肖廣俠，徐文遠，賈磊，鄭德斌，韓現(xiàn)芹，陳春秀

1. 天津渤海水產(chǎn)研究所，天津 300457 2. 臨沂市羅莊區(qū)水務(wù)局，臨沂 276000 3. 臨沂出入境檢驗檢疫局，臨沂 276034

懸浮物對褐牙鲆抗氧化酶活性及相關(guān)基因表達的影響

肖廣俠1,2，徐文遠3，賈磊1,*，鄭德斌1，韓現(xiàn)芹1，陳春秀1

1. 天津渤海水產(chǎn)研究所，天津 300457 2. 臨沂市羅莊區(qū)水務(wù)局，臨沂 276000 3. 臨沂出入境檢驗檢疫局，臨沂 276034

為探究褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)幼魚抗氧化系統(tǒng)酶活力及相關(guān)基因表達在懸浮物脅迫下的變化情況，設(shè)計了濃度為5 000、10 000 mg·L-1懸浮物水體對褐牙鲆(14.53 cm±1.58 cm)肌肉、肝臟、鰓及血液總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)、過氧化氫酶(CAT)酶活力及SOD2、GST、CAT的mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達變化情況。結(jié)果顯示：在懸浮物脅迫24 h或者48 h時，4種組織3種酶活力具有升高的趨勢(P<0.05)；4種組織的T-SOD酶活力在96 h均高于對照組(P<0.05)，肌肉、鰓絲及血液中SOD2基因相對表達量96 h實驗組低于對照組(P<0.05)；肌肉中CAT酶活力呈現(xiàn)先升高再降低趨勢，鰓中CAT基因相對表達量呈現(xiàn)先降低、再升高、再降低的趨勢；肝臟、鰓、血液中GST酶活力在懸浮物脅迫下呈現(xiàn)升高趨勢，4種組織GST基因相對表達量在12～24 h時呈現(xiàn)升高趨勢。研究表明：懸浮物對褐牙鲆抗氧化酶活力及相關(guān)基因的表達具有一定的影響，血液中3種酶活力變化幅度最大，鰓中3種基因相對表達水平變化幅度最大，這與血液及鰓參與呼吸作用過程有關(guān)；抗氧化酶活性及基因相對表達變化趨勢并不完全一致。本研究可為揭示褐牙鲆應(yīng)對懸浮物脅迫的耐受機制及褐牙鲆耐懸浮物品種選育提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

懸浮物；褐牙鲆；抗氧化系統(tǒng)酶；基因表達

Received 20 April 2016 accepted 18 June 2016

褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)隸屬于鰈形目(Pleuronectiformes)、牙鲆科(Paralichthyidae)、牙鲆屬(Paralichthys)，是肉食性底棲魚類，在發(fā)育中有變態(tài)過程。褐牙鲆主要分布于中國以及朝鮮、日本沿岸水域，是我國重要的海水增養(yǎng)殖品種[1]。近幾年來，隨著我國海洋經(jīng)濟的發(fā)展，港口碼頭建設(shè)、橋梁建設(shè)、填海造地及疏浚傾廢等海洋工程越來越多，其施工過程中不可避免地產(chǎn)生水體底泥懸浮，造成附近海域懸浮物濃度大幅度升高，改變了水域的物理、化學(xué)環(huán)境[3]，這對于海洋生物尤其是苗種的存活產(chǎn)生了顯著的影響，生物機體如何對懸浮物的升高做出反應(yīng)，在這方面報告較少?？寡趸到y(tǒng)酶是生物體內(nèi)應(yīng)對不利環(huán)境條件的重要物質(zhì)，在生物處于不適宜的生存條件下，抗氧化系統(tǒng)各種酶的活力會發(fā)生變化，來應(yīng)對外界的環(huán)境條件，這對環(huán)境污染有一定的生物指示作用[4]。目前針對脅迫褐牙鲆抗氧化系統(tǒng)酶活力的因子研究主要集中于重金屬及環(huán)境因子[5-13]，懸浮物對水產(chǎn)動物抗氧化系統(tǒng)酶的影響方面見于菲律賓蛤仔[14]及四角蛤蜊[15]，蔣玫等[16]研究了底泥浸出液對脊尾白蝦抗氧化解毒酶及相關(guān)基因表達的影響，但懸浮物對褐牙鲆抗氧化酶活性及相關(guān)基因方面的研究尚無報道。

針對以上2種情況，本實驗以2種規(guī)格褐牙鲆幼魚為實驗材料，研究肌肉、鰓、肝臟及血液在2種懸浮物濃度下總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)、過氧化氫酶(CAT)酶活力及SOD2、GST、CAT的mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達變化情況，分析了褐牙鲆幼魚底泥懸浮物的耐受免疫調(diào)節(jié)機制，以期為褐牙鲆的抗逆品種選育及增殖放流區(qū)域選擇提供理論依據(jù)，為進一步評估海洋工程對養(yǎng)殖生物的損害情況提供參考依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗魚

實驗用褐牙鲆幼魚取自于天津市興盛水產(chǎn)有限公司。幼魚體長14.53 cm±1.58 cm。挑選健康、活潑、大小均勻的個體用于實驗。

1.1.2 實驗用水

實驗用水為高鹽鹵水與淡水混合溶液，經(jīng)過沉淀、砂濾、次氯酸鈉消毒、篩絹過濾等處理。水溫為(22±1) ℃；鹽度為25～28；pH為8.0～8.2；溶解氧(OD)為5.8～7.5 mg·L-1；NH4-N為0.012～0.248 mg·L-1；NO2-N為0.005～0.011 mg·L-1；NO3-N為0.287～0.363 mg·L-1；PO4-P為0.012～0.025 mg·L-1。

