黃飛飛， 常平安

(重慶郵電大學(xué)，重慶 400065)

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家蠶LPH基因的生物信息學(xué)分析及表達(dá)模式研究

黃飛飛， 常平安

(重慶郵電大學(xué)，重慶 400065)

摘要[目的]對(duì)家蠶LPH基因進(jìn)行系統(tǒng)的分析。 [方法]以家蠶基因組數(shù)據(jù)和EST數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，用比較基因組學(xué)方法從基因組層次系統(tǒng)地鑒定家蠶LPH基因，對(duì)基因的結(jié)構(gòu)、染色體分布、基因進(jìn)化以及與其他模式昆蟲(chóng)的LPH基因進(jìn)行比較分析，并利用基因芯片數(shù)據(jù)對(duì)LPH基因在家蠶5齡3 d組織中的表達(dá)情況進(jìn)行研究。 [結(jié)果]家蠶LPH是一個(gè)基因家族，包含19個(gè)直向同源基因，分布于6條染色體上，系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析表明它們主要分成二大類(lèi)群；基因芯片數(shù)據(jù)分析表明家蠶LPH基因具有不同的表達(dá)模式，推測(cè)可能具有不同的功能，其中絕大部分基因在中腸組織中有表達(dá)，推測(cè)其可能參與黃酮類(lèi)物質(zhì)在家蠶體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑。[結(jié)論]該研究為家蠶LPH自身功能的研究提供分子基礎(chǔ)，更重要的是為研究其他昆蟲(chóng)的LPH基因提供參考。

關(guān)鍵詞乳糖酶-根皮苷水解酶；生物信息學(xué)；表達(dá)模式；功能分析

Bioinformatics Analysis and Expression Study of SilkwormLPHsGene

HUANG Fei-fei,CHANG Ping-an (Chongqing University of Posts and Telecommunications,Chongqing 400065)

Abstract[Objective] To systematically analyze the silkwormLPHgene.[Method] Based on silkworm genome sequences and EST data,silkwormLPHgene was identified at genome layer by comparative genomics method.The genetic structure,chromosome distribution,genetic evolution andLPHgene of other model insects were comparatively analyzed.SilkwormLPHgene expression in 3-day-old fifth-larvae tissues was studied by gene chip data.[Result] SilkwormLPHwas a gene family,which contained 19 orthologous genes and was distributed on six chromosomes.Phylogenetic analysis showed that they were mainly divided into two groups.Analysis of gene microarray data indicated that silkwormLPHgene had different expression patterns that might have different functions.But the vast majority of genes were expressed in intestinal tissues,which might participate in the transport pathway of flavonoids in the silkworm.[Conclusion] This research provides molecular basis for the research on silkwormLPHfunction,and offers important references for theLPHof other insects.

Ker wordsLactase-phlorizin hydrolase; Bioinformatics; Expression pattern; Function analysis

乳糖酶-根皮苷水解酶(lactase-phlorizin hydrolase,LPH)是一種存在于腸上皮細(xì)胞微絨膜上的糖蛋白，具有乳糖酶和根皮苷水解酶活性，在碳水化合物的消化中起重要作用。關(guān)于LPH的研究，在哺乳動(dòng)物中研究較深入。編碼人類(lèi)LPH基因位于第2號(hào)常染色體上[1]，由1 927個(gè)氨基酸組成[2-3]。人類(lèi)中LPH主要表現(xiàn)為2種類(lèi)型，一種類(lèi)型為持續(xù)高活性，另一種類(lèi)型則為非持續(xù)高活性。后一種表型的人由于其LPH表達(dá)水平低，不能將乳糖分解為葡萄糖和半乳糖，未被消化的乳糖在小腸內(nèi)堆積，并被腸道細(xì)菌發(fā)酵而引起惡心、嘔吐、腹脹、腹痛和腹瀉等一系列癥狀，稱(chēng)為乳糖不耐受癥，這是臨床上最常見(jiàn)的胃腸病癥之一[4-6]。這種LPH的非持續(xù)高活性表型自從被發(fā)現(xiàn)以來(lái)一直受到研究者的普遍關(guān)注，并在其他哺乳動(dòng)物如鼠、兔、豬等中也開(kāi)展了相關(guān)研究[7-8]。此外有研究指出哺乳動(dòng)物L(fēng)PH可參與水解黃酮苷類(lèi)化合物[9]。與哺乳動(dòng)物相比，關(guān)于昆蟲(chóng)LPH的研究很少。筆者前期從家蠶(Bombyxmori)基因組中成功鑒定了一個(gè)LPH基因，命名為BmLPH014192[10]。筆者以家蠶基因組序列和大規(guī)模EST數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，用比較基因組學(xué)方法從基因組層次系統(tǒng)地鑒定了家蠶LPH基因，并對(duì)基因的結(jié)構(gòu)、染色體分布、進(jìn)化以及與其他模式昆蟲(chóng)的LPH基因進(jìn)行了比較。該研究不僅為家蠶LPH自身功能的研究提供分子基礎(chǔ)，更重要的是為研究其他昆蟲(chóng)的LPH基因提供參考。

