戶 佩， 胡海峰， 胡 磊， 汪少蕓， 洪 晶， 胡春鳳

(1．福州大學生物科學與工程學院， 福建 福州 350116； 2．新干三湖中學， 江西 吉安 331303)

胡蘿卜籽蛋白的提取工藝優(yōu)化及性質研究

戶 佩1， 胡海峰1， 胡 磊1， 汪少蕓1， 洪 晶1， 胡春鳳2

(1．福州大學生物科學與工程學院， 福建 福州 350116； 2．新干三湖中學， 江西 吉安 331303)

以胡蘿卜籽為原料， 采用堿提酸沉法對其中的蛋白質進行提取. 通過單因素實驗考察料液比、 溫度、 pH值和時間對蛋白質提取率的影響， 在此基礎上通過正交實驗優(yōu)化出胡蘿卜籽蛋白提取的最佳工藝條件， 確定了胡蘿卜籽蛋白最佳酸沉pH值， 并對所提取的蛋白質功能性質進行了研究. 結果表明： 在料液比為 1 ∶20、 溫度55 ℃、 pH值為12.0、 時間4 h 的條件下, 胡蘿卜籽蛋白的提取率為 42.23%, 最佳酸沉 pH值為4.5, 吸水性為3.28 g· g-1， 吸油性為 3.09 mL· g-1， 乳化性和起泡性相對較差.

胡蘿卜籽蛋白； 提取工藝； 堿提酸沉法

0 引言

胡蘿卜籽為傘形科胡蘿卜屬胡蘿卜(DaucuscarotaL var sativa DC)的干燥成熟的種子， 化學成分豐富， 含有蛋白質、 黃酮、 油脂、 胡蘿卜甾醇以及一些人體必需的微量元素等[1]， 是一種傳統(tǒng)中藥. 胡蘿卜籽具有廣泛的生理活性， 如抗氧化、 止痛、 消炎、 抗菌、 降血脂、 抗腫瘤和抗尿結石等[2]， 因而具有極高的研究價值和開發(fā)前景.

目前， 國內外有關胡蘿卜籽的研究主要集中在胡蘿卜籽油、 胡蘿卜素、 黃酮類等[3-5]， 而對胡蘿卜籽蛋白的研究尚無相關報道. 植物種子中蛋白質含量高， 蛋白氮素營養(yǎng)豐富， 膽固醇和脂肪含量低， 且能夠為人體提供某些必需氨基酸， 對于人體健康有非常重要的作用[6]. 人們已逐漸認識到對植物種子蛋白的開發(fā)利用具有廣闊的前景， 也有很多學者對植物種子蛋白源進行了相關研究， 如洪晶等[7]對韭菜籽蛋白, 王姝等[8]對羽扇豆分離蛋, 張濤等[9]對漢麻籽蛋白及熊家艷等[10]對黔江腎豆蛋白的提取和研究. 因此， 以胡蘿卜籽為研究對象， 通過正交試驗優(yōu)化胡蘿卜籽蛋白的提取工藝， 并對胡蘿卜籽蛋白性質進行研究， 提高其附加價值， 對其它植物種子資源的開發(fā)利用也具有一定的指導意義.

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

胡蘿卜籽(購于福州市種子市場)； 考馬斯亮藍G-250(上海生物工程有限公司)； 牛血清白蛋白(BSA)(國藥集團化學試劑有限公司).

1.2 主要儀器與設備

TH2-82型水浴恒溫振蕩搖床(金壇市鴻科儀器廠)； EU2600型紫外-可見分光光度計(上海昂拉儀器有限公司)； FE20型精密pH 計(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)； KDN-102C定氮儀(上海纖檢儀器有限公司)； FD-1C-50型真空冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)； XZ-21K高速冷凍離心機(長沙湘智離心機儀器有限公司).