1.1.3 實驗底泥

實驗用懸浮物泥樣采自天津大神堂海域(117°55′18″E；39°09′01″N，位于漢沽淺海生態(tài)系統(tǒng)海洋特別保護區(qū)，在整個保護區(qū)內(nèi)具有代表性)的底泥表層，實驗室內(nèi)通風(fēng)晾干，然后放于烘箱中(80 ℃)烘干至恒重，冷卻后研磨處理，用100目篩絹過篩，放置于干燥器中低溫保存。實驗所用沉積物中各成分含量檢測參照《海洋監(jiān)測規(guī)范》(GB17378—2007)進行，分析結(jié)果見表1。其主要成分含量均符合《海洋監(jiān)測規(guī)范》(GB 18668—2002)一類要求，不會對受試生物產(chǎn)生毒害作用。

1.2 實驗方法

1.2.1 含懸浮物的懸濁液的配制方法

將烘干泥樣與海水按所需濃度配制出含懸浮物的懸濁液，實驗前充分攪拌，使底泥充分懸浮。

1.2.2 懸浮物粒徑的測量

懸浮物粒徑使用維納2008D激光粒度儀測量，底泥粒徑X80=12.70 μm，粒徑X<5 μm=29.98%，具體粒度特征見表2。

1.2.3 暴露實驗設(shè)計

暴露實驗參照國家標準水質(zhì)-物質(zhì)對淡水魚(斑馬魚)急性毒性測定方法[5]進行，褐牙鲆幼魚暫養(yǎng)24 h后開始實驗，含懸浮物的懸濁液濃度設(shè)置為5 000、10 000 mg·L-1，每個濃度均設(shè)置5個平行組，另外設(shè)置相應(yīng)的對照組(不加泥樣)。實驗容器為15 L透明整理箱，每個整理箱加入各濃度含懸浮物的懸濁液10 L，放入實驗魚4尾，整個實驗過程不投餌。采用充氣及人工定時攪拌等方法，使底泥始終處于懸浮狀態(tài)。實驗期間不換水。懸浮物脅迫后24、48、72、96 h分別從每個實驗組隨機挑選3尾幼魚取樣。

1.2.4 樣品處理

剪取褐牙鲆幼魚鰓、背部肌肉及肝臟按照 1:10(W/V)加入預(yù)冷磷酸緩沖液(PBS)(pH 6.4)放置冰上以玻璃勻漿器勻漿，離心(4 ℃、800 g、10 min)取上清液置-80 ℃冰箱保存，抽取褐牙鲆幼魚心臟血液并加入抗凝劑，用于T-SOD、GST、CAT抗氧化酶活性的測定，將鰓、背部肌肉、肝臟及心臟血液樣本于-80 ℃冰箱保存，用于抗氧化酶相關(guān)基因表達的測定。

1.2.5 抗氧化酶活性的測定

T-SOD、GST、CAT酶活力測定均根據(jù)試劑盒說明書進行(試劑盒購自南京建成生物工程研究所)。其中37 ℃時，每分鐘每毫克組織蛋白使反應(yīng)體系的吸光度(OD)值每增加0.01時，定義為1個總抗氧化能力(T-SOD)單位；每毫克組織蛋白質(zhì)，每分鐘扣除非酶反應(yīng)的作用，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol·L-1為一個GST酶活力單位；每毫克組織蛋白每秒鐘分解1 μmol的H2O2的量為1個CAT活力單位[17]。所有指標吸光值均使用UV-7504單光束紫外可見分光光度計測定。

表1 實驗底泥主要成分含量Table 1 Contents of main components of the studied sediment

注：數(shù)據(jù)委托農(nóng)業(yè)部漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(天津)檢測。Note: The data was provided by the Fisheries Environment and Aquatic Products Quality Supervision and Testing Center of Ministry of Agriculture (Tianjin).

表2 實驗用底泥粒徑特征Table 2 Particular size distribution of the sediment used in the experiment

1.3 抗氧化酶基因的表達

1.3.1 引物設(shè)計

根據(jù)褐牙鲆SOD2、CAT、GST的cDNA序列，以Primer 5.0設(shè)計Real-time PCR擴增特異性引物，選擇基因穩(wěn)定表達及片段大小適合的β-actin為內(nèi)參基因，引物序列詳見表3。引物合成和cDNA序列測定委托上海生工生物工程有限公司完成。

1.3.2 總RNA提取cDNA第一鏈的合成

將保存于-80 ℃冰箱的樣品取出后于冰上融化，并按照TRIZOL試劑說明書提取總RNA，RNA沉淀用RNAase的純水溶解，用核酸定量儀(Thermo Scientific)測定260 nm和280 nm處的吸收值，檢測RNA的產(chǎn)量和純度，并使用1%瓊脂糖凝膠進行RNA非變性電泳檢測RNA的完整性。取等量(2 μg)的RNA，按照All-in-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit (GeneCopoeia Cat. No. AORT-0050)說明書反轉(zhuǎn)錄各組織的總RNA，合成cDNA第一鏈。

