羅　岸,詹　領

(1.長江大學 生命科學學院,湖北 荊州　434023;2.武漢大學 生命科學學院,湖北 武漢　430072)

?

煙草脫水素基因NtDEH1的克隆及研究

羅岸1,詹領2

(1.長江大學 生命科學學院,湖北 荊州434023;2.武漢大學 生命科學學院,湖北 武漢430072)

摘要：為研究脫水素在植物早期胚胎發(fā)育中的作用和機理，采用顯微操作技術獲得煙草卵細胞并構建其cDNA文庫，從中篩選到一個脫水素基因NtDEH1。通過RACE技術獲得該基因全長，基因組測序結合生物信息學分析表明該基因擁有一段長度為651 bp的完整開放閱讀框和一段535 bp的內(nèi)含子，編碼由217個氨基酸殘基組成的蛋白質，其理論等電點為5.27，屬于酸性蛋白，且具有一定的親水性。氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)在許多物種比如絨毛狀煙草、林煙草、甜辣椒、番茄、馬鈴薯和丹參中都具有與NtDEH1蛋白非常類似的保守的同源序列，均具有SK2型脫水素特征。借助Genome walking技術獲取NtDEH1基因約1 706 bp的5′側翼序列，使用小葉煙草瞬時表達系統(tǒng)檢測到其具有較強的啟動子活性。該研究為進一步了解脫水素基因NtDEH1在植物生殖發(fā)育中的具體功能打下基礎。

關鍵詞：煙草;脫水素;基因克隆;NtDEH1;啟動子;卵細胞

在高等植物的整個生命周期里可能會遇到多種多樣的非生物脅迫,其中細胞缺水是較為常見的一種。因此，植物細胞為了抵抗干旱、低溫和高鹽脅迫引起的缺水狀況,會應激產(chǎn)生一系列親水性蛋白來維持其自身的正常生理代謝活動[1]。由于最初發(fā)現(xiàn)的這類蛋白在棉花胚胎發(fā)育的晚期表達,所以被稱之為LEA蛋白(Late embryogenesis abundant)。此后在許多植物中也都陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了LEA蛋白的同源蛋白[2]。這類蛋白均包含一段富含甘氨酸的序列和無序的蛋白質二級結構,同時都具有高度的親水性,所以研究者按照這類蛋白的序列特征將所有的LEA蛋白分為3種類型[3],分別為LEA group1型、LEA group2型和LEA group3型。

其中LEA group2蛋白又被稱為脫水素[4],通常在處于脫水狀態(tài)的種子中大量表達,另外在干旱、低溫和高鹽脅迫下的營養(yǎng)器官中也會大量表達。因此,脫水素高量且廣泛的表達是植物應對干旱脅迫的有效手段[5-7]。當然在植物的正常生長過程中,營養(yǎng)組織中也可以檢測到脫水素的表達。這些結果暗示脫水素可能對植物的生長發(fā)育和抗逆性均具有重要意義[8-9]。脫水素存在于多種生物種類中,從高等植物到較為低等的單細胞生物[9-11]。這些脫水素蛋白根據(jù)其所包含的保守片段的特點可以為五類:YnSKn型、YnKn型、SKn型、Kn型和KnS型。這5種類型的脫水素在植物正常生長和抗逆過程中承擔著不同的功能。Koag 等[12]發(fā)現(xiàn)YSKn型脫水素傾向于與含有酸性磷脂的脂質小泡相互結合。Hara等[13-14]發(fā)現(xiàn)KnS 型脫水素傾向于與金屬離子相互結合,以消滅胞內(nèi)游離的羥基并參與維持與低溫應激相關的酶類的活性。而Arora和Lopez[15-16]發(fā)現(xiàn)SKn 型和Kn型脫水素主要參與抗寒與抗旱。

本研究首次在煙草的卵細胞cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)了一種SK2型脫水素基因,其在卵細胞中有大量轉錄本存在,該基因被命名為NtDEH1。本研究利用RACE技術獲得NtDEH1基因的cDNA 全長序列,并通過染色體步移技術獲得了該基因的5′ 側翼序列(啟動子和5′UTR)。小葉煙草瞬時轉化證實新獲得的NtDEH1基因的5′ 側翼序列具有較強的啟動子活性。這些研究為進一步探究煙草NtDEH1基因在卵細胞的發(fā)生、形成和受精前后的角色及功能打下了堅實基礎。

1材料和方法

1.1試驗材料

1.1.1菌株與質粒在pCAMBIA 1302載體上接入3×eGFP綠色熒光蛋白和NLS核定位信號序列將其改造為啟動子活性檢測載體。大腸桿菌感受態(tài)購自北京全式金公司。

