趙艷飛, 馬愛軍, 王新安, 孫志賓, 溫海深

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卵生型魚類卵子發(fā)育潛能評估研究進(jìn)展

趙艷飛1, 2, 3, 馬愛軍2, 3, 王新安2, 3, 孫志賓2, 3, 溫海深1

(1. 中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 山東青島 266003; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室青島市海水魚類種子工程與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東青島266071; 3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室, 山東青島 266071)

魚類卵子發(fā)育潛能(即卵子質(zhì)量)是繁育工作所用卵子好壞的直接體現(xiàn)。雌性親魚性成熟過程中, 卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)的積累及其正常減數(shù)分裂過程極易受外界環(huán)境影響, 進(jìn)而使親魚所產(chǎn)卵子可發(fā)育能力往往有較大波動, 故提前預(yù)測親魚所產(chǎn)卵子的發(fā)育潛能, 將對苗種繁育的風(fēng)險(xiǎn)防范及育苗產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展帶來積極影響。文章敘述了卵子及其成分特征, 從卵子外形、卵質(zhì)脂肪酸、氨基酸、蛋白、酶活等生化組成以及母源性RNA等角度對卵子質(zhì)量研究現(xiàn)狀做了概括, 并對各自研究中存在的問題進(jìn)行探討。綜上所述, 從形態(tài)、脂肪酸、遺傳物質(zhì)等綜合方面對卵質(zhì)進(jìn)行分析并建立其多元回歸模型, 將有助于找出影響卵質(zhì)因素的關(guān)鍵信息; 同時(shí)將卵質(zhì)研究與家系構(gòu)建相結(jié)合, 后續(xù)跟蹤、統(tǒng)計(jì)仔稚魚至商品魚這一生長階段的生長參數(shù), 進(jìn)行遺傳評估, 并最終確立具有最大經(jīng)濟(jì)效益的卵子參數(shù), 才是目前經(jīng)濟(jì)魚類卵質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)研究需加強(qiáng)的方向。該研究將為今后卵生型魚類卵子發(fā)育潛能預(yù)測方法研究提供科學(xué)依據(jù), 同時(shí)為魚類繁育工作風(fēng)險(xiǎn)預(yù)判提供具實(shí)踐性的方法資料。

卵子; 發(fā)育潛能; 生化組成; 卵生型魚類; 繁育

苗種繁育是魚類養(yǎng)殖工作的起始, 也是后續(xù)幼魚生長發(fā)育好壞的關(guān)鍵, 其影響著養(yǎng)殖群體死亡率、生長速度、環(huán)境耐受性及后來的商品魚口感、外觀等一系列性狀。繁育工作起始階段, 決定苗種質(zhì)量、繁育工作成敗的直接因素有兩點(diǎn): (1)親魚健壯與否; (2)受精、孵化所用卵子發(fā)育潛能。魚類卵子發(fā)育潛能又稱卵子質(zhì)量: 即卵子受精及合子經(jīng)過一系列分化發(fā)育成健康仔魚的能力。在魚類野生及養(yǎng)殖群體中, 卵子發(fā)育潛能受多種因素影響, 親魚培育期間光照強(qiáng)度、放養(yǎng)密度、水溫、鹽度、溶氧量、營養(yǎng)攝取、水流變動、催產(chǎn)藥物劑量的不穩(wěn)定[1-4], 均可致使親魚所產(chǎn)卵子質(zhì)量產(chǎn)生波動, 苗種繁育工作也將受其影響。因此, 卵子質(zhì)量研究引起越來越多的重視。

目前已知影響卵子發(fā)育潛能的因素只有很少一部分, 且其中關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜, 未來仍需大量研究。為此, 從卵子結(jié)構(gòu)特征、胚胎發(fā)育角度簡單敘述了卵質(zhì)成分在胚胎發(fā)育中的重要作用; 從形態(tài)、生化、分子等方面對魚類卵子發(fā)育潛能評估已有研究做了歸納、概括; 對存在的問題和需進(jìn)一步研究做出總結(jié)并進(jìn)行展望。以期為以后尋找可靠、操作簡單、可早期評估的卵子質(zhì)量評估方法, 進(jìn)一步提高魚類繁育質(zhì)量, 提供具實(shí)踐性的背景資料。

1 魚類卵子特征和胚胎發(fā)育

魚類生殖方式大多為卵生型, 少數(shù)種類卵胎生。對于卵生型魚類, 卵母細(xì)胞經(jīng)過長期發(fā)育, 積累了大量的營養(yǎng)、遺傳物質(zhì), 一旦卵子排出雌魚體外, 其受精后的整個(gè)胚胎發(fā)育過程所需的蛋白、脂質(zhì)、糖類、維生素等幾乎所有物質(zhì)均由卵子自身提供, 此階段僅從外界獲取少量水、無機(jī)鹽。因此, 卵內(nèi)營養(yǎng)、遺傳物質(zhì)的充足與否直接決定著其未來胚胎的健康發(fā)育水平。