1材料與方法

1.1數(shù)據(jù)庫(kù)和基因組序列采用的家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://silkworm.swu.edu.cn/silkdb/)是由中日雙方合作測(cè)序、組裝和注釋的9倍覆蓋度的全基因組數(shù)據(jù)。家蠶全基因組oligo芯片數(shù)據(jù)來(lái)源于http://silkworm.swu.edu.cn/。果蠅(Drosophilamelanogaster)、按蚊(Anophelesgambiae)和蜜蜂(Apismellifera)的編碼基因序列下載自flybase homopage，Ensemble (AgamP 3.45) and BeeBase (release 2)。

1.2工具軟件信號(hào)肽預(yù)測(cè) (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；跨膜區(qū)預(yù)測(cè) (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)；預(yù)測(cè)基因的外顯子、內(nèi)含子結(jié)構(gòu)采用Sim 4(http://pbil.univ-lyon1.fr/sim4.php)；Blast、Clustal X 1.83、Bioedit、MEGA 4.0、PAUP 4.0和PHYLIP。

1.3家蠶LPHs基因的鑒定從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載人類(lèi)、老鼠、兔子LPH基因的蛋白質(zhì)序列，以這些已知的LPH序列為檢索序列(query)與預(yù)測(cè)的家蠶蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTP比對(duì)，同時(shí)與家蠶9倍基因組數(shù)據(jù)庫(kù)作TBLASTN檢索[11]，根據(jù)比對(duì)結(jié)果收集E值較高的候選基因。采用SMART軟件預(yù)測(cè)這些候選基因編碼蛋白質(zhì)序列的功能域。果蠅、按蚊和蜜蜂的LPH基因也是按照相同的方法進(jìn)行鑒定。

1.4系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)采用家蠶、果蠅、按蚊和蜜蜂4個(gè)物種LPH基因的功能域序列構(gòu)建，將LPH的功能域蛋白質(zhì)序列用ClustalX[12]進(jìn)行多序列聯(lián)配。進(jìn)化樹(shù)主要采用MEGA4.0[13]軟件中的鄰近方法[14]構(gòu)建，1 000次抽樣分析。通過(guò)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)推測(cè)家蠶LPH基因可能的進(jìn)化。

1.5EST與芯片數(shù)據(jù)分析以預(yù)測(cè)的LPH基因蛋白質(zhì)序列與家蠶EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTN比對(duì)，比對(duì)結(jié)果中序列一致性大于95%且E值小于1e-20的EST作為該基因的表達(dá)序列標(biāo)簽。

利用家蠶基因芯片數(shù)據(jù)分析LPH基因在家蠶5齡3d組織(精巢、卵巢、脂肪體、中腸、頭、血液、馬氏管、體壁、絲腺)中的轉(zhuǎn)錄情況。

2結(jié)果與分析

2.1家蠶LPH基因的鑒定從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心NCBI網(wǎng)站 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)下載人類(lèi)、老鼠和兔子的LPH基因序列,與家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)。經(jīng)過(guò)比對(duì)分析，最終從家蠶基因組中鑒別出19個(gè)LPH基因，基因的性質(zhì)及其探針號(hào)見(jiàn)表1。功能域分析表明這些基因都具有名稱(chēng)為Glyco-hydro-1的結(jié)構(gòu)域，屬于水解酶1超家族。分別從果蠅、按蚊和蜜蜂基因組中鑒別出1、6和1個(gè)LPH基因。與果蠅、按蚊、蜜蜂基因組相比，家蠶基因組具有更多的LPH基因。對(duì)家蠶所有鑒定的LPH基因進(jìn)行跨膜區(qū)分析，結(jié)果表明家蠶所有LPH基因均無(wú)跨膜區(qū)域。

