張?jiān)邬i，馮建軍

(集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門(mén) 361021)

Caspase細(xì)胞凋亡通路在魚(yú)類中的研究進(jìn)展

張?jiān)邬i，馮建軍*

(集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門(mén) 361021)

摘要介紹了Caspase概念與分類及其在哺乳動(dòng)物中的研究情況，綜述了魚(yú)類Caspases基因的組織表達(dá)、在胚胎發(fā)育中的表達(dá)、在應(yīng)激狀態(tài)下的表達(dá)變化及魚(yú)類Caspases分子的蛋白功能研究進(jìn)展，并展望了魚(yú)類Caspases今后的研究方向。

關(guān)鍵詞細(xì)胞凋亡；半胱氨酸蛋白酶；硬骨魚(yú)類

細(xì)胞凋亡是程序性的細(xì)胞死亡過(guò)程，具有獨(dú)特的形態(tài)學(xué)和生化特征，并受多種因素調(diào)節(jié)。Caspase屬于細(xì)胞內(nèi)大量分布的半胱氨酸蛋白酶家族，能夠?qū)⒓?xì)胞外信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)最終引起細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞免疫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。目前，哺乳動(dòng)物Caspases在細(xì)胞凋亡中的結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)和功能方面的研究已相當(dāng)深入，但有關(guān)魚(yú)類Caspases基因家族的研究尚薄弱。近年來(lái)，魚(yú)類細(xì)胞凋亡的研究越來(lái)越受到關(guān)注，Caspases基因家族在部分硬骨魚(yú)類上已有一些報(bào)道。鑒于此，筆者參考國(guó)內(nèi)外的最新報(bào)道，綜述了魚(yú)類Caspases基因家族的研究進(jìn)展，以期為Caspase的進(jìn)一步研究提供參考。

1Caspase介紹

細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞生物調(diào)節(jié)自身生長(zhǎng)、發(fā)育和免疫反應(yīng)的基本生物學(xué)進(jìn)程。Caspase屬于半胱氨酸蛋白酶家族，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Caspase可分為炎癥相關(guān)Caspases(1、4、5、13)和細(xì)胞凋亡相關(guān)Caspases(2、3、6、10)。根據(jù)其在凋亡信號(hào)通路中的作用，細(xì)胞凋亡相關(guān)Caspases又可分為起始Caspases(2、8、9、10)和效應(yīng)Caspases(3、6、7)[1-2]。細(xì)胞凋亡相關(guān)的Caspases在魚(yú)類各組織中廣泛表達(dá)，其中在免疫相關(guān)的組織中表達(dá)量相對(duì)較高。魚(yú)類的胚胎發(fā)育過(guò)程涉及眾多細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，而Caspases在其機(jī)體組織分化、器官發(fā)育以及自穩(wěn)態(tài)維持等方面起關(guān)鍵作用。

2哺乳動(dòng)物Caspases的研究

通常，哺乳動(dòng)物Caspases在細(xì)胞中以無(wú)活性的酶原形式存在。一般來(lái)說(shuō)，Caspases基因家族都具有相同的結(jié)構(gòu)域：N-端前結(jié)構(gòu)域、大亞基(P20域)和小亞基(P10域)[3]。起始Caspase具有1個(gè)較大的N-端前結(jié)構(gòu)域包括：蛋白接頭功能域、Caspase募集域(CARD)或者能夠募集轉(zhuǎn)接蛋白以激活下游效應(yīng)Caspases的死亡效應(yīng)域(DEDs)。而效應(yīng)Caspases通常只有很短的N-端前結(jié)構(gòu)域，無(wú)明顯的蛋白接頭[4-6]。根據(jù)凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)方式將哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凋亡分為內(nèi)在和外在凋亡路徑[7-8]。外在凋亡通路是由細(xì)胞膜表面的死亡受體蛋白調(diào)節(jié)的，而內(nèi)在凋亡通路則是由內(nèi)源信號(hào)觸發(fā)的[9]。外在凋亡通路中，當(dāng)細(xì)胞外凋亡信號(hào)與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合后，信號(hào)被傳遞到細(xì)胞內(nèi)的起始Caspase-8、10，之后信號(hào)傳導(dǎo)至效應(yīng)階段的Caspase-3、6、7。而內(nèi)在凋亡通路則是由線粒體引起的，首先線粒體中的凋亡信號(hào)傳導(dǎo)至起始Caspase-9，隨后傳導(dǎo)至Caspase-3、6、7，最后進(jìn)入凋亡執(zhí)行階段。人類Caspase-9是內(nèi)在凋亡路徑上關(guān)鍵的起始Caspase，其在信號(hào)傳遞時(shí)形成一個(gè)凋亡復(fù)合體，負(fù)責(zé)傳遞由線粒體發(fā)出的內(nèi)在凋亡信號(hào)[8，10]。隨即凋亡復(fù)合體分裂為一大一小2個(gè)亞基，該2個(gè)亞基通過(guò)“自吸”的方式形成二聚體，Caspase-9被激活，進(jìn)而活化下游的Caspase-3和Caspase-7，使凋亡信號(hào)傳遞到執(zhí)行階段[11-12]。研究表明，外在和內(nèi)在的凋亡路徑都會(huì)導(dǎo)致Caspase-3激活，在細(xì)胞凋亡通路上執(zhí)行階段起關(guān)鍵作用[13]。