1.3 實驗方法1.3.1 胡蘿卜籽蛋白提取工藝方法

胡蘿卜籽→粉碎→過250 μm篩→浸提→離心分離→上清液→酸沉→離心分離→蛋白沉淀→冷凍干燥→胡蘿卜籽蛋白粉

1.3.2 胡蘿卜籽蛋白含量測定

通過凱氏定氮法測定胡蘿卜籽總蛋白含量， 考馬斯亮藍法(Bradford法)測定浸提液中蛋白質含量， 則提取率的計算公式為：

(1)

式中：Y為蛋白質提取率(%)；ρ為提取液蛋白的質量濃度(mg·mL-1)；V為提取液體積(mL)；w為胡蘿卜籽粉中蛋白的質量分數(%)；m為胡蘿卜籽粉的取樣質量(mg).

1.3.3 單因素實驗設計

在浸提步驟中， 影響蛋白質提取率的主要因素有浸提液pH值、 料液比、 浸提溫度和時間. 準確稱取一定量的胡蘿卜籽粉末樣品， 以蛋白質提取率為指標， 選擇這4個因素作為考察對象， 對各因素選取不同水平做單因素實驗， 提取步驟參照1.3.1， 提取率的計算依照公式(1)所示.

表1 正交試驗因素水平Tab.1 Factors and levels in the orthogonal design

1.3.4 正交實驗優(yōu)化胡蘿卜籽蛋白浸提工藝

在取得單因素實驗結果后， 選擇對蛋白提取率影響較大的3個因素， 采用L9(34)正交實驗設計， 進行3因素3水平正交實驗， 確定胡蘿卜籽蛋白提取最佳工藝條件， 實驗安排如表1所示.

1.3.5 胡蘿卜籽蛋白最佳酸沉pH值的測定

取蛋白提取液， 平均分成5份， 用1 mol·L-1HCl調節(jié)pH值分別為3.5、 4.0、 4.5、 5.0和5.5， 4 ℃下靜置0.5 h后10 000 r·min-1下離心10 min， 取上清Bradford法測定其蛋白質量濃度， 則上清液中胡蘿卜籽蛋白殘留率最少(即上清液在595 nm下吸光值最低)的浸提液pH值即為最佳酸沉pH值.

1.3.6 胡蘿卜籽蛋白功能性質的測定

1) 吸水性. 稱取 0.1 g 蛋白質樣品， 加入 5 mL 去離子水， 充分振蕩1 min后常溫下靜置0.5 h， 4 000 r·min-1下離心0.5 h， 去除分離水， 測定殘留物的質量. 以每克蛋白樣品(干質量)吸附水的克數來表示其吸水性：

(2)

式中： WA表示吸水性(g·g-1)；m1為離心分離后殘留物質量(g)；m為蛋白質干質量(g).

2) 吸油性. 稱取0.1 g蛋白樣品于刻度離心管中， 加入4 mL食用油， 在振蕩器上振蕩混勻1 min后室溫靜置0.5 h， 4 000 r·min-1下離心0.5 h， 測量離心后游離油的體積， 除去游離油的體積即為蛋白質樣品的吸油量. 以每克蛋白樣品(干質量)吸油的毫升數來表示其吸油性：

(3)

式中： OA表示吸油性(mL·g-1)；V為4 mL；V1為游離油體積(mL)；m為蛋白質干質量(g).

3) 乳化性及乳化穩(wěn)定性. 稱取1.2 g 蛋白質樣品溶于20 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol·L-1、 pH 7.0)中， 加入20 mL 食用油， 10 000 r·min-1條件下均質2 min， 均質液平分成2份， 1份在1 500 r·min-1轉速下離心10 min， 測定乳化層高度， 則蛋白質的乳化能力按如下公式計算：

(4)

式中： EA表示乳化性(%)；h為乳化層高度(cm)；H為離心管中液體總高度(cm).

將另一份樣品靜置于80 ℃水浴鍋中， 保溫0.5 h， 待冷卻至室溫， 在1 500 r·min-1轉速下離心10 min， 測量此刻樣品乳化層的高度， 則蛋白質的乳化穩(wěn)定性按如下公式計算：

(5)

式中： ES表示乳化穩(wěn)定性(%)；h1為靜置30 min后乳化層高度(cm)；h為乳化層高度(cm).