表1　家蠶LPH基因

2.2家蠶LPH基因家族的系統(tǒng)發(fā)生分析圖1表明，4個(gè)物種27個(gè)LPH基因主要分成三大類(lèi)群，將其命名為I~Ⅲ群。I群只包含家蠶的8個(gè)LPH基因，這些基因均位于家蠶20號(hào)染色體上，并在染色體上呈串聯(lián)重復(fù)排列。II群只包含家蠶的7個(gè)LPH基因，這些基因分別位于4條不同的染色體上。其中BmLPH010536和BmLPH010537基因位于12號(hào)染色體；BmLPH010812、BmLPH010811和BmLPH010735基因位于26號(hào)染色體；BmLPH014178和BmLPH005602基因分別位于20號(hào)和17號(hào)染色體。Ⅲ群是同屬雙翅目昆蟲(chóng)的按蚊和果蠅的LPH基因聚在一起，包含果蠅的1個(gè)LPH基因和按蚊的6個(gè)LPH基因。家蠶的BmLPH003512、BmLPH002660和BmLPH002540基因，蜜蜂的Am18896-PA基因以及按蚊的Ag000481-PA基因均單獨(dú)成一分支，均沒(méi)有與上述三大類(lèi)群聚在一起。

圖1　家蠶、果蠅、按蚊、蜜蜂LPH構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)Fig.1　Phylogentic tree of LPH in B.mori,D.Melanogaster,A.Gambiae and A.mellifera

與果蠅1個(gè)LPH基因、按蚊6個(gè)LPH基因和蜜蜂1個(gè)LPH基因相比，家蠶19個(gè)LPH基因數(shù)目明顯增多。I群和II群是家蠶LPH特有的類(lèi)群，共有15個(gè)LPH基因；Ⅲ群是雙翅目昆蟲(chóng)所特有的類(lèi)群，只包含果蠅和按蚊的LPH基因。在Ⅲ群里，果蠅的CG9701-PA和按蚊的Ag006425-PA可能是直系同源基因，節(jié)點(diǎn)處具有較高的自展值為100%。在II群中，BmLPH010536 和BmLPH010537在12號(hào)染色體上串聯(lián)重復(fù)，BmLPH010812和BmLPH010811在26號(hào)染色體上串聯(lián)重復(fù)，因此它們可能是通過(guò)位點(diǎn)復(fù)制而產(chǎn)生的。這些相似的現(xiàn)象也存在于I群中。家蠶的LPH基因主要分成兩大類(lèi)群I群和II群，沒(méi)有與其他昆蟲(chóng)的LPH基因聚在一起，是家蠶所特有的類(lèi)群，每個(gè)群上的LPH基因都表現(xiàn)出較高的序列相似性，表明該家族在基因進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了基因重復(fù)事件。家蠶基因組中的大部分LPH基因可能經(jīng)歷了種族特異性的膨脹。

2.3家蠶LPH基因家族在基因組上的分布LPH基因常呈簇分布于基因組中。已鑒別的家蠶19個(gè)LPH基因位于6條染色體上。不同染色體上LPH基因數(shù)目從1~9個(gè)不等，位于相同染色體上的LPH基因表現(xiàn)出較高的序列相似性。20號(hào)染色體上共具有9個(gè)LPH基因，是主要的一大類(lèi)群；此外5號(hào)和26號(hào)染色體都包含3個(gè)LPH基因，12號(hào)染色體包含2個(gè)基因；而9號(hào)和17號(hào)染色體均只包含1個(gè)基因。家蠶LPH基因家族存在基因轉(zhuǎn)座現(xiàn)象，如有些位于相同染色體上的基因卻分布在不同的分支上，這可能是基因轉(zhuǎn)座產(chǎn)生的?；駼mLPH014178雖然位于20號(hào)染色體上，但其并沒(méi)有與位于該染色體的其他LPH基因聚在一起。BmLPH005602與BmLPH010811和BmLPH005602聚在一起，但它們卻位于不同的染色體上。BmLPH014178、BmLPH010536和BmLPH010537基因亦是如此。

