佟海英，范盎然，于雪，張月，烏吉斯古冷，李婧，呼日樂巴根.北京中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)研究所，北京 0009；.北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 0009；.內(nèi)蒙古自治區(qū)國際蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 0000；.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 000

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蒙藥孟根烏蘇（水銀）-18味丸對大鼠腎臟毒性初步研究

佟海英1，范盎然2，于雪2，張月1，烏吉斯古冷3，李婧4，呼日樂巴根4
1.北京中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)研究所，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100029；
3.內(nèi)蒙古自治區(qū)國際蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020；4.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110

摘要：目的觀察孟根烏蘇（水銀）-18味丸對大鼠腎臟功能的影響，探討其腎毒性。方法將Wistar雄性大鼠根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為8組：正常對照組，孟根烏蘇-18味丸低、中、高劑量組，孟根烏蘇炮制品組，硫化汞組，氯化汞組，氯化亞汞組，每組10只。各組大鼠給予相應(yīng)藥物灌胃，連續(xù)15 d。分別檢測大鼠血清尿素（UREA）、肌酐（CREA）水平，觀察腎組織形態(tài)學(xué)變化，并用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀和電感耦合等離子體質(zhì)譜法檢測腎汞蓄積量，原位末端標(biāo)記法檢測腎細(xì)胞凋亡，免疫組化檢測腎Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)，實時熒光定量PCR檢測腎臟金屬硫蛋白（MT）-1、MT-2基因表達(dá)。結(jié)果氯化汞、氯化亞汞大鼠腎臟指數(shù)比正常對照組和孟根烏蘇炮制品組顯著升高（P＜0.01）；各組大鼠血清CREA和UREA含量無顯著差異。腎臟病理觀查結(jié)果表明，孟根烏蘇-18味丸低劑量組（臨床常用劑量）大鼠腎臟出現(xiàn)一定的病理損傷，表現(xiàn)為腎小球輕度肥大、腎小管上皮中度腫脹變性，孟根烏蘇-18味丸中、高劑量組腎臟也出現(xiàn)一定損傷，硫化汞組、氯化汞組、氯化亞汞組大鼠腎病理變化更顯著。與正常對照組和孟根烏蘇炮制品組比較，氯化汞組和氯化亞汞組大鼠腎汞蓄積量顯著升高（P＜0.01），氯化汞組、氯化亞汞組大鼠腎細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01），硫化汞組、氯化汞組、氯化亞汞組大鼠腎臟Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。與正常對照組比較，氯化亞汞組大鼠腎組織中MT-1 mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05），氯化汞組、氯化亞汞組大鼠腎組織中MT-2 mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與孟根烏蘇炮制品組比較，氯化亞汞組大鼠腎組織中MT-1 mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。結(jié)論臨床常用劑量孟根烏蘇-18味丸在15 d用藥過程中未對大鼠腎臟功能造成明顯的損傷。

關(guān)鍵詞：孟根烏蘇-18味丸；汞化合物；腎毒性；大鼠

孟根烏蘇（水銀）-18味丸（以下簡稱“孟根烏蘇-18味丸”）為蒙醫(yī)傳統(tǒng)經(jīng)典復(fù)方，具收斂、生肌、燥“協(xié)日烏素”之功，載入1984年版《內(nèi)蒙古蒙成藥標(biāo)準(zhǔn)》，方中孟根烏蘇（水銀）炮制品占11.24%[1]。孟根烏蘇炮制品由水銀與硫磺等量加熱炮制而成，主含硫化汞[2-3]，因此，含汞化合物孟根烏蘇-18味丸的安全性問題備受關(guān)注。本課題組前期已對孟根烏蘇炮制品、孟根烏蘇-18味丸與氯化汞、氯化亞汞單次給藥、連續(xù)7 d給藥后腎毒性進(jìn)行了對比研究，結(jié)果均顯示，常用劑量孟根烏蘇炮制品、孟根烏蘇-18味丸未對大鼠腎臟造成明顯損傷，并且毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于氯化汞和氯化亞汞[4]。為進(jìn)一步探究孟根烏蘇-18味丸的腎毒性，本研究采用連續(xù)灌胃給藥15 d，觀察孟根烏蘇-18味丸對大鼠腎功能、腎組織形態(tài)學(xué)、腎汞蓄積量、腎細(xì)胞凋亡、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)及金屬硫蛋白（MT）-1、MT-2基因表達(dá)的影響。