1.3.3 Real-time PCR擴增

采用Real-time PCR(SYBR Green)2-△△Ct相對定量方法，按照Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMix-UDG試劑盒說明書進行操作，反應(yīng)體系如下：反應(yīng)總體積共20 μL，SYBR?Premix Ex Super Mix (2×) 10.0 μL，F(xiàn)orward primer (10 μmol·L-1) 2.0 μL，Reverse primer (10 μmol·L-1) 2.0 μL，cDNA 1.0 μL，dd H2O 5.0 μL。將樣品在PCR管內(nèi)混勻后分裝入96孔PCR板(Axygen)中，瞬時離心后放入ABI7500熒光定量PCR儀中進行PCR擴增，反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性10 min；循環(huán)條件為95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共40個循環(huán)；熔解曲線條件為95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s。反應(yīng)完成后，用ABI 7500 system分析軟件分析結(jié)果。

1.3.4 Comparative Delta-delta Ct相對定量

由標準曲線可知，目的基因與內(nèi)參擴增效率基本一致，均在95%以上，符合Comparative Delta-delta Ct相對定量計算要求，Comparative Delta-delta Ct相對定量參考Livak和Schmittgen的方法[18]，計算公式如下：

目的基因的表達量定義為：待測樣品與對照組表達差異倍數(shù)(Fold change)。

Fold change=2-ΔΔCt。

1.4 實驗數(shù)據(jù)的處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 22.0進行，所得數(shù)據(jù)均以平均值±標準差(x±SD)表示，使用單因素方差分析ANOVA進行顯著性檢驗(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 懸浮物脅迫對褐牙鲆幼魚T-SOD酶及相關(guān)基因表達的影響

懸浮物對褐牙鲆幼魚不同組織T-SOD酶活力及相關(guān)基因表達的影響見圖1、圖2，T-SOD酶活力以SOD2的mRNA表達為介導(dǎo)，隨著懸浮物濃度的不同和脅迫時間的改變，這些指標都有顯著變化。實驗結(jié)果表明：肌肉及鰓中T-SOD酶活力呈現(xiàn)先升高、再降低、再升高的趨勢，在10 000 mg·L-1實驗組，鰓、背部肌肉、肝臟及心臟血液這4種組織的T-SOD酶活力在96 h達到峰值，與對照組差異顯著(P<0.05)，4種組織酶活性由高到低排序為，肝臟、血液、鰓及肌肉。在5 000 mg·L-1實驗組，肝臟及鰓中SOD2基因相對表達量呈現(xiàn)先降低、再升高、再降低的趨勢，分別在48 h、72 h達到峰值(P<0.05)，在10 000mg·L-1實驗組，鰓及血液中SOD2基因相對表達量呈現(xiàn)先降低、再升高、再降低的趨勢，在72 h達到峰值(P<0.05)。

表3 Real-time PCR擴增的特異性引物Table 3 Primers used for real-time PCR amplification

圖1 褐牙鲆不同組織T-SOD活性隨懸浮物脅迫時間的變化注：A，肌肉；B，肝臟；C，鰓絲；D，血液。*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)。Fig. 1 Changes of total superoxide dismutase activity in different P. olivaceus tissues after exposure to suspended substances (SS) stressNotes: A, Muscle; B, Livers; C, Gill; D, Blood. * means significant difference between SS stress groups and control group at 0.05 level.

圖2 褐牙鲆不同組織SOD2基因相對表達量隨懸浮物脅迫時間的變化注：A，肌肉；B，肝臟；C，鰓絲；D，血液。*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)。Fig. 2 Changes of superoxide dismutase 2 gene expression in different P. olivaceus tissues after exposure to SS stressNotes: A, Muscle; B, Livers; C, Gill; D, Blood. * means significant difference between SS stress groups and control group at 0.05 level.

2.2 懸浮物脅迫對褐牙鲆CAT酶及相關(guān)基因表達的影響

懸浮物對褐牙鲆幼魚不同組織CAT酶活力及相關(guān)基因表達的影響見圖3、圖4，CAT酶活力以CAT的mRNA表達為介導(dǎo)，隨著懸浮物濃度的不同和脅迫時間的改變，這些指標都有顯著變化。實驗結(jié)果表明：在5 000 mg·L-1實驗組，肝臟及血液中CAT酶活力均高于對照組(P<0.05)，分別在24 h及48 h達到峰值，在10 000 mg·L-1實驗組，肌肉和血液中CAT酶活力呈現(xiàn)先升高、再降低的趨勢。在5 000 mg·L-1實驗組，肌肉及肝臟中CAT基因表達量在24至72 h呈現(xiàn)先升高、再降低的趨勢，并且在24 h達到峰值(P<0.05)，在10 000 mg·L-1實驗組，在肝臟及鰓中CAT基因表達量在48 h達到峰值(P<0.05)。

2.3 懸浮物脅迫對褐牙鲆GST酶及相關(guān)基因表達的影響

懸浮物對褐牙鲆幼魚不同組織GST酶活力及相關(guān)基因表達的影響見圖5及圖6，GST酶活力以GST的mRNA表達為介導(dǎo)，隨著懸浮物濃度的不同和脅迫時間的改變，這些指標都有顯著變化。實驗結(jié)果表明：肝臟、鰓及血液中實驗組GST酶活力高于對照組(P<0.05)，24至72 h肌肉中實驗組GST酶活力高于對照組(P<0.05)。24至48 h 4種組織GST基因相對表達量，實驗組高于對照組(P<0.05)，分別在24 h或者48 h達到峰值(P<0.05)，在5 000 mg·L-1實驗組，肝臟及鰓中GST基因相對表達量呈現(xiàn)先升高、再降低、再升高的趨勢，并且在24 h達到峰值(P<0.05)。