2.4家蠶LPH基因在家蠶5齡3 d幼蟲(chóng)組織中的表達(dá)情況

2.4.1基于EST數(shù)據(jù)的表達(dá)分析。EST數(shù)據(jù)分析表明，家蠶LPH基因中有13個(gè)基因具有EST證據(jù)。家蠶LPH基因主要在某些組織中具有轉(zhuǎn)錄活性，包括中腸、絲腺、馬氏管等。不同群的LPH基因，組織分布存在差異；而且位于相同群的LPH基因，組織表達(dá)情況也不同。

2.4.2基于芯片數(shù)據(jù)的表達(dá)分析。由家蠶5齡3 d的各個(gè)組織(包括精巢、頭、卵巢、脂肪體、體壁、馬氏管、血液、絲腺和中腸)組成家蠶全基因組的組織表達(dá)譜芯片。芯片數(shù)據(jù)分析表明，19個(gè)家蠶LPH基因中有18個(gè)基因有探針序列。將這18個(gè)LPH基因的不同組織芯片數(shù)據(jù)構(gòu)建了聚類(lèi)圖。由圖2可知，絕大多數(shù)基因具有不同的表達(dá)模式，其中16個(gè)基因在中腸組織中具有轉(zhuǎn)錄活性；BmLPH014178、BmLPH014190、BmLP002660等基因在家蠶組織中廣泛表達(dá)；BmLPH010735、BmLPH010536、BmLPH010537、BmLPH002450、BmLPH014192、BmLPH014188呈組織特異性表達(dá)模式，只在中腸組織中有表達(dá)；BmLPH014148只在馬氏管中有表達(dá)，而其他基因在某幾個(gè)特定的組織中有表達(dá)。

注：紅色代表陽(yáng)性；黑色代表0；綠色代表陰性Note: Red color represented positive; black color represented zero; and green color represented negative.圖2　芯片數(shù)據(jù)分析家蠶LPH基因在5齡3 d幼蟲(chóng)組織中的表達(dá)水平Fig.2　Expression levels of silkworm LPH genes in different tissues of three-day-old fifth-larvae tissues by microarray analysis

3結(jié)論與討論

3.1家蠶LPH基因的數(shù)目 利用已組裝的家蠶全基因組數(shù)據(jù)，通過(guò)生物學(xué)信息分析，在家蠶基因組中共鑒定出19個(gè)乳糖酶-根皮苷水解酶基因(LPH)。家蠶與果蠅(1個(gè)LPH)、按蚊(6個(gè)LPH)、蜜蜂(1個(gè)LPH)等其他昆蟲(chóng)相比，具有更多的LPH基因。

研究表明，哺乳動(dòng)物L(fēng)PH除參與乳糖水解作用外，還可參與水解黃酮苷類(lèi)化合物。黃酮苷類(lèi)的分子質(zhì)量較大，其水溶性和脂溶性較差，很難靠被動(dòng)擴(kuò)散透過(guò)小腸上皮細(xì)胞。因此，黃酮苷類(lèi)需要先被腸細(xì)胞存在的酶代謝成為苷元才能被吸收，而LPH就參與此種代謝[9]。與果蠅、按蚊、蜜蜂等昆蟲(chóng)相比，家蠶的唯一取食植物——桑葉含有較多的黃酮類(lèi)化合物，家蠶LPH基因數(shù)目發(fā)生了膨脹且產(chǎn)生了家蠶特有的LPH基因，可能與桑葉中的黃酮類(lèi)物質(zhì)在家蠶體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。推測(cè)，為了更好地吸收桑葉中的黃酮苷類(lèi)物質(zhì)，極有可能家蠶LPH基因數(shù)目發(fā)生了膨脹。