1　實驗材料

1.1動物

清潔級Wistar雄性大鼠80只，6～8周齡，體質(zhì)量180～200 g，斯貝福（北京）實驗動物科學(xué)技術(shù)有限公司，合格證號SCXK（京）2011-0004。以清潔級大小鼠維持飼料飼養(yǎng)，北京科澳協(xié)力飼料有限公司。動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物房，整個實驗過程中動物自由攝食和飲水，室溫20～22 ℃，相對濕度為60%～70%，光照周期為12 h，7:00－19:00光照，19:00－7:00黑暗，適應(yīng)環(huán)境7 d后進(jìn)行實驗。

1.2藥物

孟根烏蘇炮制品，內(nèi)蒙古自治區(qū)國際蒙醫(yī)醫(yī)院提供（2012年5月炮制）。孟根烏蘇-18味丸組成：水銀（制）100 g，文冠木膏75 g，硫黃（制）75 g，苘麻子75 g，木香50 g，肉豆蔻15 g，甘松15 g，白云香75 g，訶子100 g，草烏（制）100 g，草果仁15 g，石菖蒲35 g，決明子75 g，蘇格木勒20 g，紅花15 g，石膏20 g，丁香15 g，黑云香15 g，內(nèi)蒙古自治區(qū)國際蒙醫(yī)醫(yī)院，批號20120916。氯化汞，姜堰市環(huán)球試劑廠，批號20130110；氯化亞汞，aladdin公司，批號E1317041；硫化汞，aladdin公司，批號47973。

1.3主要儀器與試劑

Microlab300半自動生化分析儀，荷蘭威圖科學(xué)公司；微波消解儀Ethos，意大利Milestone公司；電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP-OES），美國Thermo Fisher公司；電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS），美國Thermo Fisher公司；CFX96型熒光定量PCR儀，美國BIO-RAD公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國Thermo Fisher公司；肌酐（CREA）測定試劑盒（批號132721），尿素（UREA）測定試劑盒（批號131031），均由中生北控生物科技股份有限公司提供；Ⅲ型膠原抗體，批號GR30215-3，美國Abcam公司；Tunel試劑盒，貨號11684817910，瑞士Roche公司；Hg單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院。

2　實驗方法

2.1分組與給藥

實驗大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分成8組，每組10只，即正常對照組、孟根烏蘇-18味丸低劑量組（0.29 g/kg，臨床使用劑量的8倍，Hg 0.015 g/kg）、孟根烏蘇-18味丸中劑量組（1.47 g/kg，臨床使用劑量40倍，Hg 0.074 g/kg）、孟根烏蘇-18味丸高劑量組（2.9 g/kg，臨床使用劑量80倍，Hg 0.145 g/kg）、孟根烏蘇炮制品組（0.033 g/kg，Hg 0.015 g/kg）、硫化汞組（17.39 mg/kg，Hg 0.015 g/kg）、氯化汞組（4.06 mg/kg，Hg 0.003 g/kg）、氯化亞汞組（7.06 mg/kg，Hg 0.003 g/kg），各組大鼠適應(yīng)1周后，各組均按10 mL/kg體質(zhì)量給藥，每日1次，連續(xù)15 d。

2.2腎臟指數(shù)和腎功能檢測

大鼠處死前禁食（不禁水）8 h，次日處死前稱重，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，取出腎臟后，立即用濾紙擦干表面殘血，稱重，以相應(yīng)體質(zhì)量計算腎臟指數(shù)，腎臟指數(shù)＝腎臟質(zhì)量（mg）÷體質(zhì)量（g）。腹主動脈采血8～10 mL，室溫下放置1 h后，4 ℃、3000 r/min離心10 min，分離血清，按照試劑盒說明測定血清UREA和CREA含量。

2.3腎組織形態(tài)學(xué)觀察

取大鼠同側(cè)腎臟，中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察其組織病理變化。

2.4腎汞蓄積量測定

取適量腎組織，精密稱定，置潔凈的微波消解罐中，加入濃硝酸2 mL，蓋上蓋子，預(yù)消解過夜后，裝入微波消解儀中，按照設(shè)定消解程序進(jìn)行樣品消解，同時做對照樣品。待消解完畢并冷卻過夜后，取出內(nèi)管，將澄清的消解液轉(zhuǎn)移定容于25 mL容量瓶中，搖勻待測。

