結(jié)合序列比對、變異位點(diǎn)分析，基于中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)（http://www. tcmbarcode.cn），系統(tǒng)地完成種子樣品的分子鑒定。結(jié)果：研究表明66份種子樣品中，64份與《中國藥典中藥材DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列》中北沙參序列特征一致，2份樣品序列中各有一處SNP位點(diǎn)，為北沙參暫未發(fā)現(xiàn)過的遺傳多樣性信息，鑒定結(jié)果顯示為北沙參。結(jié)論：DNA條形碼技術(shù)能準(zhǔn)確鑒定北沙參種子，并為中藥材種子鑒定提供新方法，同時(shí)SNP位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)為后續(xù)研究北沙參品種多樣性問題提供參考。

北沙參 中藥材種子 ITS2條形碼 分子鑒定

北沙參為傘形科植物珊瑚菜Glehnia littoralis Fr. Schmidt ex Miq. 的干燥根，是我國常用大宗中藥材，具養(yǎng)陰清肺，益胃生津的功效，用于肺熱燥咳，勞嗽痰血，胃陰不足，熱病津傷，咽干口渴等癥狀[1]。目前北沙參野生資源極少，為國家三級保護(hù)瀕危植物[2]，被《國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》列為二級保護(hù)植物。據(jù)市場調(diào)查，流通北沙參藥材現(xiàn)均為栽培品，引種區(qū)域從山東煙臺、日照等沿海縣市不斷擴(kuò)展到菏澤、濟(jì)寧、聊城等內(nèi)陸地區(qū)，并在河北安國、內(nèi)蒙赤峰等地形成規(guī)?；a(chǎn)業(yè)化栽培種植[3]。北沙參藥材的大規(guī)模人工培植，使得北沙參種源鑒定、良種選育問題尤為重要。

中藥材種子是中藥材產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)，其質(zhì)量與真?zhèn)沃苯佑绊懼兴幉牡姆N植、加工、流通、臨床使用等后續(xù)各個(gè)環(huán)節(jié)。準(zhǔn)確鑒定中藥材種子，保證中藥材種源的純正優(yōu)良，對后續(xù)種質(zhì)優(yōu)選、良種培育、規(guī)?；N植等各階段具有重要意義。近年來，條形碼技術(shù)廣泛地應(yīng)用于植物和動物的鑒定中，本文依據(jù)《中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則》[4]，采用ITS2為主體序列，基于條形碼技術(shù)，以中藥材北沙參種子為研究對象，對收集到的22批66份北沙參種子樣品鑒定，并從分子鑒定角度分析不同產(chǎn)地種源的可靠性，確保種子來源準(zhǔn)確，為北沙參良種鑒定選育提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

為使實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有代表性[4]，通過產(chǎn)地調(diào)查和文獻(xiàn)檢索，從藥材的主要分布區(qū)河北、安徽、內(nèi)蒙古、山東等省份共收集22批次優(yōu)質(zhì)北沙參種子，每個(gè)批次種子取樣3次，共66份樣品。樣品信息見表1。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)考察

取北沙參種子，確保取樣均勻性，于LY-WN-HPCCD型動態(tài)顯微成像系統(tǒng)（成都勵(lì)揚(yáng)精密機(jī)電有限公司）下觀察種子形狀、大小、顏色等表面性狀，并拍照記錄，用游標(biāo)卡尺（上海九量五金工具有限公司）精確測量長度、寬度，并用百粒法測其千粒重[5]，準(zhǔn)確記錄各項(xiàng)結(jié)果。

1.2.2 DNA提取

從22批樣品中，每批樣品取樣3次，分3批于不同時(shí)間、不同儀器實(shí)驗(yàn)，每批每次輕取一粒種子（約15 mg，避免帶出它粒種子碎屑），使用75%乙醇擦拭表面、揮干，用DNA提取研磨儀MM400（德國Retsch公司）加2粒鋼珠研磨2 min（30次/s），使用植物DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取總DNA，加入裂解液后，56℃水浴過夜。其后加入等體積氯仿∶異戊醇（24∶1）抽提，取上清，吸附柱過濾并用緩沖液、漂洗液洗滌，最后用洗脫緩沖液（Buffer TE）洗脫。提取到的基因組DNA，采用NanoDrop 2000 （美國Thermo Scientific公司）測其濃度，并根據(jù)A260/A280，A260/A230的值判斷DNA提取質(zhì)量。