大多數(shù)魚類卵子呈圓球形或橢球形, 少數(shù)魚類因其卵子外在卵膜具有不同特征, 使其卵子外觀呈現(xiàn)不同的形狀。魚類卵子也具有一般細(xì)胞結(jié)構(gòu), 即細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞膜3個(gè)主要部分, 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)除各種細(xì)胞器外, 還含有大量營養(yǎng)物質(zhì)并形成以蛋白質(zhì)為主的卵黃囊和脂質(zhì)為主的油球。魚類早期胚胎發(fā)生和發(fā)育所需的營養(yǎng)和功能性物質(zhì), 如碳水化合物、氨基酸、脂質(zhì)、維生素、磷、硫及微量元素等主要貯存在卵細(xì)胞中的卵黃蛋白上, 是保證胚胎繼續(xù)發(fā)育的基礎(chǔ)性營養(yǎng)物質(zhì)。作為卵質(zhì)主成分, 卵黃蛋白主要由卵黃脂磷蛋白(lipovitellin, Lv)、卵黃高磷蛋白(phosvitin, Pv)及一些其他小分子多肽組成[5]。Lv富含碳水化合物和脂質(zhì)是一種糖脂蛋白[6], 通常以二聚體或多聚體形式存在, 大小在300~500 kDa[7], 對不同種屬魚類研究顯示, Lv在魚類卵子中具有種間差異[8-10], 同時(shí)其在胚胎發(fā)育中也起著重要的免疫作用[11], Pv也是一種糖蛋白, 其與Lv均具有強(qiáng)的金屬螯合作用, Lv儲存著足夠的Zn2+并供應(yīng)給胚胎發(fā)育, 這有效防止了胚胎發(fā)育畸形[12], Pv的強(qiáng)螯合作用也可幫助胚胎轉(zhuǎn)運(yùn)Ca2+、Mg2+、Fe3+等金屬離子[13]。此外, 卵黃蛋白在調(diào)節(jié)卵內(nèi)滲透壓、卵子沉浮性方面發(fā)揮著重要作用[14]。因此卵黃蛋白在魚類胚胎發(fā)育、孵化及仔魚存活、生長方面起著至關(guān)重要的影響, 可作為判斷卵子發(fā)育潛力的有效指標(biāo)。卵內(nèi)細(xì)胞核又稱卵核, 位于卵子動物極, 與普通細(xì)胞核結(jié)構(gòu)類似。卵子細(xì)胞膜又稱卵膜, 由初級卵膜、次級卵膜構(gòu)成, 初級卵膜又稱卵黃膜, 為胚胎發(fā)育與外界進(jìn)行物質(zhì)交換提供保障, 根據(jù)卵子初級卵膜的透明程度可把卵子分為透明卵和不透明卵; 次級卵膜又稱絨毛膜, 一般具有黏性, 其形態(tài)各異, 決定著卵子的黏性與外形, 另外軟骨魚類還有三級卵膜, 對卵子起著保護(hù)作用。

卵子入水后即吸水硬化[15], 自其正常的卵裂開始, 直至囊胚中期階段, 這一過程中新陳代謝所需氨基酸、脂類、糖、維生素、激素及其代謝活動必不可少的酶類、mRNA、rRNA等所有營養(yǎng)、遺傳物質(zhì)均由卵子內(nèi)母源性物質(zhì)直接提供[16], 自此后胚胎才開始啟動自身遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄、翻譯, 這使得一部分未受精卵也能自行發(fā)育到囊胚期階段, 這一現(xiàn)象又稱為中囊胚過渡[17], 因此養(yǎng)殖一線技術(shù)人員常依據(jù)可發(fā)育到原腸中期階段的胚胎比例來判斷卵子受精率。激素在胚胎發(fā)育中起著重要作用, 但魚類在胚胎及其仔魚階段激素合成能力十分有限, 因此其自身發(fā)育所需激素主要靠卵子自身攜帶及仔魚通過攝食補(bǔ)給[18]。對胚胎發(fā)育過程中激素含量變化研究顯示, 合子開始孵化后, 卵內(nèi)母源性甲狀腺激素含量逐漸降低, 部分激素含量可維持到早期發(fā)育階段, 自身激素的合成過程待卵黃吸收將盡時(shí)才開始啟動[19], 相似的是, 卵內(nèi)皮質(zhì)醇含量在胚胎期也出現(xiàn)急劇下降[20], 此外卵內(nèi)還存在性類固醇等多種激素[21], 但目前對其在胚胎發(fā)育中所起功能仍不清楚, 未來對胚胎激素功能性研究將有助于進(jìn)一步了解魚類胚胎發(fā)育機(jī)制。

2 卵子發(fā)育潛能評估

魚類合子形成及胚胎發(fā)育機(jī)制決定了配子內(nèi)不同物質(zhì)在胚胎發(fā)育階段起著各自作用。卵子為魚類胚胎發(fā)育提供了幾乎所有的物質(zhì)基礎(chǔ)和初期發(fā)育平臺, 其直接決定了受精率、孵化率和胚胎畸形率, 并對未來仔魚正常發(fā)育起著重要作用。本節(jié)分別從形態(tài)學(xué)、生化、胚胎卵裂等方面總結(jié)了目前對卵子發(fā)育潛能研究現(xiàn)狀。

目前已有研究大致從卵子物理形態(tài)學(xué)、營養(yǎng)成分、代謝酶活性及卵巢液生化成分角度研究了與其受精率和胚胎孵化及仔魚發(fā)育能力的關(guān)系。

2.1 卵子物理形態(tài)特征

魚類生長、繁殖所處環(huán)境及方式多種多樣, 不同種類魚所產(chǎn)卵子的大小、沉浮性、卵內(nèi)油球形態(tài)等外觀特征也不盡相同。目前通過卵子外在特征對多種種屬魚的卵質(zhì)研究主要在以下幾個(gè)方面:

