環(huán)境脅迫對雙歧桿菌黏附能力和黏附相關蛋白的影響

朱德全, 栗金柳, 王茗悅, 孟祥晨, 許 龍, 周清波, 王長平, 薛 勇

(1. 佳木斯大學生命科學學院，黑龍江佳木斯 154007；2.東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030)

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環(huán)境脅迫對雙歧桿菌黏附能力和黏附相關蛋白的影響

朱德全1,2, 栗金柳1, 王茗悅1, 孟祥晨2*, 許 龍1, 周清波1, 王長平1, 薛 勇1

(1. 佳木斯大學生命科學學院，黑龍江佳木斯 154007；2.東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030)

雙歧桿菌是天然存在于人和動物腸道的微生物，對宿主發(fā)揮生物屏障、調(diào)節(jié)腸道菌群、提高免疫、抗炎和抗腫瘤等有益作用，所以經(jīng)常以益生菌的形式添加到乳制品和其他食品中。雙歧桿菌的黏附定植是持續(xù)發(fā)揮益生作用的前提基礎。然而，雙歧桿菌在生產(chǎn)、包裝、運輸、儲藏和消費過程中受到許多環(huán)境脅迫因素(如熱、氧、酸、膽鹽和滲透壓等)的影響。這些環(huán)境因素會影響雙歧桿菌黏附能力和黏附相關蛋白的表達。對環(huán)境脅迫對雙歧桿菌存活的影響、雙歧桿菌黏附能力的影響因素和環(huán)境脅迫對黏附相關蛋白的影響等方面的研究進展進行了綜述。

雙歧桿菌；黏附；定植；黏附相關蛋白；環(huán)境脅迫因素

雙歧桿菌是人和動物腸道最常見的革蘭氏陽性有益細菌，約占人體腸道可培養(yǎng)微生物的10%。大量研究表明，雙歧桿菌對宿主具有多種益生功能，可以通過平衡腸道菌群維持機體的整體健康水平。因此，雙歧桿菌屬的微生物是應用較多的益生菌之一，在食品中通常通過添加于乳制品進行食用。雙歧桿菌的黏附是發(fā)揮益生功能的前提和先決條件，雙歧桿菌經(jīng)食用后進入體內(nèi)，其益生功能的發(fā)揮與在腸道的黏附與定植密切相關，如黏附能夠縮短痢疾持續(xù)時間[1]、刺激免疫應答[2-3]、競爭排斥病原微生物[4]等。因此，腸道黏附定植能力是篩選益生菌的一個重要標準[5]。雙歧桿菌在生產(chǎn)、包裝、運輸、儲藏和消費過程中受到許多環(huán)境脅迫因素(如熱、氧、酸、膽鹽和滲透壓等的影響，這些環(huán)境因素會影響雙歧桿菌多方面的生理特性，如微生物生長及存活、菌體表面特性、黏附能力、黏附相關蛋白的表達等。筆者對環(huán)境脅迫對雙歧桿菌存活的影響、雙歧桿菌黏附能力的影響因素、環(huán)境脅迫對黏附相關蛋白的影響等方面的研究進展進行了綜述。