表1 實(shí)驗(yàn)材料編號及產(chǎn)地

圖1 北沙參種子群體圖、個(gè)體圖

1.2.3 PCR擴(kuò)增及測序

PCR反應(yīng)為25 μL體系，反應(yīng)體系的配置、擴(kuò)增引物的選擇及反應(yīng)條件的設(shè)置依照Chen等[6]的研究方法操作，PCR產(chǎn)物純化后使用ABI3730XL測序儀進(jìn)行雙向測序。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

測序峰圖利用CodonCode Aligner V4.2.7（美國CodonCode公司）去除低質(zhì)量區(qū)域、校對拼接、切除正反引物序列?；陔[馬爾可夫模型（Hidden Markov Model）去除5.8S rRNA和28S rRNA區(qū)段獲得ITS2序列[7]。利用Mega 5.05進(jìn)行序列比對、變異位點(diǎn)分析，基于中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)，在物種鑒定項(xiàng)下植物類藥材鑒定 （ITS2）項(xiàng)，將實(shí)驗(yàn)序列粘貼到鑒定框中，提交并查詢，系統(tǒng)地完成實(shí)驗(yàn)種子樣品的鑒定。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)特征

北沙參藥材的“種子”實(shí)際上為珊瑚菜的雙懸果，呈棕色，氣香，灰黃色，近球形或橢圓形，分生果半橢圓形，合生面平坦棕色，長6-13 mm，寬6-10 mm，背部棱3，兩邊各1，稍延展，表面被棕色絨毛。將分生果果皮剝開現(xiàn)胚乳，腹面略凹陷。千粒重約15 g，群體圖、個(gè)體圖見圖1。

2.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增和測序

DNA提取時(shí)，直接取單粒種子實(shí)驗(yàn)，在加入等體積冷凍異丙醇沉淀DNA過程中，會有個(gè)別樣品底部出現(xiàn)白色團(tuán)塊膠狀物，為避免對后續(xù)PCR擴(kuò)增、測序造成影響，應(yīng)不考慮部分DNA損失，只吸取上清過濾，舍棄沉淀物。NanoDrop 2000檢測DNA濃度均大于10 ng·μL-1，OD260/280比值2.00左右，OD260/230比值2.00-3.00，擴(kuò)增條帶整齊明亮，約500 bp，測序峰圖底峰干凈，無雜峰套峰的出現(xiàn)。不同時(shí)間、使用不同儀器實(shí)驗(yàn)的3批樣品結(jié)果一致，可見實(shí)驗(yàn)中各因素對結(jié)果影響較小，ITS2序列獲取較為容易。

2.3 北沙參種子物種鑒定

本研究共收集22批樣品，每批樣品取單粒種子3次，經(jīng)實(shí)驗(yàn)獲得66條ITS2序列，長度均為227 bp。共出現(xiàn)3種單倍型，單倍型A1 64條序列，單倍型A2、A3各1條序列。如圖2（正向測序峰圖），峰圖整體質(zhì)量較高，單倍型A2 108位、單倍型A3124位各有1套峰，單倍型A1相應(yīng)位點(diǎn)處并未出現(xiàn)套峰，且經(jīng)反向序列驗(yàn)證，結(jié)果與之相對應(yīng)，可知套峰處即為多拷貝位點(diǎn)處，即單倍型A2代表序列BESS0059-2在108 bp處G（T）多拷貝，單倍型A3代表序列BESS0029-1在124 bp處G（A）多拷貝，主導(dǎo)單倍型A1與《中國藥典中藥材DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列》[8]中北沙參主導(dǎo)單倍型序列特征一致，可以確定其基原為北沙參。單倍型A2、A3有多拷貝位點(diǎn)出現(xiàn)，為新的單倍型，利用中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)網(wǎng)站，在物種鑒定項(xiàng)下植物類藥材鑒定（ITS2）項(xiàng)，將所得樣品ITS2序列粘貼到鑒定框中，提交并查詢，結(jié)果顯示種子樣品主導(dǎo)單倍型A1與數(shù)據(jù)庫中北沙參序列完全一致，單倍型A2、A3與數(shù)據(jù)庫中北沙參序列相似性高達(dá)99.6%，比對結(jié)果顯示為北沙參，表明所有種子樣品均為北沙參種子，從而系統(tǒng)的完成對北沙參種子樣品的鑒定。多拷貝位點(diǎn)分析峰圖見圖2。

