楊　強，唐　潔，楊生智，夏金陽，王　喆，劉源才(勁牌有限公司，湖北大冶435100)

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清香型小曲白酒產酯酵母的篩選及應用

楊強，唐潔，楊生智，夏金陽，王喆，劉源才
(勁牌有限公司，湖北大冶435100)

摘要：從酒曲中分離的多株酵母，通過液態(tài)發(fā)酵初篩、小試固態(tài)發(fā)酵復篩獲得高產乙酸乙酯酵母。將產酯酵母應用于生產中，研究其對清香型小曲白酒發(fā)酵的影響。采用高粱汁液態(tài)發(fā)酵，結合風味物質初篩出7株產乙酸乙酯性能較好的酵母菌株。在實驗室模擬小曲白酒生產工藝搭建小試固態(tài)發(fā)酵平臺，通過對7株酵母小試固態(tài)發(fā)酵復篩，測定發(fā)酵結束后蒸餾液中乙酸乙酯含量，獲得4株高產乙酸乙酯產酯酵母，均比對照組提高了近4倍以上。并將復篩獲得的3株酵母擴大培養(yǎng)制備成酵母麩皮種，按比例添加至公司酒曲中，應用于中試車間生產，與對照酒曲（不添加產酯酵母）相比，出酒率均未受添加產酯酵母影響而下降。其中，添加Y29和Y42 2株酵母產酒中乙酸乙酯含量分別為2.004 g/L、1.523 g/L，比對照組提高了99.4 %和51.5 %，正丙醇含量分別下降44.2 %和42.7 %，而Y29高級醇含量提高了16.5 %，其他色譜指標無明顯差別。

關鍵詞：產酯酵母；乙酸乙酯；清香型小曲白酒；酒質酒率；釀酒生產

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2015-11-04；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20151104.1110.010.html。

酯類作為呈香物質，在白酒的香氣形成中具有極其重要的作用,是區(qū)別于其他蒸餾酒的主要特征之一。乙酸乙酯是小曲白酒中重要的風味化合物，是清香型小曲白酒的特征香味成分之一。乙酸乙酯在酯類物質中處于主導地位，其含量高低很大程度決定著清香型白酒的質量及風格。在小曲原酒中，乙酸乙酯含量高的酒香味好，提高乙酸乙酯含量有利于提高原酒質量。與大曲酒相比，清香型小曲原酒中的酯含量較低，具有較大的提升空間。通過進一步提高小曲原酒中乙酸乙酯含量，有利于提高小曲白酒質量，從而提升產品競爭力。同時，可以解決困擾小曲白酒行業(yè)所產原酒中酯含量低的難題，促進行業(yè)的發(fā)展，對小曲白酒傳統(tǒng)技術的改造和提升都有著積極的現(xiàn)實意義。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1酵母菌株

從實驗室收集酒曲、酒醅中分離得到。

1.1.2培養(yǎng)基

WL培養(yǎng)基：酵母浸粉0.4 %，蛋白胨0.5 %，葡萄糖5 %，磷酸二氫鉀0.055 %，氯化鉀0.0425 %，氯化鈣0.0125 %，氯化鐵0.00025 %，硫酸鎂0.0125 %，硫酸錳0.00025 %，溴甲酚綠0.0022 %，瓊脂2 %，pH6.5，121℃滅菌20 min。

YPD培養(yǎng)基：2 %葡萄糖，2 %蛋白胨，1 %酵母膏，2 %瓊脂，121℃滅菌20 min。

液體YEPD培養(yǎng)基：葡萄糖2 %，酵母膏1 %，蛋白胨2 %。

高粱汁培養(yǎng)基：高粱∶水=1∶4，然后水浴糖化，過濾，稀釋到10°Bx。

1.2實驗方法

1.2.1酵母菌株的分離純化

稱取10 g酒醅于90 mL無菌生理鹽水的三角瓶中（裝有玻璃珠），200 r/min振蕩浸提30 min，吸取上清液，稀釋到合適濃度，一般稀釋3個濃度梯度，取200 μL涂布，所有平板作3次重復。30℃培養(yǎng)5 d后，利用酵母在WL培養(yǎng)基的不同形態(tài)特征進行初步分類。待長出菌落后，選擇具有典型酵母菌菌落特征的單菌落進一步劃線分離2～3次，經鏡檢為純種后分別轉入YPD固體斜面，低溫保存。