1.1.2植物材料本試驗使用的植物材料為紅花煙草(Nicotianatabacumvar.SR1),24 ℃恒溫種植,16 h/8 h光照周期。

1.1.3主要試劑基因克隆相關試劑采購自北京全式金公司。少量細胞RNA提取試劑使用購自Life technologies公司的Dynalbeads mRNA DIRECT Micro kit 試劑盒。cDNA擴增試劑使用購自Life technologies公司的SMARTer? Pico PCR cDNA Synthesis Kit試劑盒。

1.2試驗方法

1.2.1煙草卵細胞的分離與cDNA pool的構建酶解未受精的胚珠3 h后,用微針剝離出50個煙草卵細胞[ 17]。少量細胞的RNA提取依賴于Dynalbeads mRNA DIRECT Micro kit 試劑盒。反轉錄得到的cDNA使用SMARTer? Pico PCR cDNA Synthesis Kit試劑盒擴增得到卵細胞cDNA pool。

1.2.2NtDEH1基因cDNA序列的克隆和5′側翼序列的獲得武漢大學孫蒙祥課題組已使用未受精的胚珠構建了RACE文庫。用已經(jīng)獲得的卵細胞cDNA文庫中存在的NtDEH1基因的EST序列進行5′和3′端RACE擴增。之后使用煙草Genome walking文庫獲得該基因的5′側翼序列。按照RACE和Walking genome試劑盒說明書的要求設計所需要的特異性引物,并按照說明書所要求的反應體系和反應條件進行試驗,引物見表1。

表1　RACE、Genome walking和CDS檢測引物

1.2.3NtDEH1-eGFP核定位表達載體的構建依照獲得的5′側翼序列設計擴增NtDEH1基因的5′側翼區(qū)的引物,并設計引物5′端的雙酶切位點,引物PRO-F:5′-nnnnGAATTCAGTGCCAGAACGATTACCC CG-3′;PRO-R:5′-nnnnTCTAGACTTGTTGCTAAGAA CAAAGCAAAG-3′。使用PRO-F/PRO-R在煙草基因組中擴增NtDEH1基因的5′側翼序列(啟動子和5′UTR)。雙酶切獲得的目的條帶,然后連入啟動子活性檢測載體。

1.2.4NtDEH1基因5′側翼序列活性的檢測使用注射小葉煙草法將連接有NtDEH1基因5′側翼序列的啟動子活性檢測載體導入小葉煙草葉片下表皮。溫室中放置40~48 h后將被轉化葉片背面的葉表皮撕下,在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的表達情況。

1.2.5生物信息學分析使用Omiga軟件進行核酸序列分析。使用Protparam在線網(wǎng)站進行NtDEH1蛋白的基本理化特性分析。使用Photoshop軟件和CorelDRAW軟件進行圖像處理。使用Mega和ClustalX軟件進行氨基酸序列的進化分析。

2結果與分析

2.1煙草卵細胞的分離

被子植物大孢子的發(fā)育過程深埋于子房組織中,通常難以直接進行觀察研究。不過植物雌配子的形態(tài)相對較大,一般使用切割或酶解等方式破碎胚珠,通過顯微操作分離得到雌配子。圖1-A顯示分離出的煙草卵器,包含了形態(tài)完整的中央細胞、卵細胞和2個助細胞。利用微針輕柔吸打和剝離可以分離出胚囊中不同類型的細胞,包括卵細胞(圖1-B)。顯微鏡視野中的卵細胞形態(tài)完好,具有大的液泡,且沒有母體組織粘連。證明其符合進行少量細胞RT-PCR檢測的要求,可參與后續(xù)試驗過程。

2.2煙草NtDEH1基因的克隆

使用煙草未受精胚珠制作的RACE文庫,通過RACE技術獲取了NtDEH1基因的完整3′端,但5′端擴增沒有得到延伸。通過ORF分析發(fā)現(xiàn)已知序列含有一個651 bp的開放閱讀框。在卵細胞cDNA中進行RT-PCR檢測可以擴增得到該基因的CDS(圖2-A),使用同樣的引物在基因組中擴增該基因,發(fā)現(xiàn)其中包含一個長度為535 bp的內(nèi)含子(圖2-A，B)。運用Genome walking技術獲取了NtDEH1基因的5′側翼序列,包括5′UTR區(qū)和啟動子區(qū),總長1 706 bp(圖2-A),在基因組上回擴驗證,發(fā)現(xiàn)該基因及其啟動子可以一同被擴增出(圖2-A)。運用BlastX分析發(fā)現(xiàn)其與諸多物種的脫水素基因類似(圖2-C)。