1　環(huán)境脅迫對雙歧桿菌成活的影響

不同種類的雙歧桿菌菌株對環(huán)境脅迫的耐受能力不同，具有種屬特異性。環(huán)境脅迫條件下雙歧桿菌對的存活率，存活率從高到低依次為動物雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、長雙歧桿菌等。研究表明，兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌對模擬的胃液環(huán)境表現(xiàn)出非常低的耐受能力，這與Takahashi等[6]的研究結果一致。Mainville等[7]研究表明動物雙歧桿菌的耐酸性顯著高于長雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌的耐酸性，Matto的研究也同樣證實了這一結果。Saarela M等[8]以動物雙歧桿菌E2010和長雙歧桿菌E1884為研究對象，分別用pH 3.0和pH 4.0的磷酸鹽溶液對其處理2 h，再用1.4%膽鹽處理3 h，結果表明長雙歧桿菌E1884經(jīng)過酸處理后存活率顯著下降，經(jīng)過膽鹽處理后，幾乎不生長；進一步研究了雙歧桿菌脅迫適應和細菌固有的交叉保護機制，長雙歧桿菌E1884和動物雙歧桿菌E2010分別經(jīng)過pH 3.5預處理后其在1.4%膽鹽中的存活率有所提高。Maus J E等[9]將乳雙歧桿菌短時間暴露在復合脅迫環(huán)境中，發(fā)現(xiàn)能提高其耐酸能力。這說明不同雙歧桿菌對脅迫環(huán)境的抵抗能力存在菌株差異，而且在交叉脅迫環(huán)境中，雙歧桿菌的存活率升高還是降低與脅迫因素、各因素處理時間和菌株種類等都有關系。目前對雙歧桿菌脅迫環(huán)境的研究主要集中于膽鹽脅迫、酸脅迫、多種消化酶等單一脅迫因素的研究。

2　雙歧桿菌黏附能力的影響因素

研究雙歧桿菌與腸細胞的黏附通常體外采用細胞系來進行，這主要是由于人體實驗實施相對困難，而且腸道環(huán)境復雜。人結腸癌細胞系(如Caco-2細胞株)，由于在體外所表現(xiàn)出的形態(tài)和功能特征能夠模擬成熟腸道上皮細胞，經(jīng)常作為體外模型用于評價益生菌的黏附和定植能力。目前，關于雙歧桿菌的黏附研究較多，而對于經(jīng)歷脅迫后的菌體黏附相對研究較少。

2.1黏附具有種株差異性和宿主差異性不同菌株與腸道上皮細胞黏附能力各不相同，可能是不同菌株表面也存在著不同的與黏附有關的物質。因此，不同生境雙歧桿菌的黏附能力存在菌株及菌種的差異性。李平蘭等[10]對來自豬和人類糞便中不同種類的乳酸菌在體外與人結腸癌細胞系HT-29細胞進行黏附，結果發(fā)現(xiàn)在所有受試菌株中雙歧桿菌的黏附能力最高，而乳桿菌的黏附能力則相對較低；其他菌屬的黏附能力則介于乳桿菌屬和雙歧桿菌屬之間，充分體現(xiàn)了細菌對腸道細胞黏附過程中的菌屬差異性。 Del Re B等[11]對13株長雙歧桿菌的黏附能力進行了測定，結果發(fā)現(xiàn)存在明顯的菌株差異。He等[12]研究表明不同的雙歧桿菌菌株對腸黏膜的黏附能力不同，從健康成年人糞便中分離的雙歧桿菌對腸黏膜的黏附能力明顯高于老年人，其中青春型雙歧桿菌表現(xiàn)得尤為明顯。He等[13]研究還發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌的黏附具有宿主特異性，從人糞便中分離出的雙歧桿菌對腸黏膜的黏附能力強于其對牛腸黏膜的黏附能力。

2.2雙歧桿菌黏附與菌體的“死、活”狀態(tài)有關一般認為，只有活菌才具有黏附能力。Fourniat等[14]研究表明死乳桿菌也具有與活菌相同的黏附能力。倫永志等[15]對雙歧桿菌菌懸液用65 ℃水浴30 min和100 ℃水浴10 min滅活處理后，發(fā)現(xiàn)滅活的雙歧桿菌與活菌均能黏附于腸上皮細胞周圍，黏附具有顯著的濃度效應。Wang L Q等[5]也發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌的死活狀態(tài)不是影響?zhàn)じ侥芰Φ囊蛩?。由于死菌本身具有極高的穩(wěn)定性和安全性，這就為雙歧桿菌的臨床應用提供了一條新途徑。但是，目前這一觀點尚未被廣泛接受，用于臨床的微生態(tài)制劑大多為活菌制劑。