1.2.2液態(tài)發(fā)酵初篩

將分離純化后的酵母以相同的接種量(酵母數(shù)量為1×107cfu/mL)分別接入裝有50 mL的高粱汁培養(yǎng)液中，然后裝發(fā)酵栓并稱重，置于30℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，每隔24 h振蕩并稱重，記錄失重量，當失重量小于0.2 g時，停止培養(yǎng)。發(fā)酵結束后，測發(fā)酵液理化指標及風味物質含量。

1.2.3小試固態(tài)發(fā)酵復篩

實驗室模擬小曲白酒生產工藝搭建小試固態(tài)發(fā)酵平臺，具體工藝流程：泡糧、初蒸、燜糧、復蒸、撒曲、糖化、發(fā)酵，其中蒸糧結束后要求糧食開口好，完全透心，一致性好，水分在55 %左右。發(fā)酵7 d結束后，固態(tài)蒸餾，餾液經GC測乙酸乙酯含量。

1.2.4生產應用

酵母通過試管種、搖瓶培養(yǎng)、發(fā)酵罐培養(yǎng)至種曲機擴大培養(yǎng)制備成酵母麩皮種，再按比例添至酒曲中作為酒曲應用于中試車間進行發(fā)酵，出酒后經GC測揮發(fā)性風味物質，并進行感官品評。

2結果與討論

2.1液態(tài)初篩結果

根據(jù)酵母的作用，大致可將酵母分成兩大類。一類是釀酒酵母，主要完成酒精發(fā)酵，具有較高的發(fā)酵速率和完全的發(fā)酵能力。另一類是非釀酒酵母，雖然其發(fā)酵效率較低，但能夠合成多種酶，將原料中的前體物質轉換成風味物質如酯、酸、高級醇和醛等產物，影響酒的感官品質。通過考察不同酵母菌對糖的利用率及CO2失重情況可判斷該菌株發(fā)酵性能的優(yōu)劣，考察酵母菌株產乙酸乙酯含量鑒別菌株是否為產酯酵母。

表1各種屬酵母發(fā)酵能力比較

從表1可看出，Y32、Y33 2株酵母產氣較強，且殘?zhí)且草^低，代謝產乙酸乙酯含量低，說明該2株酵母對糖利用率較高、發(fā)酵性能好，并不是產酯酵母；Y42產乙酸乙酯能力最強，發(fā)酵液中乙酸乙酯含量為1.04 g/L，其次是Y46，乙酸乙酯含量為0.89 g/L。此外，Y6、Y4、Y29、Y10 和Y9產酯性能也較好?？膳卸ù?株酵母為產酯酵母，且除Y46外，其余6株酵母也具有一定的發(fā)酵能力。

2.2小試固態(tài)發(fā)酵復篩

將液態(tài)發(fā)酵初篩產酯性能較好的7株酵母制備成麩皮二級種，再按比例配成酒曲，對照曲為不添加產酯酵母的酒曲。經過泡糧、蒸糧、燜糧、糖化、發(fā)酵、蒸餾，發(fā)酵結束后蒸酒，酒樣色譜結果中乙酸乙酯含量見表2。乙酸乙酯含量取平均值見圖1。

根據(jù)色譜結果分析，與對照相比，Y4、Y6和Y93株酵母在小試固態(tài)發(fā)酵產酒中乙酸乙酯含量與對照組相當，提高不明顯。Y42產乙酸乙酯含量最高，平均為271.01g/100g醅，其次為Y46，乙酸乙酯含量為255.13 g/100 g醅，這與液態(tài)發(fā)酵該2株酵母產酯一致。此外，Y10、Y29 2株酵母代謝產乙酸乙酯能力也較好，4株酵母產酯性能均比對照組提高了近4倍以上。

表2酵母菌的產酯情況　(g/100 g醅)

圖1酵母菌的產酯情況

2.3中試車間應用

小試發(fā)酵確定的4株酵母用種曲機擴大培養(yǎng)制備成酵母麩皮種后，按比例添加至酒曲中應用于中試車間進行發(fā)酵，并以公司生產所用酒曲為對照。每天投糧量180 kg，每株菌連續(xù)投料3批，發(fā)酵16 d，與當月酒曲產酒進行色譜指標平均值及酒率（折55 %vol）做比較，得出數(shù)據(jù)見表3。