圖2 北沙參種子ITS2序列種內(nèi)多拷貝位點(diǎn)峰圖

3 討論

3.1 DNA條形碼技術(shù)可準(zhǔn)確鑒定中藥材北沙參種子

北沙參種子傳統(tǒng)鑒定法主要從種子表面形態(tài)、大小、形狀及內(nèi)部特征如油管等方面鑒別，傳統(tǒng)鑒定方法一般需要豐富的專業(yè)經(jīng)驗(yàn)，多方面、多角度分析辨別，不便于數(shù)字化和自動化。本研究采用DNA條形碼技術(shù)對北沙參種子鑒定，采用單粒種子實(shí)驗(yàn)的方法，有效避免不同種粒遺傳物質(zhì)之間的相互干擾，66條序列，每條均源自一粒種子的DNA，從DNA 提取至ITS2序列獲得，各步進(jìn)行均較順暢，沒有出現(xiàn)未能獲得序列的樣品，結(jié)果較好。在對種子物種鑒定時(shí)，單倍型A1的64條序列與《中國藥典中藥材DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列》中北沙參主導(dǎo)單倍型序列特征一致，可以確定其基原為北沙參，而單倍型A2、A3各有一個(gè)多拷貝位點(diǎn)，為北沙參ITS2序列中暫未出現(xiàn)的單倍型，可結(jié)合中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)網(wǎng)站鑒定，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)樣品中并沒有北沙參種子混偽品出現(xiàn)，從而系統(tǒng)地完成各序列的鑒定?！吨袊幍渲兴幉腄NA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列》與中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)網(wǎng)站的結(jié)合應(yīng)用簡便準(zhǔn)確，給中藥材種子鑒定提供了新方法。序列比對中66條序列中只有2條序列分別各有1處多拷貝位點(diǎn)，可見ITS2條形碼鑒定北沙參種子種內(nèi)變異小，遺傳穩(wěn)定性高，新增變異位點(diǎn)的出現(xiàn)在一定程度上豐富了北沙參條形碼序列數(shù)據(jù)庫，為后續(xù)北沙參遺傳多樣性研究提供參考數(shù)據(jù)。

3.2 DNA條形碼技術(shù)可用作中藥材種子鑒定的通用方法

研究發(fā)現(xiàn)，目前對中藥材種子的鑒定，主要有性狀、顯微、理化和現(xiàn)代生物學(xué)鑒定法等[9-13]。這些方法在長期中藥材種子鑒定工作中發(fā)揮了重要作用，但各自又有一定的局限性，如易受研究者專業(yè)經(jīng)驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)設(shè)備條件、生物物種特異性等因素的影響。DNA條形碼技術(shù)以中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)為核心，無過高的專業(yè)經(jīng)驗(yàn)要求，所用實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡單且不受物種形態(tài)、性狀、成分等的限制，鑒定準(zhǔn)確，通用性高，關(guān)于DNA條形碼在相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用，辛天怡等[14]做了詳細(xì)綜述。此外，《中藥DNA條形碼分子鑒定》、《中國藥典中藥材DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列》等基于條形碼技術(shù)對物種鑒定參考書目的出現(xiàn)，也充分說明DNA條形碼鑒定的可靠性與通用性[15，8]。本研究是將條形碼技術(shù)運(yùn)用到中藥材種子鑒定中，目前，我國中藥材種子主要依托于已批準(zhǔn)的17個(gè)中藥材專業(yè)市場作為收售渠道，缺少對應(yīng)的監(jiān)管部門，大多數(shù)中藥材種子質(zhì)量檢驗(yàn)以農(nóng)作物種子標(biāo)準(zhǔn)作為參照。這種無質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可依、缺乏正規(guī)監(jiān)管的種子市場勢必給中藥材生產(chǎn)及臨床用藥安全帶來隱患，影響中藥材在國內(nèi)外市場的聲譽(yù)[16，17]。本研究運(yùn)用DNA條形碼成功鑒定北沙參種子，是中藥材種子鑒定新方法的成功應(yīng)用，可以為今后條形碼技術(shù)作為中藥材種子鑒定的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，以及全國中藥材種質(zhì)資源管理提供參考依據(jù)。