2.1.1 卵子大小的變化及其與卵質(zhì)關(guān)系

通常研究認(rèn)為, 同種親魚所產(chǎn)卵子中, 卵徑較大的卵子通常含有更多的營養(yǎng)物質(zhì), 并可孵化出更大的仔魚和保證更高的孵化成功率[22]。卵子大小在不同物種及不同種群間均有變化, 從進(jìn)化角度分析, 在不同時(shí)間和空間、生境中適合仔魚攝取的餌料大小出現(xiàn)差異, 捕食者對卵子、初孵仔魚也出現(xiàn)一定的選擇性, 這些因素使得只有具有一定大小的卵子和仔魚存活下來, 長時(shí)間的定向選擇導(dǎo)致了不同生境下物種、種群表現(xiàn)出各異的卵子大小[23]。在種群內(nèi)部, 因親魚不同、環(huán)境變化及產(chǎn)卵時(shí)期不同, 卵子大小也有波動[24]。有研究認(rèn)為, 個(gè)頭較大的親魚通常產(chǎn)較大的卵子[25], Gall[26]對人工培育的虹鱒()親魚卵子研究也表明, 年齡、體質(zhì)量更大的親魚所產(chǎn)卵子也更大。同時(shí)卵子大小還受親魚培育期間營養(yǎng)水平[27]、產(chǎn)卵批次的影響, 比如在克鯉()產(chǎn)卵期[28], 隨著親魚多次產(chǎn)卵, 其卵巢內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗, 導(dǎo)致其所產(chǎn)后一批次卵子通常因營養(yǎng)物質(zhì)的不足而體積更小, 進(jìn)而影響其受精率與胚胎發(fā)育。Bozkurt[29]等研究顯示, 在受精率介于72%~80%的鮭鱒()受精卵中, 受精率與卵子直徑顯著正相關(guān)(=0.459,>0.01)。但卵子并不是越大越好[22], Forés[30]等研究顯示, 大菱鲆()卵徑在0.9~1.1 mm比1.1 ~1.2 mm時(shí)具有更高的受精率。雷霽霖等[31]也對大菱鲆卵子形態(tài)進(jìn)行了研究, 發(fā)現(xiàn)卵徑為 0.98 mm左右時(shí), 大菱鲆卵子具有更好的活力。因而利用卵子大小評價(jià)其受精率具有很大局限性。有研究顯示, 較大的卵子可孵化出較大的仔魚[22], Moodie等[32]對大眼鲇()研究認(rèn)為較大卵子孵化出的仔魚具有更高的發(fā)育速度。由此可知, 隨著魚類卵子直徑等表觀參數(shù)的變化, 卵子質(zhì)量的波動規(guī)律有著種屬差異性。從卵子表觀參數(shù)方面評價(jià)不同種屬魚類卵子質(zhì)量時(shí), 采用不同的評價(jià)方法對不同種屬魚類的卵子質(zhì)量進(jìn)行評估, 才能使卵子直徑成為多種魚類卵子質(zhì)量評價(jià)的可靠指標(biāo)。

2.1.2 卵子沉浮性及其與卵質(zhì)關(guān)系

不同種類魚的卵子在其孵化水體中分布的水層也會不同。如大菱鲆、鮐魚()、藍(lán)圓鲹()、鳀魚()等[33]魚類活性卵子在各自適合水體中上浮分布, 稱為浮性卵; 而對于如紅鰭東方鲀()、鱸鯉()[34]、大瀧六線魚()[35]及鮭鱒魚等魚類卵子在其孵化水體中沉于底層, 稱為沉性卵; 流水中常懸浮于水中孵化的魚卵則稱為半浮性卵, 如興凱湖翹嘴鲌()[36]。Aristizabal等[37]對阿根廷紅鯛()研究顯示, 其胚胎孵化率、仔魚存活率均與卵子浮性呈顯著相關(guān), 同時(shí)Kohn等[38]也支持這一觀點(diǎn), 在其研究中顯示出浮卵率與胚胎孵化率(2=0.22,<0.05)、仔魚存活率(2=0.18,<0.05)均呈顯著相關(guān)。雷霽霖等[39]認(rèn)為大菱鲆優(yōu)良受精卵的典型特征為透明、渾圓, 卵周隙小。Forés等[30]制定了大菱鲆卵子質(zhì)量的鑒定標(biāo)準(zhǔn), 其中認(rèn)為具有高、中等上浮率是成為高受精率卵子的條件之一。另長期生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)表明, 紅鰭東方鲀等魚所產(chǎn)沉性卵在孵化水體中, 沉于水底的卵子往往卵膜完整、卵黃豐富, 浮于上層卵子往往是卵膜已殘缺的壞卵。解涵[40]認(rèn)為, 卵的沉浮性與其內(nèi)部油球比重、卵周隙大小有關(guān), 浮性卵常有一個(gè)較大油球或多個(gè)小油球, 卵內(nèi)卵周隙也較大, 從而使其密度降低, 而沉性卵內(nèi)油球、卵周隙往往較小或沒有。這可能是經(jīng)過長期自然選擇, 卵子正常發(fā)育所需溫度、溶氧、光照等環(huán)境因素逐步與其相適應(yīng)的水下分層吻合所致。因此卵子沉浮性在一定程度可作為評價(jià)卵子質(zhì)量的參考指標(biāo)。