A.煙草卵器,箭頭表示卵細胞,標尺=10 μm；

A.NtDEH1基因的克隆;1.在基因組中擴增基因及5′側翼序列;2.在基因組中擴增基因5′側翼序列;3.在基因組中擴增CDS;

2.3NtDEH1蛋白一級結構預測分析

使用Protparam軟件對NtDEH1蛋白的氨基酸序列進行分析。表2中的結果表明,NtDEH1蛋白的多肽鏈由217個氨基酸組成,分子量約為2.460 5 kDa。多肽鏈包含有18 種基本的氨基酸類型,但不含半胱氨酸和色氨酸。其中谷氨酸和賴氨酸的含量最為豐富,各占有23.5%和20.7%。此外預測結果表明,NtDEH1蛋白的理論等電點為5.27,應屬于酸性蛋白,且具有一定的親水性。

2.4NtDEH1蛋白同源序列比對與 進化分析

利用BlastX 搜索煙草NtDEH1蛋白的同源序列,在絨毛狀煙草(Nicotianatomentosiformis)和林煙草(Nicotianasylvestris)中發(fā)現(xiàn)了非常同源的蛋白序列。 由于二倍體野生煙草絨毛狀煙草和林煙草是異源四倍體普通煙草的祖先種,因此,發(fā)現(xiàn)高度同源蛋白符合預期結果。而在甜辣椒、番茄、馬鈴薯、丹參等農(nóng)作物中也都存在與NtDEH1蛋白類似的蛋白序列,其中煙草與甜辣椒的同源序列比煙草與同屬茄科的番茄和馬鈴薯的同源序列在進化樹上更接近(圖3)。同時可以看出,雖然在木本棉和擬南芥中也有類似同源蛋白,但是在進化上與NtDEH1蛋白相距較遠。

表2　NtDEH1蛋白一級結構預測分析

對除了擬南芥和木本棉的其他物種中NtDEH1蛋白的氨基酸序列進行比對,發(fā)現(xiàn)這些序列都極其保守,這可能與其脫水素特性有密切關系。脫水素具有保守的K片段(EKKGIMDKIKEKLPG),通常位于氨基酸序列的C末端,2個片段能形成雙親性α螺旋。在普通煙草、絨毛狀煙草、林煙草、甜辣椒、番茄、馬鈴薯和丹參中均有此特殊的標志性序列。另外,在這些同源序列中還存在一個可能的核定位信號,即S片段(連續(xù)的6個絲氨酸殘基),這些都符合Close 等所擬定的脫水素分類方法中SK2型脫水素的特點:即含有一個S片段和2個K片段(圖4)。

圖3　NtDEH1同源蛋白的系統(tǒng)進化樹

圖4　NtDEH1同源蛋白氨基酸序列比對分析

2.5NtDEH1基因的5′側翼序列的啟動活性

利用已知的NtDEH1基因的cDNA序列在基因組上借助Genome walking技術獲得了長度約1 706 bp的5′側翼序列。為了驗證其啟動活性,使用小葉煙草瞬時表達系統(tǒng)進行檢測。將擴增的5′側翼序列連入含有核定位信號和GFP熒光信號的啟動子活性檢測載體中。載體經(jīng)農(nóng)桿菌轉化后被注入小葉煙草葉片,2 d后觀察。圖5表明瞬時轉化的葉片中核定位信號非常強烈,這暗示該段5′側翼序列具有較強的啟動子活性。因此,本研究所獲得的5′側翼序列可啟動基因的表達,能用于后續(xù)試驗。

A.葉肉細胞明視野;B.葉肉細胞中GFP核定位熒光;C.GFP熒光和明視野疊加,標尺=20 μm.

3結論與討論

在面臨干旱、寒冷和高鹽脅迫時植物中的脫水素會大量表達以應對細胞的脫水反應。而此時脫水素的表達范圍也會比在非逆境下更廣泛。例如經(jīng)低溫處理后的擬南芥脫水素蛋白的表達范圍由非低溫狀態(tài)下的根尖擴展至全植株[18],野生馬鈴薯和大麥中的脫水素蛋白也具有相似的表達特點[2,19]。 車前葉玄參的脫水素蛋白經(jīng)過干旱脅迫后會在全植株表達,而不是正常狀態(tài)下僅在種子、根和葉子中表達。同樣番茄的脫水素蛋白經(jīng)過高鹽脅迫后表達范圍也逐漸擴展[20]。這些試驗結果證明脫水素對于植物的正常生長發(fā)育和抗逆性極其重要。而眾多的轉基因株系都表明過表達脫水素能賦予植株更強的抗逆性[21]。利用脫水素的這種特性對于農(nóng)業(yè)的增產(chǎn)增收能提供非常有力的幫助。因此,目前關于脫水素的研究基本集中于其在植物的營養(yǎng)發(fā)育時期及種子成熟過程中起的作用,以及其作用機理和表達模式等。