3.3 北沙參基因組內(nèi)多拷貝問題的探討

利用DNA條形碼技術(shù)，經(jīng)雙向測序分別在兩粒樣品中各發(fā)現(xiàn)一處多拷貝位點(diǎn)（T/G、A/G），經(jīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)并非由實(shí)驗(yàn)或測序等過程中的錯(cuò)誤造成，初步確定為北沙參基因組內(nèi)多拷貝，為北沙參基因組內(nèi)遺傳變異。在大多數(shù)物種中，由于經(jīng)歷了一致性進(jìn)化， 具有主導(dǎo)拷貝變異類型，但也有例外情況，例如：Ma等[18]對同一居群內(nèi)29個(gè)樣品的ITS序列進(jìn)行克隆研究，在獲得的102個(gè)克隆中共發(fā)現(xiàn)773變異位點(diǎn)分布 在ITS2區(qū)段，并指出這種基因水平的多態(tài)性與自身生理特征、自身進(jìn)化、環(huán)境因素等有關(guān)。Song等[19]利用高通量測序方法對178個(gè)物種基因組內(nèi)ITS2序列的多拷貝情況進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)平均每個(gè)物種有35個(gè)變異類型，3個(gè)主導(dǎo)變異類型，這3個(gè)主導(dǎo)變異類型的拷貝數(shù)占全部拷貝數(shù)的91%。進(jìn)一步研究表明，盡管ITS2基因組內(nèi)變異頻繁，多數(shù)情況下，僅依靠主導(dǎo)變異即可完成系統(tǒng)發(fā)育和物種水平的鑒定，次要和稀有變異可提高分辨能力。本研究中的北沙參種子為不同地區(qū)收集種子，遺傳變異位點(diǎn)的出現(xiàn)是否與產(chǎn)地的環(huán)境差異、長期不同區(qū)域間的引種栽培有關(guān)還需進(jìn)一步研究。在后期進(jìn)化中，是否會有北沙參變種出現(xiàn)，這種變異會對北沙參物種產(chǎn)生什么樣的影響等問題都值得深入探討。

1 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部).北京:中國醫(yī)藥科技出版社, 2015∶ 100.

2 傅立國.中國植物紅皮書——稀有瀕危植物.北京:科學(xué)出版社1993∶ 698.

3 徐祝封,張欽德,李慶典,等.北沙參道地產(chǎn)區(qū)種子生產(chǎn)、種苗培育現(xiàn)狀調(diào)查與分析.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 30(6)∶ 493-496.

4 陳士林,姚輝,韓建萍,等.中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則.中國中藥雜志, 2013(2)∶ 141-148.

5 國家技術(shù)監(jiān)督局. GB/T 3543.7-1995農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程:其他項(xiàng)目檢驗(yàn),北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 1996∶ 95-96.

6 Chen S L, Yao H, Han J P, et al. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species. PLoS ONE, 2010, 5 (1)∶ e8613.

7 Keller A, Schleicher T, Schultz J, et al. 5.8S-28S rRNA interaction and HMM-based ITS2 annotation. Gene, 2009, 430∶ 50-57.

8 陳士林.中國藥典中藥材DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列.北京:科學(xué)出版社, 2015∶ 163-164.

9 韋穎. 105種常用藥用植物果實(shí)、種子性狀與顯微鑒別特征研究.北京:中國中醫(yī)科學(xué)院, 2012∶ 33-271.