2.1.3 卵膜完整性鑒定及卵子活力率判斷

卵膜作為卵子維持自身空間形態(tài)和與外界物質(zhì)選擇性交換的保障, 其完整性對卵子活性至關(guān)重要。Omnes等[41]利用觀察卵形態(tài)特征和染色檢測技術(shù)對大菱鲆卵子外膜完整性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn), 利用中性紅(neutral red, 可發(fā)育細(xì)胞被染成紅色, 非發(fā)育細(xì)胞不能被染成紅色)和臺盼藍(lán)(trypan blue, 染料不能滲透可發(fā)育細(xì)胞, 死細(xì)胞則被染色)兩種染料可準(zhǔn)確評估卵子外膜完整性, 進(jìn)而確定卵子活力率。

2.1.4 卵內(nèi)油球形態(tài)特征及其與卵質(zhì)關(guān)系

物理外觀上, 紅鰭東方鲀、小體鱘(Linnaeus)等魚類卵子在其卵膜表面覆蓋一層不透明粘液或絲狀纖維質(zhì)成分, 使得卵膜較厚, 透明程度較低, 雖然隨胚胎發(fā)育過程卵膜逐漸變薄[42], 但總體透明度低, 不易用光學(xué)顯微鏡直接觀察其內(nèi)部形態(tài)結(jié)構(gòu), 因而難以通過諸如卵內(nèi)部油球分布等內(nèi)部形態(tài)對其質(zhì)量評判。有些魚類諸如金頭鯛()、虹鱒等魚卵子卵膜較薄, 透明度較高, 用光學(xué)顯微鏡可直接從油球形態(tài)等內(nèi)部結(jié)構(gòu)角度進(jìn)行觀察并做出卵子發(fā)育可行性預(yù)測。

根據(jù)卵內(nèi)油球的有無可把魚卵分為有油球卵和無油球卵。黃海大頭鱈()[43]、條斑星鰈()[44]、星斑川鰈()[45]等魚類所產(chǎn)卵子內(nèi)部無油球, 便是無油球卵; 而對于較透明、油球豐富的魚類卵子, 常通過觀察卵內(nèi)油球大小、數(shù)量、分布特征對卵子的可發(fā)育能力做出預(yù)測。Lahnsteiner等[46]通過對金頭鯛、尖吻鯛()卵子內(nèi)部油球進(jìn)行觀察、測量發(fā)現(xiàn), 其卵內(nèi)最大油球徑與最小油球徑的比值、油球形態(tài)均與仔魚存活率相關(guān)。Mansour等[47]對褐鱒()卵子觀察發(fā)現(xiàn), 其卵子內(nèi)部油球分布與胚胎發(fā)育能力顯著相關(guān), 并可將卵內(nèi)油球分布特征作為預(yù)測卵子質(zhì)量的可靠方法。同時(shí)Asturiano[48]對鱸科(Percoidea)魚類親魚投喂不同種類餌料后發(fā)現(xiàn), 餌料種類可影響親魚所產(chǎn)卵內(nèi)油球大小, 并進(jìn)一步影響卵子活力。因此在苗種繁育中, 或可通過調(diào)節(jié)親魚餌料種類來人為控制卵內(nèi)油球含量。然而, 近來對人工培育虹鱒魚研究中, 尚無跡象表明卵子質(zhì)量與卵內(nèi)油球分布存在關(guān)聯(lián)[49], 與此相似的是, Kohn[38]對尖頜多鋸鯛()的研究也顯示, 其卵子內(nèi)部油球直徑與卵子孵化率、幼體存活率均無相關(guān)性。故目前通過卵內(nèi)油球形態(tài)分布等參數(shù)來評估卵子質(zhì)量僅適用于透明卵, 受種屬局限性也很大, 且單純采用卵子卵徑、油球分布、沉浮性等外觀參數(shù)很難說明內(nèi)部問題, 將其與卵子內(nèi)部相應(yīng)生化參數(shù)結(jié)合分析或能更可靠地反映出卵子優(yōu)劣。

2.2 卵子生化特征

除通過卵子外在特征對其質(zhì)量進(jìn)行評判外, 從卵子內(nèi)部生化特征預(yù)測其發(fā)育潛能已經(jīng)成為目前卵質(zhì)評估的主要研究方向。作為胚胎發(fā)育營養(yǎng)平臺, 卵子內(nèi)卵黃蛋白、脂質(zhì)、糖、酶活等物質(zhì)成分對卵質(zhì)起著基礎(chǔ)性作用。大量研究表明, 卵內(nèi)多種生化成分對合子形成、胚胎發(fā)育及其后來子稚魚生長起著重要作用。