3 討論(Discussion)

活性氧主要包括超氧陰離子(O2-·)、羥自由基和H2O2，其中超氧陰離子的壽命最長[19]。適量的活性氧對機體具有一定的保護作用，但過量的活性氧可導(dǎo)致氧化脅迫[20]。體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)由非酶類及酶促體系組成，后者包括過氧化氫酶、過氧化物還原酶等，機體通過抗氧化系統(tǒng)清除過量的活性氧，保護各組織免受氧化損傷[21]。

3.1 懸浮物對褐牙鲆總超氧化物歧化酶(T-SOD)活力及相關(guān)基因的影響

SOD能催化超氧化物陰離子自由基(O2-·)發(fā)生歧化反應(yīng)，能及時清除生物體內(nèi)的O2-·自由基，避免·OH的產(chǎn)生，避免機體受損傷，是機體內(nèi)唯一以O(shè)2-·為底物的酶，在清除生物體內(nèi)有害物質(zhì)時發(fā)揮著重要的作用。已有研究表明，當(dāng)生物體受到輕度逆境脅迫時，SOD活性往往升高；而當(dāng)受到重度逆境脅迫下，SOD活性通常降低，使生物體內(nèi)積累過量的活性氧，從而導(dǎo)致生物體的損傷[22-24]。

圖3 褐牙鲆不同組織CAT活性隨懸浮物脅迫時間的變化注：A，肌肉；B，肝臟；C，鰓絲；D，血液。* 表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)。Fig. 3 Changes of catalase activity in different P. olivaceus tissues after exposure to SS stressNotes: A, Muscle; B, Livers; C, Gill; D, Blood. * means significant difference between SS stress groups and control group at 0.05 level.

圖4 褐牙鲆不同組織CAT基因相對表達量隨懸浮物脅迫時間的變化注：A，肌肉；B，肝臟；C，鰓絲；D，血液。* 表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)。Fig. 4 Changes of catalase relative gene expression in different P. olivaceus tissues after exposure to SS stressNotes: A, Muscle; B, Livers; C, Gill; D, Blood. * means significant difference between SS stress groups and control group at 0.05 level.

圖5 褐牙鲆不同組織GST活性隨懸浮物脅迫時間的變化注：A，肌肉；B，肝臟；C，鰓絲；D，血液。* 表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)。Fig. 5 Changes of glutathions S-transferase activity in different P. olivaceus tissues after exposure to SS stressNotes: A, Muscle; B, Livers; C, Gill; D, Blood. * means significant difference between SS stress groups and control group at 0.05 level.

圖6 褐牙鲆不同組織GST基因相對表達量隨懸浮物脅迫時間的變化注：A，肌肉；B，肝臟；C，鰓絲；D，血液。* 表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)。Fig. 6 Changes of glutathions S-transferase relative gene expression in different P. olivaceus tissues after exposure to SS stressNotes: A, Muscle; B, Livers; C, Gill; D, Blood. * means significant difference between SS stress groups and control group at 0.05 level.

本研究中對褐牙鲆4種組織的T-SOD酶活性進行研究，肌肉及鰓中T-SOD酶活力呈現(xiàn)先升高、再降低、再升高的趨勢。開始可能是懸浮物脅迫誘導(dǎo)褐牙鲆肌肉及鰓中T-SOD酶活性，褐牙鲆組織反饋性增強抗氧化系統(tǒng)酶活力，以清除多余的活性氧；4種組織T-SOD酶活性在96 h達到峰值，4種組織酶活性大小不同，最高為肝臟，依次為血液、鰓，最后為肌肉，這可能與不同組織的功能定位有關(guān)。由于活性氧伴隨物質(zhì)代謝過程而產(chǎn)生，因此代謝強度愈大，產(chǎn)生的活性氧越多。肝臟是魚類最主要的代謝器官，也是蛋白質(zhì)、脂類等營養(yǎng)物質(zhì)的代謝中心，需要更強的抗氧化體系清除肝臟中的多余活性氧，因此肝臟中T-SOD酶活性高于其他3種組織。T-SOD酶活性及基因表達在受到懸浮物脅迫后，4種組織中T-SOD酶活力在開始的24或者48 h內(nèi)存在一定增加的傾向，這與Stebbing提出的“毒物興奮效應(yīng)”表現(xiàn)類似[25]。但是脅迫時間過長，如肌肉及鰓中T-SOD酶活力在72 h呈現(xiàn)下降趨勢，實驗組低于對照組，表明長時間懸浮物脅迫可能對褐牙鲆抗氧化系統(tǒng)酶活力產(chǎn)生抑制作用。