3魚(yú)類Caspases基因的組織表達(dá)

目前，主要從mRNA水平研究魚(yú)類Caspases基因在各組織中的表達(dá)情況。魚(yú)類Caspases一般在血細(xì)胞、鰓、肝臟以及脾臟中表達(dá)量較高，在其他組織也有組成性表達(dá)，提示Caspases凋亡通路在魚(yú)類中的生物學(xué)功能具有多樣性[14-15]。魚(yú)類在水環(huán)境中生長(zhǎng)，鰓直接與外界環(huán)境接觸，是病原菌入侵的首要部位，肝臟和脾臟是魚(yú)類主要的免疫器官，而血淋巴則是天然免疫反應(yīng)中的重要介質(zhì)，Caspases基因在這些免疫相關(guān)組織中高豐度表達(dá)表明Caspase信號(hào)通路與魚(yú)類免疫應(yīng)答反應(yīng)密切相關(guān)[16-18]。

4魚(yú)類Caspases基因在胚胎發(fā)育中的表達(dá)研究

多細(xì)胞生物中，細(xì)胞凋亡在其組織分化、器官發(fā)育和機(jī)體穩(wěn)態(tài)維持中有著重要意義。機(jī)體在產(chǎn)生新生細(xì)胞的同時(shí)，通過(guò)凋亡機(jī)制有針對(duì)性地清除衰老和突變的細(xì)胞，從而使機(jī)體各組織和器官正常發(fā)育和代謝。斑馬魚(yú)作為模式動(dòng)物，其胚胎發(fā)育過(guò)程是研究魚(yú)類細(xì)胞凋亡機(jī)制的理想模式[19]。Yamashita等[20]發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中，pro-Caspase-3基因的過(guò)表達(dá)可引起斑馬魚(yú)胚胎眼、脊索和心臟系統(tǒng)的不正常發(fā)育，表明pro-Caspase-3在早期胚胎發(fā)育的多進(jìn)程調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。Yabu等[21]研究了脅迫狀態(tài)下斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育情況，結(jié)果顯示在熱休克39 ℃和紫外照射條件下，斑馬魚(yú)胚胎發(fā)生大規(guī)模的細(xì)胞凋亡，Caspase-3的活性數(shù)倍增加，并具有劑量依賴性，表明caspase-3-like在脅迫條件下的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。

5魚(yú)類Caspases基因在應(yīng)激狀態(tài)下的表達(dá)變化

細(xì)胞凋亡與免疫調(diào)節(jié)有著密切聯(lián)系。當(dāng)細(xì)胞受到外界如輻射、缺氧、高溫、病原感染等刺激后，產(chǎn)生的信號(hào)通過(guò)細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體傳入細(xì)胞，引起細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化或是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)的基因表達(dá)，通過(guò)一系列生化反應(yīng)最終引起細(xì)胞凋亡。

水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)長(zhǎng)期受到病害的困擾，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，關(guān)于水產(chǎn)動(dòng)物病害防御免疫機(jī)制的研究受到廣泛關(guān)注。目前，有關(guān)魚(yú)類Caspases基因參與免疫反應(yīng)的相關(guān)研究已有報(bào)道。Laing等[22]從虹鱒(Oncorhynchusmykiss)中克隆了Caspase-6基因，發(fā)現(xiàn)Caspase-6在不同組織均有表達(dá)。雖然單獨(dú)使用LPS或皮質(zhì)醇刺激白細(xì)胞后未能引起Caspase-6表達(dá)量變化，但先用皮質(zhì)醇處理后再進(jìn)行LPS刺激，則發(fā)現(xiàn)Caspase-6基因表達(dá)水平顯著升高，推測(cè)Caspase-6可能參與了虹鱒的免疫反應(yīng)。Reis等[23-24]檢測(cè)到Caspase-3和Caspase-8基因在天然舌齒鱸(Dicentrarchuslabrax)體內(nèi)表達(dá)水平較低，當(dāng)發(fā)光桿菌感染后Caspase-3、8的表達(dá)量均有不同程度的升高。大黃魚(yú)(Pseudosciaenacrocea)經(jīng)poly I：C及細(xì)菌刺激后，頭、腎、脾臟中Caspase-3以及脾臟和腎臟Caspase-9基因的表達(dá)量均有顯著升高，表明poly I：C和細(xì)菌可能激活了大黃魚(yú)的內(nèi)在細(xì)胞凋亡途徑[25-26]。金頭鯛(Sparusaurata)經(jīng)鰻弧菌感染后，Caspase-1基因在相關(guān)免疫組織中表達(dá)水平持續(xù)上升[27]。