4) 起泡性及起泡穩(wěn)定性. 稱取0.5 g蛋白質樣品置于pH值為8.05的0.05 mol·L-1Tris-HCl 緩沖溶液中定容至20 mL. 調節(jié)pH值至7.0， 再通過高速攪拌器均質2 min， 立刻轉入50 mL 量筒中， 并用少許蒸餾水清洗攪拌器， 記錄均質停止時的泡沫體積， 計算公式如下：

(6)

式中： FA表示起泡性(%)；V1為均質停止時泡沫及液體總體積(mL)；V為均質前總體積(mL).

記錄均質0.5 h后泡沫的體積， 以此衡量樣品泡沫的穩(wěn)定性.

(7)

式中： FS表示泡沫穩(wěn)定性(%)；V2為靜置30 min后泡沫體積(mL)；V3為均質停止時泡沫體積(mL).

2 結果與討論

2.1 胡蘿卜籽蛋白含量測定結果

采用凱氏定氮法測得胡蘿卜籽中總蛋白含量為(23.57±0.14)%.

2.2 單因素試驗結果及分析2.2.1 料液比對胡蘿卜籽蛋白提取率的影響

在pH值為10.0、 溫度45 ℃、 時間4 h 條件下， 按料液比 1 ∶10、 1 ∶20、 1 ∶30、 1 ∶40 和 1 ∶50分別提取胡蘿卜籽蛋白， 測定胡蘿卜籽蛋白提取率. 結果如圖1所示， 胡蘿卜籽蛋白提取率在料液比為1 ∶10 到 1 ∶20 之間逐漸增加； 在1 ∶20到1 ∶40之間， 提取率無顯著變化； 當料液比大于1 ∶40后， 隨料液比的增加, 提取率開始下降. 料液比的變大可以促進蛋白質在溶液中的溶出率， 但當料液比超過一定比例后， 蛋白提取率反而略有降低， 這可能是因為胡蘿卜籽中含有的膳食纖維具有較強的吸水膨脹能力， 導致蛋白樣品與浸提液之間的流動性變差， 攪拌不均所致[11-12]. 因而選擇浸提液的最佳料液比為1 ∶20.

2.2.2 浸提液 pH 值對胡蘿卜籽蛋白提取率的影響

固定料液比1 ∶20、 溫度45 ℃、 提取時間4 h， 在 pH 值分別為 8.0、 9.0、 10.0、 11.0和12.0的條件下進行浸提， 結果見圖2 . 由圖2可以看出， 當浸提液的pH值逐漸變大時， 提取率先上升后不變， 且在pH值為11.0時到達最高， 說明在堿性環(huán)境下特別是pH值為11.0時提取效果最好， 但是隨pH值繼續(xù)增大， 提取率沒有顯著性變化. 黨斌等[13]在對春油菜菜籽蛋白提取工藝優(yōu)化的結果中得知， pH值對菜籽蛋白提取率影響達極顯著水平， 最優(yōu)浸提液pH值為12. 考慮到過堿會消耗更多鹽酸, 因此選擇提取液最佳pH值為11.0.

2.2.3 浸提溫度對胡蘿卜籽蛋白提取率的影響

在pH值為10.0、 料液比1 ∶20、 時間4 h， 溫度分別為25、 35、 45、 55和 65 ℃的條件下對胡蘿卜籽蛋白進行提取， 結果見圖3. 由圖3可知， 提取溫度從25 ℃增大至45 ℃過程中， 提取率顯著提高； 溫度大于45 ℃后提取率迅速降低. 洪晶等[7]對韭菜籽蛋白浸提溫度因素研究中發(fā)現(xiàn)， 溫度從4 ℃上升到50 ℃過程中蛋白提取率顯著增加， 但當溫度超過50 ℃時蛋白提取率迅速下降. 這種現(xiàn)象的出現(xiàn)可能是因為溫度提高破壞了蛋白質的空間三維結構， 使得蛋白質變性沉降， 溶液中蛋白質含量減少， 故而選擇最佳浸提溫度為45 ℃.