懸浮物脅迫能引發(fā)多種動物響應(yīng)，包括調(diào)控基因表達。在轉(zhuǎn)錄水平上研究基因表達與動物抗氧化性的關(guān)系，能對抗氧化酶激活機制有更深入地了解，而不僅僅停留在酶活性方面，抗氧化酶活性的變化可能是由于相關(guān)基因的上調(diào)或下調(diào)引起的。實驗組的鰓、5 000 mg·L-1實驗組的肝臟及10 000 mg·L-1實驗組的血液中SOD2基因相對表達量呈現(xiàn)先降低、再升高、再降低的趨勢，分別在48 h、72 h達到峰值(P<0.05)，這與組織中T-SOD酶活力的變化趨勢不一致，推測原因如下：第一、mRNA水平與蛋白水平不一定完全一致，可能有時間上的差異；第二、檢測蛋白的方法干擾有很多，檢測方法的靈敏度不一樣也有可能造成差異；第三、mRNA的表達與蛋白的表達水平的線性關(guān)系只有0.4～0.5左右，因為影響蛋白質(zhì)半衰期的因素很多，mRNA轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控、各種翻譯后的修飾等都可能延長或者縮短其半衰期[26]。

3.2 懸浮物對褐牙鲆過氧化氫酶(CAT)活力及相關(guān)基因的影響

CAT能及時清除機體內(nèi)的H2O2，阻斷可產(chǎn)生活性極高的羥自由基(·OH)的Haber-Weiss反應(yīng)[26]，在外源因子脅迫下會造成細胞膜損傷和膜透性增加，最后使CAT活性下降，而細胞內(nèi)H2O2的水平保持穩(wěn)定或增加[26]。污染環(huán)境條件下，為減輕污染因子對機體傷害，生物體可調(diào)節(jié)抗氧化水平來清除機體中活性氧[27]，·OH在體內(nèi)具有極大危害性，SOD和CAT廣泛存在于生物體的各種組織中[27]、能及時清除體內(nèi)的·OH，它們在及時清除O2-·和H2O2的過程中占有重要地位，對阻斷·OH的生成具有重要意義。

在5 000 mg·L-1實驗組，肝臟及血液中CAT酶活力均高于對照組，表明在懸浮物脅迫下，褐牙鲆體內(nèi)H2O2及羥自由基(·OH)的濃度升高，對生物體正常的體內(nèi)環(huán)境造成了不利影響，為消除羥自由基(·OH)對生物體的損傷，褐牙鲆肝臟及血液中CAT酶活力被誘導(dǎo)，及時清除體內(nèi)過多的羥自由基(·OH)，這與國內(nèi)其他研究人員的結(jié)果基本一致[28-29]。10 000 mg·L-1肌肉和血液中CAT酶活力呈現(xiàn)先升高、再降低的趨勢，這與Stebbing提出的“毒物興奮效應(yīng)”表現(xiàn)類似[25]。短時間脅迫會誘導(dǎo)褐牙鲆幼魚體內(nèi)的CAT酶活力，產(chǎn)生較多的CAT酶，來減輕懸浮物脅迫因子對機體的傷害，清除體內(nèi)由于懸浮物脅迫產(chǎn)生的過多活性氧。當(dāng)脅迫時間超過一定的限度，有可能是褐牙鲆適應(yīng)了脅迫環(huán)境，也可能是過長時間脅迫超過了褐牙鲆的耐受限度，造成了褐牙鲆CAT酶活力的下降。

在5 000 mg·L-1實驗組的肌肉及肝臟中CAT基因表達量在24至72 h呈現(xiàn)先升高、再降低的趨勢，并且在24 h達到峰值(P<0.05)，這與Stebbing提出的“毒物興奮效應(yīng)”表現(xiàn)類似[25]。短時間脅迫會誘導(dǎo)褐牙鲆幼魚體內(nèi)的CAT基因相對表達量，產(chǎn)生較多的CAT酶，來減輕懸浮物脅迫因子對機體的傷害，清除體內(nèi)由于懸浮物脅迫產(chǎn)生的過多活性氧。當(dāng)脅迫時間超過一定的限度，有可能是褐牙鲆適應(yīng)了脅迫環(huán)境，也可能是過長時間脅迫超過了褐牙鲆的耐受限度，造成了褐牙鲆CAT基因相對表達量的下降。5 000 mg·L-1實驗組，肌肉中CAT酶活力與基因相對表達量變化趨勢一致，都是呈現(xiàn)先升高、再降低的趨勢。在懸浮物脅迫下，機體大量活性氧產(chǎn)生，致使CAT的基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達量迅速增加。但隨著適應(yīng)性地逐步增強，活性氧物質(zhì)伴隨代謝過程而產(chǎn)生，因此活性氧的量值下降，CAT酶參與氧代謝的量也逐步下降，使得表達量有所降低。CAT酶活性的升高，依賴基因轉(zhuǎn)錄與蛋白質(zhì)合成。

3.3 懸浮物對褐牙鲆抗氧化酶(GST)活力及相關(guān)基因的影響

谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)也是生物體內(nèi)解毒酶系統(tǒng)的重要組成部分之一。GST參與機體的解毒代謝和抗氧化等過程，在生物體對內(nèi)源性和外源性有毒物質(zhì)的降解過程中均起著重要作用，其主要功能是催化谷胱甘肽(GSH)的巰基與一些親電子類有毒物質(zhì)(如殺蟲劑、醌類化合物、α, β-不飽和羰基化合物及過氧化物等)進行軛合反應(yīng)，從而保護一些蛋白質(zhì)免受損傷，達到解毒目的[30-31]。