表3不同酵母應用于中試車間產酒主要風味物質　(g/L)

從表3、圖2可知，酒曲中添加產酯酵母Y10，出酒率下降了1.95 %，而添加Y29和Y42，對出酒率無影響；添加產酯酵母，產酒中乙酸乙酯含量均有不同程度的提高，以添加Y29的乙酸乙酯含量最高，為2.004 g/L，比對照組提高了99.4 %；添加Y42酒曲產酒中乙酸乙酯濃度為1.523 g/L，比對照組提高了51.5 %，而添加Y10的酒曲出酒乙酸乙酯比對照組提高了24.3 %。另外，添加產酯酵母后正丙醇含量均比對照組減少，Y10、Y29和Y42分別下降了52.8 %、44.2 %和42.7 %，這對降低原酒中缺陷性成分——正丙醇有所貢獻；添加產酯酵母后，雜醇油稍微有所提高，其中添加Y29的高級醇含量提高了16.5 %。將原酒進行感官品評，添加產酯酵母的酒曲產出的原酒清香純正、入口醇甜、較干凈，比對照曲酒體風味更優(yōu)。因此，在酒曲中添加產酯酵母，對于提高小曲白酒的乙酸乙酯含量有一定的作用，在不影響出酒率情況下，進一步提升了原酒質量。

圖2不同酵母應用于中試車間酒質酒率情況

3　結論

通過液態(tài)發(fā)酵初篩、小試固態(tài)發(fā)酵復篩從酒曲中獲得4株高產乙酸乙酯酵母菌株，并將其中3株應用于中試車間，出酒后，乙酸乙酯含量均比不添加產酯酵母的酒曲有所提升，其中編號Y29乙酸乙酯含量提高了99.4 %，且添加產酯酵母后正丙醇含量均比對照組減少。出酒率方面，除添加編號Y10酵母略有下降外，其余2株無影響。后期可以調整產酯酵母的添加比例來消除對出酒率的影響。感官品評，添加產酯酵母后，比對照組酒體風味更優(yōu)。因此，將產酯酵母制備麩皮種添加至酒曲中應用于小曲白酒生產，可以有效地改善小曲白酒中酯含量低的缺點，進一步提升了小曲白酒酒質。

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Screening and Application of Ester-producing Yeast Strains in the Production of Qingxiang Xiaoqu Baijiu

YANG Qiang, TANG Jie, YANG Shengzhi, XIAJinyang, WANG Zhe and LIU Yuancai
(Jingpai Co.Ltd., Daye, Hubei 435100, China)

Abstract:In this study, among the multiple yeast strains isolated from liquor starter, 7 yeast strains with good performance of ethyl acetate yield were obtained through primary screening by liquid fermentation (liquid fermentation of sorghum juice) combined with flavoring compounds evaluation, then after secondary screening by small-scale solid fermentation, 4 yeast strains with highyield of ethyl acetate were finally obtained, and the yield of ethyl acetate by those 4 yeast strains increased by almost 4 times than the contrast groups. Then 3 yeast strains were used for expanding culture and prepared as yeast bran species, and they were added in liquor starter for medium-scale production test according to certain addition ratio. Compared with contrast liquor starter, liquor yield did not decrease, and ethyl acetate content in the produced liquor increased by 99 % to 2.004 g/L for Y29 and by 51.5 % to 1.523 g/L for Y42 respectively, N-propanol content decreased by 44.2 % and 42.7 % respectively, while higher alcohol content increased by 16.5 % for Y29, and there was no significant difference in other chromatographic data.

Key words：ester-producing yeast strains; ethyl acetate; Qingxiang Xiaoqu Baijiu; liquor yield and liquor quality; liquor-making

通訊作者：劉源才，男，博士，勁牌有限公司技術總監(jiān)，主要從事保健酒研發(fā)和天然提取物方面的研究。

作者簡介：楊強，男，湖北浠水人，碩士，總工程師，中酒協(xié)、中食協(xié)白酒國家評委。

收稿日期：2015-09-22

DOI：10.13746/j.njkj.2015385

中圖分類號：TS261.1；TS262.3；TS261.4

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）01-0078-03