2.2.4 浸提時間對胡蘿卜籽蛋白提取率的影響

在pH值為10.0、 料液比為 1 ∶20、 溫度為45 ℃的條件下， 對胡蘿卜籽蛋白分別進行1、 2、 3、 4和5 h的提取. 結果如圖4所示， 蛋白提取率隨提取時間的增加而升高， 在提取時間到達4 h時， 提取率達到最大， 而后蛋白提取率隨時間的增加有所降低. 宋鵬等[12]對大豆分離蛋白浸提時， 發(fā)現(xiàn)隨著浸提時間的增加蛋白提取率升高， 當提取率達到最大時， 繼續(xù)延長提取時間， 蛋白提取率變化不大. 王姝等[8]在對羽扇豆蛋白提取時， 也發(fā)現(xiàn)到達某個時間點后隨著浸提時間的增加蛋白得率達到了動態(tài)平衡. 說明浸提時間的進一步增加并不能更有效地提高蛋白提取率， 且浸提時間越長耗能越大， 因此選取的最佳浸提時間為4 h.

2.3 正交實驗優(yōu)化蛋白提取工藝結果及分析

綜合單因素實驗結果， 選取料液比、 pH值和溫度作為考察對象， 研究其對提取率的影響. 實驗結果如表2所示， 方差分析見表3.

表2 提取工藝正交試驗結果Tab.2 Orthogonal array layout and experimental results

注：T表示總和

表3 正交試驗方差分析表Tab.3 Orthogonal experimental analysis of variance of extraction

注: ** 表示P< 0.01；e表示誤差項

由表2正交實驗的極差結果分析可知，RB>RA>RC， 各個因素主次影響順序：B>A>C， 即 pH值>溫度>料液比. 從表3方差分析的結果可知， 因素A、B、C對試驗指標的影響都是高度顯著的. 結合直觀分析和方差分析可以得出最優(yōu)組合為：A3B3C2， 即溫度55 ℃、 pH12.0、 料液比1 ∶20. 在此最優(yōu)條件下進行3次驗證試驗， 得胡蘿卜籽蛋白提取率為42.23%， 符合正交實驗結果.

2.4 胡蘿卜籽蛋白最佳酸沉pH值的確定

蛋白質分子在溶液中會產生解離， 依據溶液pH值的不同， 解離后所帶的電荷也不同， 當蛋白質等電點與溶液pH值相同時， 蛋白質分子解離產生的正、 負電荷相等(即蛋白質分子所帶的凈電荷為零)， 此時蛋白質分子會發(fā)生凝聚而產生沉淀. 因此， 蛋白質在等電點時溶解度最小， 最易形成沉淀物[14]. 依據這一原理， 測得胡蘿卜籽蛋白等電點為4.5(見圖5).

表4 胡蘿卜籽蛋白質的功能性質Tab.4 Functional properties of carrot seeds protein

2.5 胡蘿卜籽蛋白功能性質測定結果

針對胡蘿卜籽蛋白的吸水性、 吸油性、 起泡性及泡沫穩(wěn)定性、 乳化性及乳化穩(wěn)定性作了研究, 實驗結果如表4所示.蛋白質對水吸附能力的大小可以通過吸水性或持水性來判斷. 從表4可以看出， 胡蘿卜籽蛋白具有較好的吸水性， 若利用胡蘿卜籽蛋白較好的持水能力， 將其應用到食品中， 可以保證食品的口感和多汁程度. 蛋白質的吸油性影響了食物的風味， 吸油性高的蛋白質在處理過程中脂肪的損耗較少， 可以改善食品的風味和可口性. 胡蘿卜籽蛋白的吸油性優(yōu)于南瓜籽蛋白和蠶豆蛋白[15-16]， 因而可以考慮作為一種蛋白質類添加劑將其應用于食品中.

蛋白質分子含有親油和親水性基團， 可與水、 脂肪等多相體系中的分子相互作用， 因此在油水混合體系中可以形成油水乳化液， 這種形成油水乳化液的能力以及保持這種乳化液穩(wěn)定的能力就是蛋白質的乳化性和乳化穩(wěn)定性. 由表 4 可知， 胡蘿卜籽蛋白乳化性只有38.82%， 相比其他植物蛋白來說較小， 但其乳化穩(wěn)定性卻可以達到70.41%， 這可能是因為胡蘿卜籽蛋白與多糖之間形成了一種聚合物， 發(fā)生了美拉德反應， 因而具有較好的乳化穩(wěn)定性[13].