在本研究中，肝臟、鰓及血液中實驗組GST酶活力高于對照組(P<0.05)，24至72 h實驗組的肌肉中GST酶活力高于對照組(P<0.05)，表明在懸浮物的脅迫下，機體內(nèi)產(chǎn)生了有毒物質(zhì)(過氧化物)，為消除有毒物質(zhì)對生物體的損傷，4種組織中的GST酶活力被誘導(dǎo)，從而保護機體內(nèi)的一些蛋白質(zhì)不受損傷，這與蔣玫等[16]研究底泥浸出液對脊尾白蝦CAT影響的結(jié)果一致。血液中GST酶活力顯著高于其他3種組織，表明GST酶主要在血液中發(fā)揮消除有毒物質(zhì)的功能。24至48 h 4種組織GST基因相對表達量，實驗組高于對照組(P<0.05)，分別在24 h或者48 h達到峰值(P<0.05)，表明GST酶活力與基因相對表達水平在24至48 h變化趨勢一致，在72、96 h 4種組織GST酶活力與GST基因相對表達變化趨勢不一致，表明隨著懸浮物脅迫時間增長，不同組織中GST基因相對表達產(chǎn)生了差異，這與不同組織的功能有關(guān)。鰓中GST基因相對表達水平高于其他3種組織，表明鰓對懸浮物脅迫的反應(yīng)較為靈敏，懸浮物可影響水體生物的呼吸作用，而鰓作為呼吸的主要器官，反應(yīng)最為靈敏。

[1] 王波, 張朝暉, 左言明, 等. 牙鲆屬主要經(jīng)濟魚類的生物學(xué)及養(yǎng)殖研究概況[J]. 海洋水產(chǎn)研究, 2004, 25(5): 86-92

Wang B, Zhang Z H, Zuo Y M, et al. The research introduction to biology and farming technology of main species of Parlchthys [J]. Marine Fisheries Research, 2004, 25(5): 86-92 (in Chinese)

[2] 于煒. 渤海表層懸浮物分布變異規(guī)律的研究[D]. 北京: 中國科學(xué)院研究生院, 2011: 1-5

Yu W. Study on distribution variation of surface suspended solids in Bohai [D]. Beijing: Graduate University of Chinese Academy of Sciences, 2011: 1-5 (in Chinese)

[3] 趙奎寰譯. 海洋懸浮物的化學(xué)組成及物質(zhì)來源[J]. 海岸工程, 1999, 15(3): 58-63

[4] 劉碩, 周啟星. 抗氧化酶診斷環(huán)境污染研究進展[J]. 生態(tài)學(xué)雜志, 2008, 27(10): 1791-1798

Liu S, Zhou Q X. Research advances in antioxidant enzymes for diagnosing environmental contamination [J]. Chinese Journal of Ecology, 2008, 27(10): 1791-1798 (in Chinese)

[5] 王凡, 趙元鳳, 呂景才, 等. 銅對牙鲆CAT、SOD和GSH-PX活性的影響[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2007, 26(6): 836-838

Wang F, Zhao Y F, Lv J C, et al. Effect of Cu2+on CAT, SOD, GSH-PX of Paralichthys olivaceus [J]. Journal of Huazhong Agricultural University, 2007, 26(6): 836-838 (in Chinese)

[6] 王凡, 趙元鳳, 劉長發(fā). Cu2+對牙鲆肌肉抗氧化防御系統(tǒng)的影響[J]. 淡水漁業(yè), 2007, 37(2): 27-29

Wang F, Zhao Y F, Liu C F. Effect of Cu2+on the antioxidative defense in muscle of Paralichthys olivaceus [J]. Freshwater Fisheries, 2007, 37(2): 27-29 (in Chinese)

[7] Huang W, Cao L, Ye Z J, et al. Antioxidative responses and bioaccumulation in Japanese flounder larvae and juveniles under chronic mercury exposure [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology, 2010, 152: 99-106

[8] Cao L, Huang W, Liu J H, et al. Accumulation and oxidative stress biomarkers in Japanese flounder larvae and juveniles under chronic cadmium exposure [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology, 2010, 151: 386-392

[9] 王茂林, 張秀梅, 黃國強, 等. 不同鈣、鎂濃度對褐牙鲆幼魚生長及SOD和CAT酶活力的影響[J]. 漁業(yè)科學(xué)進展, 2010, 31(3): 29-36

Wang M L, Zhang X M, Huang G Q, et al. Effects of Ca2+and Mg2+concentrations on growth, SOD and CAT enzymatic activity of juvenile Paralichthys olivaceus [J]. Progress in Fishery Sciences, 2010, 31(3): 29-36 (in Chinese)

[10] 柳意樊. 褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)與雜交鲆(褐牙鲆P. olivaceus♀×大西洋牙鲆P. dentatus♂)幼魚高溫耐受性研究[D]. 北京: 中國科學(xué)院大學(xué), 2014: 66-81

Liu Y F. Study on the thermal tolerance of juvenile Paralichthys olivaceus and the hybrids P. olivaceus♀×P. dentatus [D]. Beijing: University of the Chinese Academy of Sciences, 2014: 66-81 (in Chinese)

[11] 黃偉. 汞、鉛、鋅對褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)早期發(fā)育過程毒理作用的研究[D]. 北京: 中國科學(xué)院研究生院, 2010: 45-57

Huang W. Toxic effects of mercury, lead and zinc on early life stages of flounder (Paralichthys olivaceus) [D]. Beijing: Graduate School of Chinese Academy of Sciences, 2010: 45-57 (in Chinese)