ICP-OES工作曲線：使用1000 μg/mL的Hg單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院）逐級稀釋配制成0、1、5、10 μg/mL（5%硝酸介質(zhì)）的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，用ICP-OES檢測。儀器參數(shù)：等離子體功率1150 W，霧化氣流速0.6 L/min，輔助氣流量0.5 L/min，蠕動泵轉(zhuǎn)數(shù)50 r/min。

ICP-MS工作曲線：使用1000 mg/L Hg單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（國家鋼鐵材料測試中心）逐級稀釋配制成0、0.5、1、2 ng/mL（2%硝酸介質(zhì)）的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，用ICP-MS檢測。儀器參數(shù)：功率1548 W，冷卻氣流速：13.88 L/min，輔助氣流速：0.795 L/min，載氣流速：0.952 L/min[5-7]。

2.5原位末端標(biāo)記法測腎臟凋亡細(xì)胞數(shù)

按試劑盒說明書對腎組織染色，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染。光鏡觀察細(xì)胞核呈棕黃色為陽性細(xì)胞，鏡下隨機(jī)選取10個視野（×400），觀察陽性細(xì)胞數(shù)及總細(xì)胞數(shù)，計算細(xì)胞凋亡率（陽性細(xì)胞數(shù)÷總細(xì)胞數(shù)×100%）。

2.6免疫組化檢測腎組織Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)

腎臟中性福爾馬林固定，石蠟包埋、切片，切片厚5 μL。切片常規(guī)脫蠟，3%H2O2室溫10 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）高壓抗原修復(fù)，滴加一抗后4 ℃過夜，滴加生物素化二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。采用美國Media Cybernetics公司Image Pro Plus 6.0醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，鏡下隨機(jī)選取5個視野，測定累積積分光密度（IOD）值[8]。

2.7實時熒光定量PCR檢測腎組織金屬硫蛋白-1、金屬硫蛋白-2基因表達(dá)

取大鼠腎組織加入1 mL Trizol液研磨，劇烈振蕩以裂解細(xì)胞，裂解液轉(zhuǎn)入EP管中，室溫下放置5 min；然后加入0.2 mL氯仿，劇烈搖蕩離心管15 s。室溫下（15～30 ℃）放置2～3 min后，12 000×g（2～8 ℃）離心15 min；取上層水相于一新的離心管，加入等量異丙醇，室溫下放置10 min，12 000×g（2～8 ℃）離心10 min；棄上清液，加1 mL 75 %乙醇，重懸RNA沉淀，4 ℃、7 500×g離心5 min；棄上清液，讓沉淀RNA在室溫下自然干燥或真空干燥5～10 min，并加適量DEPC水溶解RNA沉淀，取其1 μL用DEPC水稀釋100倍。測定RNA濃度，并鑒定其純度（瓊脂糖凝膠電泳法）。應(yīng)用PCR儀進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：42 ℃、60 min，70 ℃、8 min，4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，應(yīng)用CFX96型熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，40個循環(huán)。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計并合成，MT-1正義鏈：5'-AATGTGCCCAGG GCTGTGT-3'，反義鏈：5'-GCTGGGTTGGTCCGATA CTATT-3'；MT-2正義鏈：5'-TGTGCCTCCGATGGA TCCT-3'，反義鏈：5'-GCAGCCCTGGGAGCACTT-3'；以18 s為內(nèi)標(biāo)，正義鏈：5'-CGAACGTCTGCCCTA TCAACTT-3'，反義鏈：5'-CCGGAATCGAACCCTGA TT-3'。目的基因mRNA的相對表達(dá)量根據(jù)2-ΔΔCt的公式及方法進(jìn)行換算[9-10]。

3　統(tǒng)計學(xué)方法

4　結(jié)果

4.1孟根烏蘇-18味丸對大鼠腎臟指數(shù)、腎功能的影響

大鼠連續(xù)給藥15 d后，氯化汞組、氯化亞汞組大鼠腎臟指數(shù)比正常對照組和孟根烏蘇炮制品組顯著升高（P＜0.01）；各組大鼠血清CREA和UREA含量變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

表1　各組大鼠腎臟指指數(shù)及腎功能相關(guān)指標(biāo)比較（±s））

表1　各組大鼠腎臟指指數(shù)及腎功能相關(guān)指標(biāo)比較（±s））

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與孟根烏蘇炮制品組比較，△P＜＜0.05，△△P＜0.01（下同）