蛋白質在受到劇烈的攪拌時， 外界大量的空氣會進入從而形成泡沫， 同時蛋白質可被吸附到氣泡表面， 構成一個有一定彈性和剛性二維保護的薄膜， 因此只有可溶性蛋白參與泡沫的形成[17]， 從表4可知, 胡蘿卜籽蛋白的起泡性很低， 而形成的泡沫在4 min左右即消失， 基本不具有泡沫穩(wěn)定性， 這是因為蛋白質的起泡性與其溶解性有很大關系. 趙敏等[11]在對核仁蛋白的溶解性研究中發(fā)現(xiàn)， 溫度對核仁蛋白的溶解性有較大影響， 在溫度為20～30 ℃范圍內核仁蛋白溶解性不高. 推測胡蘿卜籽蛋白在此溫度下溶解性不好， 故而導致其起泡性和泡沫穩(wěn)定性較差.

3 結論

1) 以胡蘿卜籽為原料， 通過料液比、 溫度、 pH值、 時間單因素實驗和三因素三水平正交實驗， 確定了影響胡蘿卜籽蛋白提取率的各因素主次順序為： pH值 >溫度>料液比. 結合直觀分析和方差分析得出最優(yōu)組合為：A3B3C2， 即溫度55 ℃、 pH12.0、 料液比1 ∶20. 在此最優(yōu)條件下， 測得蛋白質實際提取率是 42.23%. 實驗結果為胡蘿卜籽蛋白的提取提供了良好的實驗基礎.

2) 胡蘿卜籽蛋白的溶解度隨pH值 變化呈V型曲線， 在pH值為4.5時蛋白溶解度最小， 以此確定了胡蘿卜籽蛋白最佳酸沉pH 值為4.5， 這與多數植物蛋白相似.

3) 對胡蘿卜籽蛋白的部分功能性質研究發(fā)現(xiàn)， 胡蘿卜籽蛋白的吸水性、 吸油性分別為3.28 g·g-1和3.09 mL·g-1， 起泡性、 乳化性分別為17.67%和38.82%， 泡沫穩(wěn)定性基本為零， 但是乳化穩(wěn)定性較好. 有關胡蘿卜籽蛋白的凝膠性、 溶解性等其他功能特性及其在乳制品、 配方食品、 飲料中的實際應用效果還有待進一步研究.

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(責任編輯： 洪江星)

Optimization of extraction process and properties of protein from carrot seed

HU Pei1, HU Haifeng1, HU Lei1, WANG Shaoyun1, HONG Jing1, HU Chunfeng2

(1. College of Biological Science and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou, Fujian 350116, China;2. Sanhu Middle School of Xingan, Ji’an, Jiangxi 331303, China)

In the present study, carrot seed protein (CSP) was extracted from carrot seeds by alkali-solution and acid-isolation. The effects of material-to-liquid ratio, pH, extraction temperature and time on the extraction rate of CSP were explored by single factor experiments. The best precipitation pH and the functional properties of CSP were also determined. The results showed that the optimal extraction conditions were as follows that ratio of solid to liquid 1 ∶20, pH 12.0, extraction temperature 55 ℃, extraction time 4 h. Under these conditions, extraction rate of CSP was 42.23%. The best pH value of CSP precipitation was 4.5. The water absorption was 3.38 g· g-1, and the oil absorption was 3.09 mL· g-1, while the emulsifying capacity and the foaming capacity were relatively weak.

carrot seed protein; extraction technology; alkaline extraction-acid precipitation method

10.7631/issn.1000-2243.2016.05.0732

1000-2243(2016)05-0732-06

2015-03-10

洪晶(1981-)， 副教授， 博士， 主要從事食品生物技術方面的研究, jhong@fzu.edu.cn

福建省科技廳資助項目(2013J05050)

Q51

A