2.2.1 卵內(nèi)碳水化合物代謝及其與卵質(zhì)關(guān)系

Lahnsteiner[50]對3種海洋魚類卵子研究發(fā)現(xiàn), 九帶()、緋鯢鰹)和金頭鯛未受精卵內(nèi)的糖類代謝過程相似, 從卵泡發(fā)生到卵子成熟過程, 糖酵解持續(xù)穩(wěn)定, 但糖異生作用和戊糖磷酸途徑活動減弱; 未受精卵到合子第一次卵裂期間, 糖代謝參數(shù)相似; 在之后的卵裂階段, D-甘油-2-磷酸水平降低, 己糖、酮糖、核糖等開始升高。Lahnsteiner等[51-52]研究指出, 碳水化合物的正常代謝為保證卵裂的正常進(jìn)行起著關(guān)鍵性作用。因此, 從與糖代謝過程有關(guān)的反應(yīng)物、生成物、酶活力等生化參數(shù)角度進(jìn)行卵子質(zhì)量分析有著重要意義。賈玉東[53]認(rèn)為, 大菱鲆卵子和卵巢液中堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活力同受精率存在著顯著相關(guān), 其活力變化在一定程度上反映著卵子質(zhì)量的優(yōu)劣, 并可作為評判卵子質(zhì)量的輔助指標(biāo)。Lahnsteiner等[54]對4種不同魚類研究發(fā)現(xiàn), 其受精率與卵內(nèi)蘋果酸脫氫酶、丙酮酸激酶活性顯著相關(guān), 與果糖、葡萄糖、半乳糖沒顯示出相關(guān)性; 其后Lahnsteiner[52]、Giménez[55]對鯛科魚類研究中顯示, 葡萄糖-6-磷酸酶、轉(zhuǎn)醛醇酶、酸性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸和自由單糖對胚胎孵化率存在顯著相關(guān)。Terner[56]、Mommsen[57]等也從果糖、半乳糖、葡萄糖、糖原、乳酸、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶等糖代謝途徑關(guān)鍵性生化指標(biāo)角度對魚類未受精卵質(zhì)量進(jìn)行了分析。有研究從多個(gè)糖代謝生化指標(biāo)對鯛科()魚類卵質(zhì)分析并建立多元回歸模型, 結(jié)果顯示其與胚胎、仔魚存活率顯著相關(guān)[52], 這顯示了多元回歸模型在卵質(zhì)評價(jià)中的運(yùn)用價(jià)值。

2.2.2 卵內(nèi)脂質(zhì)種類特征及其與卵質(zhì)關(guān)系

卵內(nèi)脂質(zhì)是構(gòu)成卵膜的重要組分, 也是卵子儲存能量的物質(zhì), 常以油球形式存在于卵內(nèi)。脂肪酸可通過b-氧化等方式參與卵內(nèi)代謝, 有研究指出, 非酯化脂肪酸與肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶活性呈正相關(guān)(2= 0.448,<0.001)[58]。Jia等[59]對大菱鲆卵子研究得出, 卵子脂肪酸含量與其活力率存在顯著正相關(guān)。Lahnsteiner[54]認(rèn)為, 卵內(nèi)脂肪酸含量的變化對鯉科魚類受精率無顯著影響, 但當(dāng)湖紅點(diǎn)鮭()卵內(nèi)非酯化脂肪酸含量不小于72.34 μg/mg時(shí), 其發(fā)眼期胚胎存活率可達(dá)80%[60], Pickova[61]、Bell等[62-64]在魚類卵內(nèi)脂質(zhì)研究中也得出相似結(jié)論, 研究人員進(jìn)一步對虹鱒魚過熟卵進(jìn)行分析得出, 過熟卵子內(nèi)部脂肪酸含量明顯降低, 而卵巢液中脂肪酸含量卻顯著升高[3], 這可能和卵膜完整性有關(guān), 但上述結(jié)果在真鯛卵質(zhì)研究中卻沒能得到驗(yàn)證[55]。Aristizabal等[37]從親魚餌料角度對阿根廷紅鯛研究中也得出與真鯛相似結(jié)論, 這可能因鯛科魚類卵內(nèi)已具有充足脂類物質(zhì), 卵內(nèi)脂肪酸差異很難表現(xiàn)在隨后胚胎發(fā)育中。Mansour等[65]對冷水魚類北極紅點(diǎn)鮭()卵子脂肪酸分析顯示, 卵內(nèi)絨毛膜所含短鏈飽和脂肪酸越少, 其受精率越高, 這也正好與紅點(diǎn)鮭所處環(huán)境相適應(yīng), 使其更適應(yīng)低溫環(huán)境。因此, 從卵內(nèi)脂肪酸等成分判斷卵子質(zhì)量具有種屬差異性, 不同的魚類應(yīng)研究出各自的卵質(zhì)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