組別　只數(shù)　腎臟指數(shù)/（mgg/g）正常對照組100.007 8±0.000 5孟孟孟孟硫氯氯根烏蘇-18味丸低根烏蘇-18味丸中根烏蘇-18味丸高根烏蘇炮制品組化汞組化汞組化亞汞組劑量組劑量組劑量組10 10 10 10 10 10 10 0.008 5±0.001 0 0.008 7±0.000 9 0.008 9±0.001 2 0.008 4±0.000 9 0.008 3±0.000 7 0.011 0±0.001 2 0.011 7±0.002 4 0 9 2 **△△**△△CREA/（μmol/L）UREA/（m mol/L）91.40±11.8811.35±2.31 94.00±14 98.18±10 90.44±10 92.22±17 86.00± 7 88.73± 5 90.42±12 .76 .54 .68 .30 .60 .12 .63 11.32±2 11.70± 12.01± 12.02± 9.43± 12.72± 10.91±2 .32 1.97 1.66 1.49 1.57 1.97 .80

4..2孟根烏蘇蘇-18味丸對大大鼠腎組織形形態(tài)學(xué)的影響響

正常對照組組腎小球如常常，無腫大，球囊壁未見見增厚；腎小管無變變性，無壞死死，無管型；間質(zhì)如常；孟根烏烏蘇-18味丸丸低劑量組腎腎小球輕度肥肥大，球囊壁壁未見增增厚，腎小管管上皮中度腫腫脹變性；孟孟根烏蘇-18味丸中劑量組也可可見低劑量組組病理變化，但未見凋亡亡及壞死死；孟根烏蘇蘇-18味丸高高劑量組除低低劑量組病理理變化外外，還可見間間質(zhì)內(nèi)見炎癥癥細(xì)胞浸潤；孟根烏蘇炮炮制品組組腎小球輕度度肥大，球囊囊壁未見增厚厚，腎小管上上皮輕度度腫脹變性，，間質(zhì)血管擴(kuò)擴(kuò)張；硫化汞汞組腎小球可可見萎縮縮，周圍腎小小球代償性肥肥大，腎小管管變性明顯，大面積積渾濁腫脹及及少量嗜酸性性變，局部見見凋亡，腎小小球囊壁壁略增厚，間間質(zhì)增寬，少少量纖維組織織增生；氯化汞組大大量腎小球萎萎縮，周圍可可見代償性肥肥大的腎小球，腎小球基底膜及及系膜區(qū)增厚厚，腎小管變變性明顯，渾濁腫脹脹及嗜酸性變變，凋亡細(xì)胞胞多見，另可可見小灶壞死，腎小球囊壁明顯顯增厚，間質(zhì)質(zhì)增寬，纖維維組織增生，局部玻玻璃樣變；氯氯化亞汞組腎腎小球以代償償性肥大為主，腎小球系膜區(qū)增增生，可見少少量腎小球萎萎縮，腎小管變性，渾濁腫脹及及少量嗜酸性性變，可見凋凋亡細(xì)胞和點狀壞死死，腎小球囊囊壁增厚，間間質(zhì)增寬，少少量纖維組織增生。結(jié)果見圖1。

4..3孟根烏蘇蘇-18味丸對大鼠腎汞蓄積量的影響

與正常對照照組和孟根烏蘇炮制品組比較，氯化汞組和和氯化亞汞組組大鼠腎汞蓄積量顯著升高（P＜0.01）。結(jié)果果見表2。

4..4孟根烏蘇蘇-18味丸對大鼠腎組織細(xì)胞凋亡及Ⅲ型膠膠原蛋白表達(dá)達(dá)的影響

腎細(xì)胞凋亡亡Tunel染色色為細(xì)胞核著色，淡黃至棕黃色，數(shù)量多者表示凋亡比較高，Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)于腎小球系膜間質(zhì)，亦可見于腎小管上皮細(xì)胞，淡黃至棕黃色。與正常對照組和孟根烏蘇炮制品組比較，氯化汞組和氯化亞汞組大鼠腎細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；硫化汞組、氯化汞組、氯化亞汞組大鼠腎臟Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見表3、圖2、圖3。