2.3環(huán)境因素對雙歧桿菌表面性質和黏附能力的影響雙歧桿菌的黏附能力易受環(huán)境中多種因素的影響。研究表明，兩歧雙歧桿菌與Caco-2細胞和HT-29細胞黏附的過程中黏附能力很大程度依賴于環(huán)境變化，其中影響較大的包括pH和膽鹽。雙歧桿菌與人腸上皮細胞的體外黏附受pH等外界環(huán)境的影響。王彥等[16]用低pH的PBS處理兩歧雙歧桿菌，結果表明不同pH的PBS溶液處理后的兩歧雙歧桿菌的黏附能力均發(fā)生不同程度下降。2001年，Ouwehand等[17]研究發(fā)現(xiàn)BB12與1%和10%的膽鹽共同作用后，黏附能力均顯著低于未處理組。Guglielmetti S等[18]對兩歧雙歧桿菌MMBb75的研究表明雙歧桿菌經(jīng)過濃度為3%牛膽鹽處理后，對Caco-2細胞的黏附能力極顯著下降，這與Gmez Zavaglia A等[19]的研究結果一致。Gmez Zavaglia A等[19]分析膽鹽的存在降低了雙歧桿菌表面疏水性同時使菌體表面電勢升高，致使雙歧桿菌的黏附能力降低。Candela等[20]研究表明膽鹽提高了雙歧桿菌乳亞種BI07對宿主人纖溶酶原系統(tǒng)的相互作用，并推測消化系統(tǒng)中的膽鹽是雙歧桿菌黏附在腸道中的原因。因此，關于膽鹽對雙歧桿菌粘附影響的研究存在矛盾性。2009年，Guglielmetti等[18]研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌與Caco-2和HT-29細胞的黏附也取決于環(huán)境條件(如糖、膽鹽和pH等)，當存在果糖和甘露糖時MIMBb75與Caco-2的黏附升高；當存在牛膽鹽時，二者之間的黏附下降；此外，pH同樣會顯著影響細菌與Caco-2細胞的黏附以及細菌的自動聚集能力。這些研究表明雙歧桿菌對腸道細胞的黏附作用是具有鈣依賴性的，但鈣離子濃度過大使得滲透壓增大，反而會降低雙歧桿菌的黏附能力，無機鹽離子也會影響雙歧桿菌的黏附能力。

雙歧桿菌處于脅迫環(huán)境中，細胞表面物質和自動聚集能力受環(huán)境脅迫因素的影響，進而影響?zhàn)じ侥芰?。王彥等[16]用低pH的PBS處理兩歧雙歧桿菌，結果表明非致死pH 3.0和pH 3.5處理的雙歧桿菌疏水性顯著提高，自動聚集能力顯著降低。1998年，Pérez等[21]用低pH處理和胰蛋白酶雙歧桿菌CIDCA5310和CIDCA5317，測定其表面性質的變化，結果發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶使CIDCA5310的自動聚集能力喪失，而對沒有聚集能力的CIDCA5317無影響。低pH處理改變了Zeta電勢，對自動聚集能力有較大影響。因此，影響自動聚集能力的可能是表面的特異性蛋白和菌體表面電荷。Canzi等[22]測定了30株雙歧桿菌的表面物理化學性質，結果發(fā)現(xiàn)B.bifdum和B.adolescentis具有最強的自動聚集能力，且受介質pH的影響；此外，經(jīng)蛋白酶處理后菌株的自動聚集能力有較大變化。因此，自動聚集能力與表面的特異性蛋白有關。Collado等[23]采用BATH測定表面疏水性和聚集能力相關性的研究發(fā)現(xiàn)對碳氫化合物具有越高黏附能力的細菌其自動聚集能力也較強，二者具有正相關性。雙歧桿菌由于不同菌株表面物質存在的差異性，黏附素種類的差異性等導致不同雙歧桿菌在相同脅迫處理下表面性質的變化也存在較大差異。