2.2.3 卵內(nèi)蛋白成分研究及其與卵質(zhì)關(guān)系

在魚類胚胎發(fā)育和發(fā)生的早期階段, 其主要依靠母源性卵黃蛋白來提供營養(yǎng)物質(zhì), 作為卵內(nèi)碳水化合物、氨基酸、脂質(zhì)、維生素、磷、硫及微量元素的載體[66], 卵黃蛋白對魚類胚胎的生長發(fā)育起著至關(guān)重要的作用。卵黃蛋白的主要組分為卵黃蛋白原(Vitellogenin, Vg)、酶解產(chǎn)生的卵黃脂磷蛋白(Lipovitellin, Lv)、卵黃高磷蛋白(Phosvitin, Pv)及其他一些小分子多肽[67], Lv可為胚胎發(fā)育提供Zn2+, Zn2+對胚胎發(fā)育至關(guān)重要, 缺乏時(shí)可導(dǎo)致胚胎畸形, 有研究證明, 在非洲爪蟾()和雞卵內(nèi), 卵黃中的Lv負(fù)責(zé)在卵子發(fā)生和胚胎發(fā)育時(shí)期Zn2+的儲存與供應(yīng)[67, 12]。此外, Vg不僅可為卵母細(xì)胞的生長及受精卵發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì), 還有著重要的免疫防護(hù)作用[11, 68], 故可推測出胚胎中Pv、Lv在胚胎發(fā)育中起著一定的免疫作用, 而后對斑馬魚()胚胎的研究證實(shí)了這一點(diǎn)[69]。Zhang等[70]發(fā)現(xiàn), 玫瑰無須鲅()中的Lv可參與非己識別, Sattar等[71]也證明雞體內(nèi)的Pv也具有一定殺菌作用。因此, 從卵黃蛋白角度出發(fā)研究魚類卵子孵化過程中的抗病性及可發(fā)育能力具有一定價(jià)值。研究者在鱸科魚類卵子研究中發(fā)現(xiàn), 其好卵與壞卵具有不同的蛋白表達(dá)水平[72]。Samaee等[73]對鯛科魚類卵子研究發(fā)現(xiàn), 卵內(nèi)卵黃蛋白含量與卵子活力率顯著相關(guān), 且蛋白水解產(chǎn)物量與卵孵化率、仔魚存活率亦呈現(xiàn)一定相關(guān)性。Lahnsteiner等[60]對湖紅點(diǎn)鮭卵巢液分析顯示, 卵巢液中的pH、蛋白濃度、谷草轉(zhuǎn)氨酶活力等生化指標(biāo)與發(fā)眼期胚胎存活率高度相關(guān), 這一結(jié)果與虹鱒[3]相似。大菱鲆[74]產(chǎn)卵期內(nèi), 卵巢的pH為8.2時(shí), 卵的成活率為100%, 但當(dāng)pH為7.3時(shí), 成活率則為0。這是因過熟卵子卵膜損壞, 卵內(nèi)蛋白成分外泄入卵巢液中, 導(dǎo)致卵巢液pH下降、蛋白水平升高。此外, 卵巢液生化參數(shù)只可反應(yīng)卵子過熟, 沒有結(jié)果顯示其與胚胎孵化率存在相關(guān)性[75]。卵內(nèi)自由氨基酸在氨基酸代謝中扮演著重要角色, 其種類、含量均可在一定程度反映出胚胎孵化率及幼體存活率的高低[76]。依此可知, 卵黃蛋白對卵子受精、孵化發(fā)育起著重要作用, 目前僅個(gè)別海水魚類卵黃蛋白代謝及生理機(jī)能得到研究, 以后還需對多種魚類卵黃蛋白結(jié)構(gòu)、功能進(jìn)行進(jìn)一步研究, 這將有助于深入了解魚類的卵子形成過程及胚胎發(fā)育過程中多種蛋白的參與機(jī)制, 以便為魚類卵質(zhì)調(diào)控及評價(jià)提供理論依據(jù)。

2.3 胚胎卵裂特征

自Kj?rsvik等[77]首先提出后, 對于卵膜較透明的魚卵, 通過觀察其胚胎發(fā)育過程內(nèi)部卵裂特征來判斷胚胎發(fā)育能力, 漸漸成為評估早期胚胎發(fā)育能力的方法之一[61, 78-81]。對于正常卵裂模式, 卵子經(jīng)過受精成為合子后, 經(jīng)過一系列有絲分裂而形成分裂球, 分裂球內(nèi)細(xì)胞呈對稱規(guī)則分布, 在分裂過程中內(nèi)部細(xì)胞逐漸變小, 但分裂球大小始終變化不大, 至4~5次卵裂后卵裂球?qū)ΨQ性逐漸消失, 此時(shí)開始, 卵裂特征作為胚胎質(zhì)量評估標(biāo)準(zhǔn)的可靠性也逐步下降。雷霽霖[39]認(rèn)為, 大菱鲆卵子在受精后的第1、2次分裂后, 分裂球內(nèi)細(xì)胞清晰對稱, 則說明此批卵受精率和孵化率高。合子在卵裂過程中因自身營養(yǎng)不足或外界環(huán)境刺激時(shí), 常會進(jìn)行非正常卵裂, 主要表現(xiàn)為以下幾個(gè)方面: 卵裂球不對稱, 內(nèi)部分裂細(xì)胞大小不一、排列松散、邊緣模糊[82]。胚胎發(fā)育前期出現(xiàn)非正常卵裂時(shí), 可導(dǎo)致胚胎發(fā)育終止、孵化率降低及仔魚畸形等現(xiàn)象, 這在大西洋鱈(L)[78, 80]、大西洋庸鰈()[82-83]、黃蓋鰈()[81]、大菱鲆()[84]、美洲黃蓋鰈()[85-86]、黑斑鱈()[79]等海洋性魚類研究中得到驗(yàn)證。這可能因?yàn)榉钦Ｂ蚜亚騼?nèi)細(xì)胞的錯(cuò)位擾亂了胚胎的有序發(fā)育, 或因卵子本身營養(yǎng)物質(zhì)不足導(dǎo)致胚胎發(fā)育出現(xiàn)異常, 使得胚胎進(jìn)一步發(fā)育更加困難。然而, Avery等[86]發(fā)現(xiàn), 美洲黃蓋鰈胚胎在4~8細(xì)胞期時(shí)出現(xiàn)卵裂畸形可導(dǎo)致其死亡率升高, 但在此后發(fā)育階段, 出現(xiàn)非正常卵裂的胚胎與正常卵裂胚胎相比, 孵化率并未出現(xiàn)顯著性變化, 這表明在美洲黃蓋鰈卵裂球8細(xì)胞期以后出現(xiàn)的發(fā)育畸形可隨著胚胎發(fā)育的進(jìn)行得到恢復(fù)。Vallin等[80]對大西洋鱈研究發(fā)現(xiàn), 盡管其卵裂球畸形現(xiàn)象可導(dǎo)致胚胎孵化率降低, 但仍有大量畸形卵可繼續(xù)發(fā)育成健康仔魚, 這表明在胚胎發(fā)育早期出現(xiàn)的畸形卵或有部分可隨著發(fā)育的進(jìn)行得到恢復(fù)。故魚類非正常卵裂胚胎與其可發(fā)育能力的關(guān)系或更為復(fù)雜。Avery等[87]依卵裂球畸形特征將大西洋鱈畸形卵分為7種不正常卵裂方式, 并對其繼續(xù)孵化, 發(fā)現(xiàn)不同方式的胚胎畸形對大西洋鱈胚胎發(fā)育有著不同程度的影響, 這表明有些胚胎的畸形方式可在后續(xù)的胚胎發(fā)育中得到恢復(fù), 有些畸形方式則很難使胚胎繼續(xù)發(fā)育下去。同時(shí)在大西洋鱈胚胎發(fā)育中, 對于同一種畸形方式, 胚胎畸形越嚴(yán)重, 其致死率也越高, 有些輕微畸形在后續(xù)的胚胎發(fā)育中亦可得到恢復(fù)[88]。目前已有的關(guān)于魚類胚胎不正常卵裂的研究結(jié)果往往有著較大的種屬差異, 這可能因?yàn)楦餮芯咳藛T對胚胎不正常卵裂的判斷往往受主觀因素影響或各自對胚胎畸形的定義標(biāo)準(zhǔn)存在差異, 亦或是研究者數(shù)據(jù)分析時(shí)方法不恰當(dāng), 進(jìn)而使所得數(shù)據(jù)不一定真實(shí)反映胚胎分裂的真實(shí)特征[87]。通過觀察卵裂形態(tài)來對胚胎繼續(xù)發(fā)育能力做出預(yù)測, 這一方法簡單易學(xué), 可快速對胚胎質(zhì)量進(jìn)行判斷, 但因目前對魚類胚胎不正常卵裂方面的研究往往較為費(fèi)時(shí)、費(fèi)力, 且所得數(shù)據(jù)易受外界因素的波動而出現(xiàn)較大變動, 這些特點(diǎn)使該方面的研究進(jìn)展緩慢, 以后還需加強(qiáng)研究。