注：A.正常對照組；B.孟根烏蘇-18味丸低劑量組；C.孟根烏蘇-18味丸中劑量組；D.孟根烏蘇-18味丸高劑量組；E.孟根烏蘇炮制品組；F.硫化汞組；G.氯化汞組；H.氯化亞汞組（下同）

表2　各組大鼠腎汞蓄積量比較（±s）

表2　各組大鼠腎汞蓄積量比較（±s）

組別　只數(shù)　腎汞蓄積量//（ng/g）正常對照組1052.91±16.36孟根烏蘇孟根烏蘇孟根烏蘇孟根烏蘇硫化汞組氯化汞組氯化亞汞-18味丸低劑量-18味丸中劑量-18味丸高劑量炮制品組組組　10組　10組　10 10 10 10 10 1301.72± 1676.04± 1766.62± 1049.81± 1420.25± 103 802.86±16 109 942.86±14 393.93 156.92 87.19 140.07 95.92 737.26**△△585.08**△△

表3　各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡率及Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)比較（——xx ±s）

圖2　Tu nel法檢測各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡結(jié)果（×200）

圖3　各組大鼠腎組織Ⅲ型膠原蛋白免疫組化染色結(jié)果（×200）

4.5孟根烏金-18味丸對大鼠腎組織金屬硫蛋白-1、金屬硫蛋白-2基因表達(dá)的影響

與正常對照組比較，氯化亞汞組大鼠腎組織MT-1 mRNNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.005），氯化汞組、氯化亞汞組大鼠腎組織MT-2 mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與孟根烏蘇炮制品組比較，氯化亞汞組大鼠腎組織中MT-1 mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.005）。結(jié)果見表4。

表4　各組大鼠腎組織MT-1、MT-2 mRNA表達(dá)比較（±s，2-ΔΔCt）

表4　各組大鼠腎組織MT-1、MT-2 mRNA表達(dá)比較（±s，2-ΔΔCt）

組別只數(shù)　　　　MT-1 MT T-2正常對照組10　　　11孟根烏蘇-18味丸孟根烏蘇-18味丸孟根烏蘇-18味丸孟根烏蘇炮制品硫化汞組氯化汞組氯化亞汞組低劑量組 10中劑量組 10高劑量組 10 組　10 10 10 10　0.72±0.1　0.78±0.3　0.90±0.4　0.95±0.5　0.99±0.1 0　0.79±0.1 0　1.35±0.3 12　0.90± 36　1.07± 6　1.11± 9　1.22± 1　1.22± 3　1.56± 34*△　　1.70± ±0.50 0.69 0.69 0.85 0.73 0.44*0.75**

5　討論

在前期實驗研究中，根根據(jù)孟根烏蘇-18味丸中汞的的含量，并參考考相關(guān)文獻(xiàn)研研究[11-12]，硫化汞組和氯化亞亞汞組汞攝入量與孟根烏蘇蘇-18味丸低劑量組相等，氯氯化汞組汞攝入量為20%設(shè)計進(jìn)行研究，結(jié)果在7 d給給藥實驗中，氯氯化亞汞組4只大鼠死亡，可能汞攝入量量過高導(dǎo)致大鼠腎功能衰竭竭。因此，在本研究中，氯化化亞汞組汞攝入量也設(shè)計為為孟根烏蘇-18味丸低劑量組組汞攝入量200%。