10 高飛燕.種子類中藥微性狀鑒定法研究.合肥:安徽中醫(yī)藥大學(xué)碩士學(xué)位論文, 2013∶ 11-63.

11 張玉杰,張建軍,閆興麗,等.不同產(chǎn)地正偽品沙苑子HPLC指紋圖譜鑒別研究.中國中藥雜志, 2003, 28(9)∶ 30-32, 71.

12 張瓊光,陳科力,王克勤.厚樸兩種類型種子的電泳鑒別.時(shí)珍國醫(yī)國藥, 2003, 28(9)∶ 541-542.

13 鄭海燕.利用RAPD、ISSR和SRAP標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建紅麻(Hibiscus cannabinus L.)種質(zhì)資源分子身份證.北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文, 2010∶ 10-40.

14 辛天怡,雷美艷,宋經(jīng)元.中藥材DNA條形碼鑒定研究進(jìn)展.中國現(xiàn)代中藥, 2015, 17(2)∶ 170-176.

15 陳士林.中藥DNA條形碼分子鑒定.北京:人民衛(wèi)生出版社, 2012∶ 1-568.

16 寧書菊,魏道智.關(guān)于我國中藥材種子產(chǎn)業(yè)的思考.中國種業(yè), 2013, 3∶ 3-4.

17 邵長勇,尤泳,王光輝,等.安國中藥材種子種苗產(chǎn)業(yè)發(fā)展中的現(xiàn)代物理技術(shù)應(yīng)用.種子, 2013, 32(12)∶ 70-72,75.

18 Ma X C, Xie C X, Guan M, et al. High levels of genetic diversity within one population of Rheum tanguticum on the Qinghai-Tibet Plateau have implications for germplasm conservation. Pharm Crops, 2014, 5∶ 1.

19 Song J Y, Shi L C, Li D Z, et al. Extensive pyrosequencing reveals frequent intragenomic variations of internal transcribedspacer regions of nuclear ribosomal DNA. PLoS ONE, 2012, 7(8)∶ e43971.

Identification of the Seeds of Glehniae Radix with DNA Barcoding Method

Zhang Gaixia1,2, Jin Yue2, Jia Jing2, Shi Linchun2, Sun Zhiying1
(1. College of Chinese Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China; 2. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100193, China)

In this study, a new technique was adopted to discriminate and ensure the pure sources of the seeds of Glehniae Radix. The morphological characteristics of the seeds from different habitats had been first surveyed. Then the DNA extraction, PCR amplification, DNA sequencing and assembly were carried out. Species identification for each sample was implemented through the DNA barcoding system of traditional Chinese medicine (http://www.tcmbarcode.cn). The results showed that sixty-four sequences were genuinely based on “Standard DNA Barcodes of Chinese Materia Medica in Chinese Pharmacopoeia”, and two samples contained SNP loci. The identification results referred to Glehniae Radix of all sequences according to the DNA barcoding system. In conclusion, DNA barcoding technique was suitable for the identification of the seeds of Glehniae Radix, which provided a new method for identification of the seeds of Chinese herbal medicines. The finding of SNP loci also furnished with a reference for studies on the variety diversity of Glehniae Radix.

Glehniae Radix, Chinese herbal seeds, ITS2, molecular identification

10.11842/wst.2016.02.006

R282.5

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷 張志華，責(zé)任譯審：朱黎婷 王 晶）

2015-11-29

修回日期：2015-12-01

＊ 科學(xué)技術(shù)部國家科技支撐計(jì)劃子課題(2011BAI07B08)：中藥種子種苗 DNA條形碼鑒定及流通管理平臺的建立，負(fù)責(zé)人：陳士林；山東省教育廳高等學(xué)校科技計(jì)劃項(xiàng)目(J12LM05)：基于DNA條形碼技術(shù)的山東省珍稀瀕危特有野生藥用植物資源研究，負(fù)責(zé)人：孫稚穎。

＊＊ 通訊作者：石林春，副研究員，主要研究方向：中藥鑒定學(xué)；孫稚穎，副教授，主要研究方向：藥用植物資源與分類鑒定。