[12] Lou B, Xu D D, Xu H X, et al. Effect of high water temperature on growth, survival and antioxidant enzyme activities in the Japanese flounder Paralichthys olivaceus [J]. African Journal of Agricultural Research, 2011, 6(12): 2875-2882

[13] 徐冬冬, 樓寶, 詹煒, 等. 高溫脅迫對褐牙鲆生長及肝臟抗氧化酶活性的影響[J]. 水產(chǎn)學(xué)報, 2010, 34(7): 1100-1106

Xu D D, Lou B, Zhan W, et al. Effect of high temperature stress on growth performance and activities of antioxidant enzymes in liver of olive flounder Paralichthys olivaceus [J]. Journal of Fisheries of China, 2010, 34(7): 1100-1106 (in Chinese)

[14] 張雪, 宋倫, 楊國軍, 等. 懸浮物對菲律賓蛤仔超氧化物歧化酶活力的影響[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2013, 32(6): 328-332

Zhang X, Song L, Yang G J, et al. Effect of suspended solids on superoxide dismutase activity in Manila clam Ruditapes philippinarum [J]. Fisheries Science, 2013, 32(6): 328-332 (in Chinese)

[15] 楊國軍, 宋倫, 王年斌, 等. 懸浮物對四角蛤蜊生存和氧化酶活性的影響[J]. 生態(tài)學(xué)雜志, 2013, 32(8): 2097-2103

Yang G J, Song L, Wang N B, et al. Effects of suspended solid on the survival, growth, and antioxidant enzyme activities of Mactra veneriformis [J]. Chinese Journal of Ecology, 2013, 32(8): 2097-2103 (in Chinese)

[16] 蔣玫, 李磊, 沈新強, 等. 底泥浸出液對脊尾白蝦抗氧化解毒酶及相關(guān)基因表達的影響[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報, 2013, 22(7): 1182-1186

Jiang M, Li L, Shen X Q, et al. Effects of lixivium from ooze mud exposure on activity of antioxidant enzymes and related genes expression of Exopalaemon carinicauda mysis larvae [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2013, 22(7): 1182-1186 (in Chinese)

[17] 汪家政, 范明. 蛋白質(zhì)技術(shù)手冊[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2000: 42-47

[18] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method [J]. Methods, 2001, 25: 402-408

[19] 文春根, 代功園, 謝彥海, 等. 鉛對背角無齒蚌抗超氧陰離子能力與抑制羥自由基的影響以及可溶性蛋白分析[J]. 南昌大學(xué)學(xué)報: 理科版, 2009, 33(4): 380-384

Wen C G, Dai G Y, Xie Y H, et al. Pb2+effect on superoxide anion and scavenging hydroxyl free radical and analysis soluble protein from Anodonta woodioma [J]. Journal of Nanchang University: Natural Science, 2009, 33(4): 380-384 (in Chinese)

[20] Franco R, Sánchezolea R, Reyes-Reyes E M, et al. Environmental toxicity, oxidative stress and apoptosis: Ménage à Trois [J]. Mutation Research: Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 2009, 674(1-2): 3-22

[21] 曹亮. 銅、鎘對褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)早期發(fā)育階段的毒理效應(yīng)研究[D]. 北京: 中國科學(xué)院研究生院, 2010: 95-114

Cao L. Toxic effects of cadmium and copper to early life stages of flounder (Paralichthys olivaceus) [D]. Beijing: Graduate University of Chinese Academy of Sciences, 2010: 95-114 (in Chinese)

[22] 劉存歧, 劉麗靜, 張亞娟, 等. 基于鹵水的養(yǎng)殖用水中Ca2+/Mg2+對凡納濱對蝦生長及體內(nèi)SOD和AKP的影響[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2007, 26(2): 67-69

Liu C Q, Liu L J, Zhang Y J, et al. Effect of Ca2+/Mg2+in brine water from saltworks on growth and activities of APK and SOD in white legged shrimp [J]. Fisheries Science, 2007, 26(2): 67-69 (in Chinese)

[23] 魯雙慶, 劉少軍, 劉紅玉. Cu2+對黃鱔肝臟保護酶SOD、CAT、GSH-PX活性的影響[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2002, 9(2): 138-141

Lu S Q, Liu S J, Liu H Y. Effects of Cu2+on activities of protecting enzymes SOD, CAT and GSH-PX in liver tissue of Monopterus albus [J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2002, 9(2): 138-141 (in Chinese)

[24] 楊麗華, 方展強, 鄭文彪. 鎘對鯽魚鰓和肝臟超氧化物歧化酶活性的影響[J]. 安全與環(huán)境學(xué)報, 2003, 3(3): 13-16

Yang L H, Fang Z Q, Zheng W B. Experiment with effect of cadmium on activity of superoxide dismutase in gill and liver tissue of crucian [J]. Journal of Safety and Environment, 2003, 3(3): 13-16 (in Chinese)

[25] Stebbing A R D. Hormesis—The stimulation of growth by low levels of inhibitors [J]. Science of the Total Environment, 1982, 22(3): 213-234

[26] Mathews M, Sonenberg N, Hershey J. Translational Controls in Biology and Medicine [M]. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2007: 534-546

[27] 方允中, 李文杰. 自由基與酶基礎(chǔ)理論及其在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1989: 129-146

Fang Y Z, Li W J. Basic Theory of Free Radical and Enzyme and Its Application in Biology and Medicine [M]. Beijing: The Science Publishing Company, 1989: 129-146 (in Chinese)