大鼠連續(xù)給藥15 d后后，孟根烏蘇-18味丸、孟孟根烏烏蘇炮制品、硫硫化汞、氯化化汞、氯化亞亞汞對其腎功功能無無影響，但氯化化汞組、氯化化亞汞組大鼠鼠腎臟指數(shù)顯顯著增增加，解剖肉眼觀察也有腫腫脹現(xiàn)象，表表明氯化汞、氯化化亞汞對大鼠腎臟造成一定定的損傷。腎腎臟病理檢查查結(jié)果果表明，孟根烏蘇-18味丸丸低劑量組大大鼠腎臟出現(xiàn)現(xiàn)一定定的病理損傷，表現(xiàn)為腎小小球輕度肥大大、腎小管上上皮中中度腫脹變性。課題組在7 d給藥實驗驗中也觀察到到，大大鼠腎小球輕度肥大，腎小小管上皮輕度度腫脹變性。故隨隨著給藥時間的延長，孟根根烏蘇-18味味丸對腎臟的的病理理損傷會有所所增加，尤其其對腎小管的的毒性作用更更顯著著。在本實驗中，觀察到孟孟根烏蘇-188味丸中、高高劑量量組腎臟也出現(xiàn)一定損傷，，硫化汞組、、氯化汞組、氯化化亞汞組大鼠腎病理變化更更顯著。這也也說明，雖然然孟根根烏蘇-18味丸丸中、高劑量量對大鼠腎組組織產(chǎn)生一定定的病病理損傷作用，但其毒性仍仍低于硫化汞汞、氯化汞、氯化化亞汞。腎汞檢測結(jié)果表明，孟根烏蘇蘇-18味丸和和孟根根烏蘇炮制品品組大鼠腎汞汞含量與正常常對照組無明明顯差差異，硫化汞組組大鼠腎汞蓄蓄積量有增高高趨勢，氯化化汞組組和氯化亞汞組大鼠汞攝入入量僅為孟根根烏蘇-18味味丸低低劑量組的220%，也引起起了腎汞的顯顯著蓄積。這與腎腎臟是重金屬屬汞蓄積器官官和靶器官相相符合，并與相關(guān)關(guān)研究結(jié)果相相符合[11-12]。在本實驗中中，孟根烏蘇炮制制品組與原復(fù)復(fù)方藥物組含含汞相當(dāng)，但但孟根烏蘇炮制品品組較原復(fù)方方藥物組引起起的腎汞蓄積積少，這一結(jié)果也也重復(fù)了我們們在7 d實驗中中觀察到的結(jié)結(jié)果，說明孟根烏烏蘇-18味丸復(fù)方可促進(jìn)進(jìn)孟根烏蘇炮炮制品中汞的生物物利用度。蒙蒙藥配方有君君臣佐使的關(guān)關(guān)系，也說明汞在在一定劑量范范圍內(nèi)有特定定的藥理作用用，亟待進(jìn)一步研研究。

有研究表明，汞可使線粒體內(nèi)自由基含量增加，刺刺激線粒體膜上蛋白酶活力改變，提高線粒體膜的通透透性，影響AATTP合成，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放，進(jìn)而誘誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。在本實驗中，腎汞蓄積量較多的氯化化汞組、氯化化亞汞組大鼠腎細(xì)胞凋亡顯著高于其他組。Ⅲ型膠原的合成、分泌增多及降解減少是許多腎臟疾病發(fā)展、細(xì)胞外基質(zhì)積聚和腎間質(zhì)纖維化的主要原因。在本實驗中，發(fā)現(xiàn)硫化汞組、氯化汞組、氯化亞汞組大鼠腎臟Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)顯著增強(qiáng)，說明Ⅲ型膠原蛋白的過度表達(dá)促進(jìn)了腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生，進(jìn)而影響了腎臟功能。

MT是一種富含巰基的金屬結(jié)合蛋白，汞與巰基有很強(qiáng)的親和力，與腎組織中含巰基蛋白結(jié)合是汞所致腎損傷的主要病理基礎(chǔ)。汞可誘導(dǎo)MT的表達(dá)，MT的表達(dá)可以部分拮抗汞的腎毒性作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，大鼠給予氯化汞、氯化亞汞1、7 d后，MT mRNA升高是可作為金屬暴露和毒性的生物標(biāo)志，而孟根烏蘇炮制品對MT的誘導(dǎo)遠(yuǎn)低于常見的汞化合物[4]。在本實驗中，氯化汞組大鼠腎組織中MT-2 mRNA表達(dá)顯著增高，氯化亞汞組大鼠腎組織中MT-1和MT-2 mRNA表達(dá)顯著增高，其他各組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。由于孟根烏蘇-18味丸和孟根烏蘇炮制品組大鼠腎汞蓄積量少，對機(jī)體的影響較小，因此對MT-1和MT-2的mRNA表達(dá)無影響，而氯化汞組、氯化亞汞組大鼠腎汞蓄積量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組，故顯著誘導(dǎo)MT-1和MT-2 mRNA的表達(dá)，這從一個側(cè)面反映出氯化汞、氯化亞汞的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于孟根烏蘇-18味丸、孟根烏蘇炮制品。硫化汞組大鼠腎組織汞蓄積量雖然與正常對照組無明顯差異，但有增高趨勢，并引起了腎臟Ⅲ型膠原蛋白的過度表達(dá)，但未引起MT-1和MT-2 mRNA表達(dá)的異常，可能與給藥劑量、給藥時間等有關(guān)。