2.4 母源性RNA

因在魚類胚胎囊胚中期及以前階段, 胚胎自身不能合成RNA, 故母源性RNA在受精卵初期卵裂及胚胎發(fā)育中起著關(guān)鍵性作用。研究人員用放線菌酮對虹鱒胚胎母源性mRNA翻譯過程進(jìn)行抑制后發(fā)現(xiàn), 其胚胎發(fā)育出現(xiàn)延緩[89], Aegerter[90]、Bonnet[91]等研究顯示, 在不同質(zhì)量的魚卵中, 其母源性mRNA濃度也出現(xiàn)一定變化。目前較少有從母源性RNA角度對卵子發(fā)育潛能進(jìn)行評估方面的研究出現(xiàn), 故而從RNA水平及卵內(nèi)參與RNA濃度調(diào)節(jié)的生化因子如miR-430入手研究其對魚類卵子發(fā)育能力影響, 或?qū)⒂兄诳焖勹b別卵子可發(fā)育能力和從分子水平了解魚類胚胎發(fā)育過程。

3 展望

卵子質(zhì)量對胚胎發(fā)育及仔稚魚存活、生長、抗逆性有著直接影響。在魚類人工繁育工作中, 人們僅能通過卵子色澤、透明度等外觀進(jìn)行主觀判斷并排除質(zhì)量極差的卵子, 對大多數(shù)質(zhì)量低下的卵子并不能做出有效評判。在人工養(yǎng)殖魚類繁育時(shí), 技術(shù)人員常采用激素誘導(dǎo)方法促使親魚產(chǎn)卵或調(diào)整親魚產(chǎn)卵時(shí)間, 但這僅適用于性腺成熟度、生理狀態(tài)均較好的親魚, 當(dāng)人工激素誘導(dǎo)時(shí)間過早或過晚時(shí), 則會造成卵子質(zhì)量下降, 影響苗種生產(chǎn)。且因魚類繁育工作的時(shí)機(jī)性和周期性往往造成人工繁育工作錯(cuò)過繁育高峰期而達(dá)不到理想規(guī)模, 給育苗企業(yè)也帶來一定風(fēng)險(xiǎn)。

針對以上問題, 許多研究以不同魚類為材料初步分析了卵子形態(tài)結(jié)構(gòu)[83]、生化組成[92]、遺傳因素[93]等對卵子質(zhì)量的影響, 但距完全認(rèn)識還很遠(yuǎn), 且目前已有研究大都從某個(gè)單一方面簡單分析其與受精率、胚胎孵化率的相關(guān)性, 顯然這忽略了其他多種因素對卵質(zhì)的影響, 致使研究結(jié)果差異很大。從形態(tài)、脂肪酸、蛋白、酶活、遺傳物質(zhì)等綜合方面進(jìn)行分析并最終建立起卵質(zhì)分析的多元回歸模型, 將有助于更為有效地找出影響卵質(zhì)因素的關(guān)鍵信息。同時(shí), 在開展卵質(zhì)評估工作中, 不應(yīng)將視線僅限于受精率、孵化率等早期判定卵質(zhì)的參數(shù), 為建立某一經(jīng)濟(jì)魚種的良種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn), 還需將卵質(zhì)研究與家系構(gòu)建相結(jié)合, 后續(xù)跟蹤、統(tǒng)計(jì)仔稚魚至商品魚這一生長階段的生長參數(shù), 進(jìn)行遺傳評估, 并最終確立具有最大經(jīng)濟(jì)效益的卵子參數(shù), 才是目前經(jīng)濟(jì)魚類卵質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)研究需加強(qiáng)的方向。