3.2家蠶LPH基因的結(jié)構(gòu)迄今為止，研究最多的是哺乳動(dòng)物L(fēng)PH基因，研究表明哺乳動(dòng)物L(fēng)PH僅在小腸細(xì)胞中表達(dá)，在小腸的起始——空腸中段的含量最豐富，向兩端降低，使得回腸末段和十二指腸近段的表達(dá)活性最低[15]。人LPH基因由1 927個(gè)氨基酸組成，成熟型LPH嵌入小腸微絨毛中，酶蛋白的羧基端有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域使之可在小腸刷狀緣形成二聚體，成為有活性的LPH[16]。通過(guò)對(duì)下載的兔、鼠LPH的結(jié)構(gòu)分析表明，其蛋白羧基端都存在跨膜區(qū)域，而該研究對(duì)鑒別的家蠶LPH基因分析表明其不存在跨膜區(qū)域，推測(cè)其活性作用的方式可能與哺乳動(dòng)物有所不同。

所鑒別的家蠶19個(gè)LPH基因分布于6條染色體上，系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析表明這些基因主要分為二大類(lèi)群。每個(gè)群上的基因都表現(xiàn)出較高的序列相似性，表明在這個(gè)家族進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了幾個(gè)基因的重復(fù)事件。這些重復(fù)事件包括串聯(lián)事件，重復(fù)的拷貝相互之間臨近；此外還包括轉(zhuǎn)座事件，一個(gè)拷貝通過(guò)轉(zhuǎn)座位于其他不同的染色體上。2種類(lèi)型的重復(fù)事件在基因BmLPH010536、BmLPH005602中可以看到。

3.3家蠶LPH基因的功能家蠶幼蟲(chóng)5齡3 d的組織芯片數(shù)據(jù)分析表明，家蠶LPH基因表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，表明這些基因可能具有不同的功能。絕大部分家蠶LPH基因在中腸組織有表達(dá)，這與LPH的基本功能一致，表明LPH極有可能參與黃酮類(lèi)化合物在家蠶體內(nèi)的代謝。

家蠶幼蟲(chóng)從它們唯一的寄主植物——桑葉中攝取黃酮類(lèi)化合物，部分黃酮類(lèi)化合物轉(zhuǎn)運(yùn)到生成的繭中，但從桑葉中分離到的黃酮類(lèi)物質(zhì)與從家蠶繭層中分離到的黃酮類(lèi)物質(zhì)在結(jié)構(gòu)上不同。桑葉中的黃酮苷類(lèi)物質(zhì)主要是3-O-糖苷，蠶繭中的黃酮苷類(lèi)物質(zhì)主要是5-O-糖苷[17]。鑒于LPH參與哺乳動(dòng)物體內(nèi)黃酮類(lèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，推測(cè)在家蠶中，首先是位于中腸上皮的LPH將黃酮苷類(lèi)物質(zhì)水解成分子量較小的苷元便于中腸的吸收，后被位于中腸、血液或絲腺中的尿苷二磷酸-糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)所催化[18]，從而生成家蠶體內(nèi)特有的黃酮苷類(lèi)物質(zhì)。因此在中腸中高表達(dá)或特異表達(dá)的LPH基因如BmLPH010735、BmLPH010536、BmLPH010537等可能對(duì)家蠶從桑葉中更好地吸收黃酮類(lèi)化合物起重要作用。此外，BmLPH014192基因已證明在綠色繭品種和白色繭品種的幼蟲(chóng)中腸組織中出現(xiàn)序列選擇性剪接[10]，也間接表明LPH很有可能參與蠶體內(nèi)黃酮類(lèi)化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。

家蠶LPH基因除在中腸表達(dá)外，在其他組織也有表達(dá)。BmLPH014178 基因在家蠶5齡3 d的各個(gè)組織中都有表達(dá)，表明該基因可能在家蠶發(fā)育過(guò)程中起到看家基因的作用。此外個(gè)別基因在精巢、卵巢、頭、脂肪體、體壁、馬氏管和絲腺中有表達(dá)，而在這些組織中表達(dá)的基因所起的作用尚不清楚，需進(jìn)一步研究。

總之，家蠶19個(gè)LPH基因表達(dá)模式多樣，表明可能擔(dān)負(fù)的功能不同。對(duì)家蠶LPH基因的生物信息學(xué)分析及其表達(dá)模式的研究可為以后LPH基因的研究提供重要參考。

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收稿日期2015-12-30

作者簡(jiǎn)介黃飛飛(1980- )，女，山東即墨人，講師，博士，從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)方面的研究。

基金項(xiàng)目重慶市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(cstc2013jcyjA10005；KJ1400424)。

中圖分類(lèi)號(hào)S 188+.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)03-111-04