近年來(lái)，有關(guān)溫度脅迫對(duì)Caspases基因表達(dá)影響的研究也有報(bào)道。Takle等[28]用20 ℃高溫處理虹鱒胚胎后，Caspase-7表達(dá)量在54 h后達(dá)到峰值，而Caspase-6表達(dá)僅能在熱處理后的胚胎心臟中檢測(cè)到。章瓊等[29]在對(duì)團(tuán)頭魴(Megahbramaamblycephala)進(jìn)行氨氮脅迫研究時(shí)發(fā)現(xiàn)Caspase-9基因在肝臟和腦中的表達(dá)量均出現(xiàn)上調(diào)，表明該基因可能參與了團(tuán)頭魴的免疫防御機(jī)制，而且與細(xì)胞凋亡分子過(guò)程有關(guān)。大黃魚(yú)中的相關(guān)研究結(jié)果顯示Caspase-1基因在10和15 ℃脅迫后，肝臟和心臟中的相對(duì)表達(dá)量顯著上升，而經(jīng)過(guò)25和30 ℃脅迫后Caspase-1的表達(dá)量降低，其在心臟中的降低尤為顯著。大黃魚(yú)肝臟中Caspase-7表達(dá)量在低溫時(shí)升高，而腎臟中Caspase-7表達(dá)量在低溫和高溫條件下均顯著降低[30]。

6魚(yú)類Caspases分子的蛋白功能研究

哺乳動(dòng)物Caspases不但與細(xì)胞的凋亡關(guān)系密切，而且還參與了細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化等方面的調(diào)節(jié)。哺乳動(dòng)物中Caspases的功能研究已經(jīng)相當(dāng)透徹，但魚(yú)類中其研究尚處于探索階段。Mu等[25]通過(guò)構(gòu)建重組表達(dá)載體獲得了大黃魚(yú)Caspase-9的融合蛋白，并對(duì)蛋白中活性位點(diǎn)突變對(duì)蛋白活性的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示Caspase-9蛋白的水解活性是actin蛋白的56.21倍，而His249突變?yōu)樘於彼峄蛘逤ys299突變?yōu)楦拾彼岷髢烧叩乃饣钚苑謩e只有actin的4.88和3.08倍。Leu228突變后的水解活性是actin的53.63倍，并未引起水解活性的改變，表明組氨酸和半胱氨酸活性位點(diǎn)對(duì)維持大黃魚(yú)caspase-9的活性都是必需的，而半胱氨酸活性位點(diǎn)比組氨酸活性位點(diǎn)更重要。Elvitigala等[31]獲得的大黃魚(yú)Caspase-3重組融合蛋白能夠水解哺乳動(dòng)物Caspase-3/7/8/9特定的底物，與水解Caspase-8/9底物時(shí)表現(xiàn)出的活性相比，其水解Caspase-3/7底物時(shí)表現(xiàn)出明顯的特異性，證實(shí)了大黃魚(yú)Caspase-3具有類似于哺乳動(dòng)物Caspase-3基因的功能。Banerjee等[32]研究了嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)引起蟾胡鲇(Clariasbatrachus)頭腎巨噬細(xì)胞的凋亡過(guò)程，其免疫印跡法結(jié)果顯示Caspase-3參與并介導(dǎo)了頭腎巨噬細(xì)胞的凋亡進(jìn)程。

7結(jié)論

目前，關(guān)于魚(yú)類Caspases的研究尚處于初始階段，雖然有關(guān)Caspases基因家族的分子克隆與表達(dá)分析的研究已有較多報(bào)道，但關(guān)于魚(yú)類細(xì)胞凋亡過(guò)程中Caspases各分子之間的相互作用、信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的研究報(bào)道較少。因此，通過(guò)借鑒哺乳動(dòng)物Caspases基因功能的研究成果與技術(shù)方法，對(duì)魚(yú)類Caspases通路分子的蛋白功能及其信號(hào)通路傳導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行深入研究將成為今后研究的重點(diǎn)。

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Research Progress on Caspase Apoptosis Pathway in Fish

ZHANG Zai-peng, FENG Jian-jun*

(Fisheries College，Jimei University，Key Laboratory of Healthy Mariculture for the East China Sea，Ministry of Agriculture, Xiamen, Fujian 361021)

AbstractWe introduced the research status of Caspase concept and classification and its application in mammals. Research progress of tissue expression of fish Caspases gene was reviewed, as well as its expression in embryonic development, expression under stress state, and protein function of fish Caspases molecular. The research direction of fish Caspases in future was forecasted.

Key wordsApoptosis; Caspase; Teleost

基金項(xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272685)；福建省海洋與漁業(yè)廳項(xiàng)目(201212140006)；福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2016J01164)；集美大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金項(xiàng)目(2010A001)；集美大學(xué)科研基金項(xiàng)目(C60819)。

作者簡(jiǎn)介張?jiān)邬i(1987- )，男，山東濰坊人，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物免疫學(xué)。*通訊作者，副教授，從事水產(chǎn)動(dòng)物免疫學(xué)研究。

收稿日期2016-03-31

中圖分類號(hào)Q 255

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)11-004-02