目前卵生型魚類合子形成、胚胎發(fā)育的基本生理學(xué)過程已經(jīng)清晰, 從分子及細(xì)胞水平發(fā)掘出卵子受精及胚胎發(fā)育過程中可體現(xiàn)卵子及胚胎發(fā)育潛能的生物學(xué)活性標(biāo)志物, 將有助于卵子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立。在人類胚胎發(fā)育潛能評估方法的研究中表明, 對胚胎發(fā)育過程中的蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行研究, 不僅可研究胚胎內(nèi)分子水平的動態(tài)變化, 還有助于發(fā)現(xiàn)胚胎的異常發(fā)生機(jī)制[94]。研究人員采用TOF-MS方法對人類胚胎發(fā)育過程中的蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行了研究, 并發(fā)現(xiàn)泛素等多種與胚胎發(fā)育潛能有關(guān)的蛋白質(zhì)標(biāo)志物[95], 而至今在魚類卵質(zhì)評估研究中尚未開展此類系統(tǒng)性工作。今后對魚類胚胎蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)方面的研究將有助于發(fā)掘出可靠的卵子質(zhì)量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn), 并闡明魚類胚胎發(fā)育過程中的細(xì)胞調(diào)控機(jī)制, 這也將為發(fā)現(xiàn)此一過程中相關(guān)功能基因的作用機(jī)制成為可能。此外初步研究表明, 虹鱒不同質(zhì)量的卵子中, 某些特定基因的表達(dá)豐度也存在差異[93], 但引起特定基因表達(dá)差異的原因尚不明確, 且這一表達(dá)豐度的差異是如何影響到卵子質(zhì)量的, 這一作用機(jī)制也不明確。在未來遺傳育種研究中, 找出可影響卵子質(zhì)量的重要遺傳因素, 并闡明其調(diào)控機(jī)理, 將有助于魚類種質(zhì)的優(yōu)化, 促進(jìn)苗種行業(yè)的健康發(fā)展。

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Advances in the evaluation of oviparous fish egg development potential

ZHAO Yan-fei1, 2, 3, MA Ai-jun2, 3, WANG Xin-an2, 3, SUN Zhi-bin2, 3, WEN Hai-shen1

(1. Ocean University of China, Fisheries College, Qingdao 266003, China; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences; Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture; Qingdao Key Laboratory for Marine Fish Breeding and Biotechnology, Qingdao 266071, China; 3. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Echnology, Qingdao 266071, China)

Fish egg development potential, also known as fish egg quality, can directly reflect the egg quality for breeding. The process of nutrient accumulation in the ovary and the normal meiosis of the oocyte can be easily affected by the external environment, which can also affect the egg developmental potential. Early prediction of egg developmental potential will assist in mitigating risk and in the healthy development of the seeding industry. In this paper, we have summarized fish egg and its components and have analyzed the research status of fish egg quality from different aspects, such as egg shape, biochemical composition, and maternal RNA. Further, existing questions in recent studies have been discussed. In conclusion, analyzing egg quality in terms of morphology, fatty acids, and genetic material, along with other comprehensive analyses and establishing a multivariate regression model of the ooplasm analysis can contribute to finding the key factors affecting egg quality. Meanwhile, in research on the egg quality of economic fish, the following research directions need strengthening: combining egg quality research with family building, counting the growth parameters of the growth stage from the larval and juvenile fish to marketable-size fish, and establishing the maximum economic benefit with genetic assessment. This study will provide a scientific basis for the evaluation of oviparous fish egg development potential for further research on the fish egg quality and also practical methods for risk anticipation in fish breeding.

egg; development potential; biochemical composition; oviparous fish; breeding

(本文編輯: 譚雪靜)

[Science and Technology Support Program of Jiangsu Province, No.BE2013345; Three New Project of Fisheries of Jiangsu Province, No.Y2013-12; Science and Technology Project of Dalian Jinzhou New Area, No.2012-B1-012; Special Funds for Construction of Modern Agricultural Industry Technology System, No.CARS-50-01; Modern Agricultural Talent Support Program-Outstanding Talents and Innovative Team of Agricultural Scientific Research, No.2016-2020]

Dec. 24, 2014

S961

A

1000-3096(2016)08-0157-11

10.11759//hykx20141224003

2014-12-24;

2016-5-02

江蘇省科技支撐計(jì)劃(BE2013345); 江蘇省水產(chǎn)三新工程項(xiàng)目(Y2013-12); 大連金州新區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012-B1-012); 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金(CARS-50-01); 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)人才支撐計(jì)劃-農(nóng)業(yè)科研杰出人才及其創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(2016-2020)

趙艷飛, 男, 碩士, 主要從事海洋魚類繁育與遺傳育種研究, E-mail: yfei.good@163.com; 馬愛軍, 通信作者, 研究員, 電話: 0532-85835103, E-mail: maaj@ysfri.ac.cn