此次研究提示，大鼠連續(xù)給藥15 d，孟根烏蘇-18味丸低劑量組大鼠未發(fā)現(xiàn)腎功能改變，以及腎細(xì)胞凋亡、膠原蛋白表達(dá)和MT-1、MT-2 mRNA表達(dá)的異常，但對腎組織產(chǎn)生一定的病理損傷，表明在臨床規(guī)定用藥劑量內(nèi)不會產(chǎn)生明顯毒副作用。但孟根烏蘇-18味丸中、高劑量組隨著給藥時間的延長，腎汞蓄積量會顯著增多，并對腎組織產(chǎn)生一定的病理損傷。提示劑量過大可能對腎臟產(chǎn)生一定的影響，其具體毒性機(jī)制有待深入研究。

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（修回日期：2015-07-06；編輯：華強(qiáng)）

Preliminary Investigation of Mongolian Meng-gen-wu-su (Mercury)-18-Composition Pills onRenal Toxicity in Rats

TONG Hai-ying1, FAN Ang-ran2, YU Xue2, ZHANG Yue1, WU Jisiguleng3, LI Jing4, HU Rilebagen4(1. Institute of Ethnic Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China; 2. School of Basic Medical Sciences, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China; 3. Inner Mongolia International Mongolian Medicine Hospital, Hohhot 010020, China; 4. College of Mongolian Medicine and Pharmacy, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, China)

Abstract:Objective To study the effects of Mongolian Meng-gen-wu-su (Mercury)-18-Composition Pills on renal toxicity in rats; To discuss its Renal Toxicity. Methods Eighty male Wistar rats were randomly divided into eight groups according to the weight (10 rats in each group): normal control group, low-, medium- and high-dose Meng-gen-wu-su-18-Composition Pills groups, Meng-gen-wu-su-18-Composition processed products group, mercuric sulfide group, mercuric chloride group and mercurous chloride group. After one week adaption, oral gavages were given to each group of rats for fifteen days. Serum UREA and CREA content and renal tissue morphological changes were detected; Mercury accumulation in kidney was determined by inductively coupled plasma optical emission spectroscopy and inductively coupled plasma source mass spectrometer; Apoptosis of renal cells was determined by TUNEL; Renal III type collagen protein expressions were determined by Immunohistochemical method; Kidney MT-1, MT-2 gene expression changes were determined by real-time fluorescence quantitative PCR. Results Afterbook=68,ebook=73fifteen-day oral gavages, the rat renal index of mercuric chloride group and mercurous chloride group increased significantly compared with normal control group and Meng-gen-wu-su-18-Composition processed products group (P<0.01); Rat serum CREA and UREA content in all groups had no significant difference. Renal pathologic examination results showed that glomerulus of low-dose Meng-gen-wu-su-18-Composition Pills group, which was commonly used in clinic, appeared some pathological damages, glomerulus appeared mild hypertrophy, renal tubule epithelia swelled to a low degree. The rat kidney of medium- and high-dose Meng-gen-wu-su-18-Composition Pills groups also appeared some damages and such changes were more significant in mercuric sulfide group, mercuric chloride group and mercurous chloride group. Compared with normal control group and Meng-gen-wu-su-18-Composition processed products group, the mercury kidney volume in mercuric chloride group and mercurous chloride group increased significantly (P<0.01); The renal cell apoptosis rates increased significantly in the groups of mercuric chloride and mercurous chloride (P<0.01); The III type collagen protein expressions increased significantly in the groups of mercuric sulfide, mercuric chloride and mercurous chloride (P<0.05). Compared with normal control group, MT-1 mRNA expressions increased significantly in the group of mercurous chloride (P<0.05); MT-2 mRNA expressions increased significantly in the groups of mercuric chloride and mercurous chloride (P<0.05, P<0.01); Compared with Meng-gen-wu-su-18-Composition processed products group, MT-1 mRNA gene expressions increased significantly in mercurous chloride group (P<0.05). Conclusion Meng-gen-wu-su-18-Composition Pills do not cause significant damage to the rat kidney under the clinical commonly used dose during the 15 days medication.

Key words:Meng-gen-wu-su-18-Composition Pills; mercuric compounds; renal toxicity; rats

收稿日期：（2015-06-18）

基金項目：國家科技支撐計劃（2012BAI27B05）

中圖分類號：R291.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1005-5304(2016)02-0067-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.019