[28] 馮濤, 鄭徽云, 洪萬樹, 等. 苯并(a)花對大彈涂魚肝臟抗氧化酶活性影響的初步研究[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報, 2001, 12(3): 442-448

Feng T, Zheng H Y, Hong W S, et al. Effect of benzo(a)pyrene on antioxidant enzyme activities in Boleophthalmus pectinirostris liver [J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2001, 12(3): 442-428 (in Chinese)

[29] 沈盎綠, 馬勝偉, 賈秋紅. 黑鯛受銅、鎘脅迫的生理反應(yīng)[J]. 海洋漁業(yè), 2007, 29(3): 23-29

Shen A L, Ma S W, Jia Q H. Research on the physiological responses of Sparus macrocephalus stressed by Cu2+and Cd2+[J]. Marine Fisheries, 2007, 29(3): 23-29 (in Chinese)

[30] Masella R, Di Benedetto R, Var I R, et al. Novel mechanisms of natural antioxidant compounds in biological systems:Involvement of glutathione and glutathione-related enzymes [J]. The Journal of Nutritional Biochemistry, 2005, 16(10): 577-586

[31] Shimada T. Xenobiotic-metabolizing enzymes involved inactivation and detoxification of carcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons [J]. Drug Metabolism and Pharmacokinetics, 2006, 21(4): 257-276

◆

Effects of Suspended Substances Stress on Antioxidant System Enzyme Activities and Gene Expression ofParalichthysolivaceus

Xiao Guangxia1,2, Xu Wenyuan3, Jia Lei1,*, Zheng Debin1, Han Xianqin1, Chen Chunxiu1

1. Bohai Fisheries Research Institute of Tianjin, Tianjin 300457, China 2. Luozhuang Water Authority of Linyi, Linyi 276000, China 3. Linyi Entry-Exit Inspecting and Quarantine Bureau, Linyi 276034, China

Japanese flounder, Paralichthys olivaceus is an important enhancement species in Bohai Bay of China. The high suspended substances (SS) concentration of the seawater caused a serious impact on the survival and proliferation of P. olivaceus organisms. It is well known that environmental stress can induce oxidative stress. However, there is little information about the effects of SS changes on antioxidant system of Japanese flounder. In this study, Japanese flounder (14.53 cm±1.58 cm) were exposed to SS with the concentration of 5 000 mg·L-1and 10 000 mg·L-1. The activities of total superoxide dismutase (T-SOD), catalase (CAT), glutathions S-transferase and the relative expressions of SOD2, CAT and GST gene in muscle, liver, gill and blood were analyzed in Japanese flounder after 0 h, 24 h, 48 h, 72 h and 96 h exposure. The results showed that all enzyme activity in four tissues have a rising trend (P<0.05) after 24 h or 48 h exposure to SS. The T-SOD activity in four tissues after 96 h exposure were higher than control group (P<0.05), while the SOD2gene relative expression of muscle, gill and blood in exposure group are lower than the control group (P<0.05) after exposure to SS for 96 h. The CAT activity in muscle showed a trend of increasing first, then decreasing, while the CAT gene relative expression showed a trend of decreasing first, then increasing, and decreasing again. The GST activity of liver, gill and blood showed a trend of increasing after exposure to SS, and the GST gene expression of four tissues showed a trend of increasing after exposure to SS from 12 to 24 h. It is suggested that the SS has a certain effect on antioxidant enzyme activities and gene expressions of P. olivaceus. The variations of enzyme activities of blood and the variations of gene relative expressions of gill are larger than other tissues, which is associated with the fact that the blood and gills is involved in the respiration process. The variations of antioxidant enzyme activities are not entirely consistent with the variations of the relative gene expressions.

suspended substances (SS); Paralichthys olivaceus; antioxidant system enzyme; gene expression

國家鲆鰈類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-50-z01)；天津市科技計劃項目(海珍品高效養(yǎng)殖技術(shù)集成與應(yīng)用15zxbfnc00100)；天津市水產(chǎn)局青年科技創(chuàng)新項目(懸浮物脅迫對褐牙鲆存活、抗氧化系統(tǒng)酶活力及基因表達的研究J2014-02)；天津市農(nóng)委農(nóng)業(yè)科技合作項目(海水新品種的引進及示范201304070)；天津市農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團隊建設(shè)項目(海水魚養(yǎng)殖崗位)

肖廣俠(1984-)，男，工程師，研究方向為水產(chǎn)動物遺傳育種及增殖放流評估，E-mail: gxxiao@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: tianjinbohaisuo@163.com

10.7524/AJE.1673-5897.20160420001

2016-04-20 錄用日期：2016-06-18

1673-5897(2016)6-266-11

X171.5

A

賈磊(1983—)，男，水產(chǎn)養(yǎng)殖碩士，高級工程師，主要從事苗種培育及生態(tài)養(yǎng)殖研究，發(fā)表學(xué)術(shù)論文20余篇。

肖廣俠, 徐文遠, 賈磊, 等. 懸浮物對褐牙鲆抗氧化酶活性及相關(guān)基因表達的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2016, 11(6): 266-276

Xiao G X, Xu W Y, Jia L, et al. Effects of suspended substances stress on antioxidant system enzyme activities and gene expression of Paralichthys olivaceus [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(6): 266-276 (in Chinese)