3　環(huán)境脅迫對雙歧桿菌黏附蛋白的影響

由于菌體細胞表面蛋白質和分泌到細胞外的蛋白是參與黏附的關鍵蛋白質，脅迫又會誘導這些蛋白質表達或編碼這些蛋白的基因的轉錄水平發(fā)生變化。Candela等[20]研究表明膽鹽提高了動物雙歧桿菌乳亞種BI07與宿主人纖溶酶原系統(tǒng)的相互作用，表明消化道的膽鹽環(huán)境對該菌與宿主相互作用過程具有潛在的影響。蛋白質組學研究表明，動物雙歧桿菌乳亞種[20]和長雙歧桿菌[24]長時間暴露于膽鹽環(huán)境會導致菌體表面的人纖溶酶原黏附受體——DnaK和烯醇化酶上調(diào)。雖然雙歧桿菌表面的人纖溶晦原受體(DnaK和烯醇化酶)的上調(diào)參與了這一過程，但也不能排除其他機制的參與。Weiss等[25]對嗜酸乳桿菌NCFM應激與黏附相關基因的轉錄水平的研究發(fā)現(xiàn)，該菌在經(jīng)歷體外模擬消化道時編碼應激相關蛋白質(GroEI、DnaK、ClpP)的基因在胃液環(huán)境中顯著上調(diào)，在十二指腸液環(huán)境中顯著下調(diào)；編碼黏附相關蛋白質(黏蛋白結合蛋白、纖連蛋白結合蛋白、S-層蛋白)的基因在唾液和胃液環(huán)境中不受影響，而其在十二指腸液和膽鹽環(huán)境中顯著上調(diào)。Jin等[26]分析了長雙歧桿菌BBMN68在酸適應和生長的不同階段ffh、uvrA、groES和dnaK基因轉錄水平的變化，發(fā)現(xiàn)這些基因在生長的穩(wěn)定期被顯著誘導，但并不被酸脅迫誘導；酸適應120 min后，ffh和uvrA基因的下調(diào)表明長雙歧桿菌的酸適應在基因表達水平上不同于其他細菌。目前，針對環(huán)境脅迫對雙歧桿菌黏附蛋白的研究不是很多，大多數(shù)都是研究正常細菌對細胞的黏附。

4　小結

由于益生菌定植于人體腸道發(fā)揮益生作用前，會受到胃液的酸性環(huán)境和小腸膽鹽、消化酶、滲透壓等多重環(huán)境因素的影響，這些環(huán)境因素一方面對益生菌的存活造成一定的影響，另一方面通過影響菌體表面的疏水性、物理性質和自動聚集能力以及菌體表面蛋白的表達，從而改變菌體在腸道的黏附定植能力，可能會進一步影響益生菌在人體內(nèi)益生作用的發(fā)揮。

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Effects of Environmental Stress on Adhesion Ability and Proteins Related to Adhesion of Bifidobacteria

ZHU De-quan1,2, LI Jin-liu1, WANG Ming-yue1, MENG Xiang-chen2*et al

(1. College of Life Science, Jiamusi University, Jiamusi, Heilongjiang 154007; 2. Key Laboratory of Dairy Science of Ministry of Education, Northeast Agricultural University, Harbin, Heilongjiang 150030)

Bifidobacteria which are commensal microorganisms of the human and animal gastrointestinal tract (GIT) are being incorporated increasingly into dairy and other products, because of the health benefits(regulating intestinal flora, improving immunity, anti-inflammation and anti-tumor) provided by them. The adhesion and colonization abilities of bifidobacteria are critical prerequisites for performing their physiological functions. However, it must encounter a lot of stresses occurring during their production, package, delivery, storage and consumption (e.g. heat, oxygen, acid, bile, osmotic, etc). These stress factors will influence adhesion ability and expression of adhesive proteins bifidobacteria. The research advances of effects of environmental stress on bifidobacteria survival, adhesion ability and proteins related to adhesion were reviewed.

Bifidobacteria; Adhesion; Colonization; Adhesion related proteins; Environmental stress factors

佳木斯大學科研項目((S2011-049)。

朱德全(1980- )，男，貴州遵義人，講師，博士，從事微生物生物技術研究。 *通訊作者，教授，博士生導師，從事微生物生物技術研究。

2016-06-12

S 182

A

0517-6611(2016)21-131-03