本研究成功地從煙草卵細胞中分離得到了一個脫水素基因NtDEH1,基因全長651 bp,編碼217個氨基酸。通過Blast比對分析序列,發(fā)現(xiàn)在許多物種比如絨毛狀煙草、林煙草、甜辣椒、番茄、馬鈴薯和丹參中都具有與之非常類似的同源序列。新發(fā)現(xiàn)的脫水素按照分類應屬于SK2型。借助染色體步移技術獲得了該基因的5′側翼序列,通過瞬時轉化證實其具有較強的啟動子活力。不同于之前脫水素的表達模式,NtDEH1基因在卵細胞中大量表達,這是首次在煙草卵細胞中發(fā)現(xiàn)脫水素基因的存在。因此,今后可通過RNAi技術和定點突變技術來了解該脫水素基因對煙草卵細胞形成、發(fā)育乃至受精的重要影響,可以進一步豐富脫水素在植物體內(nèi)的功能、作用機理與表達模式。

參考文獻：

[1]Graether S P,Boddington K F.Disorder and function:a review of the dehydrin protein family [J].Front Plant Sci,2014,5:576.

[2]Rorat T.Plant dehydrins-tissue location,structure and function[J].Cellular & Molecular Biology Letters,2006,11(4):536-556.

[3]Wise M J.LEAping to conclusions:a computational reanalysis of late embryogenesis abundant proteins and their possible roles[J].BMC Bioinformatics,2003,4:52.

[4]Close T J.Dehydrins:A commonality in the response of plants to dehydration and low temperature[J].Physiol Plant,1997,100:291-296.

[5]Hanin M,Brini F,Ebel C,et al.Plant dehydrins and stress tolerance-versatile proteins for complex mechanisms[J].Plant Signaling and Behavior,2011,6:1503-1509.

[6]Yang Y,He M,Zhu Z,et al.Identification of the dehydrin gene family from grapevine species and analysis of their responsiveness to various forms of abiotic and biotic stress[J].BMC Plant Biol,2012,12:140.

[7]Wang Y,Xu H,Zhu H,et al.Classification and expression diversification of wheat dehydrin genes[J].Plant Sci,2014,214:113-120.

[8]Hara M,Shinoda Y,Kubo M,et al.Biochemical characterization of theArabidopsisKS-type dehydrin protein,whose gene expression is constitutively abundant rather than stress dependent[J].Acta Physiologiae Plantarum,2011,33:2103-2116.

[9]Vaseva II,Anders I,Feller U.Identification and expression of different dehydrin subclasses involved in the drought response ofTrifoliumrepens[J].J Plant Physiol,2014,171(3-4):213-24.

[10]Ruibal C,Salamó I P,Carballo V,et al.Differential contribution of individual dehydrin genes fromPhyscomitrellapatensto salt and osmotic stress tolerance[J].Plant Sci,2012,190:89-102.

[11]Kim E C,Lee H S,Choi D W.Sequence variability and expression pattern of the dehydrin gene family inPopulustremula×Populusalbavar.glandulosa.[J].Plant Omics,2012,5:122.

[12]Koag M C,Fenton R D,Wilkens S,et al.The binding of maize DHN1 to lipid vesicles.Gain of structure and lipid specificity[J].Plant Physiology,2003,131(1):309-316.

[13]Hara M,Fujinaga M,Kuboi T.Radical scavenging activity and oxidative modification of citrus dehydrin[J].Plant Physiology and Biochemistry,2004,42(7/8):657-662.

[14]Hara M,Fujinaga M,Kuboi T.Metal binding by citrus dehydrin with histidine-rich domains[J].Journal of ExPerimental Botany,2005,56(420):2695-2703.

[15]Arora R,Wisniewski M E.Cold acclimation in genetically related (sibling) deciduous and evergreen peach (PrunuspersicaL.Batsch).Ⅱ.A 60-kilodalton bark protein in cold-acclimated tissues of peach is heat stable and related to the dehydrin family of proteins[J].Plant Physiology,1994,105(1):95-101.

[16]Lopez C G,Banowetz G,Peterson C J,et al.Differential accumulation of a 24-kd dehydrin protein in wheat seedlings correlates with drought stress tolerance at grain filling[J].Hereditas,2001,135(2/3):175-181.

[17]Zhao J,Xin H,Qu L,et al.Dynamic changes of transcript profiles after fertilization are associated with de novo transcription and maternal elimination in tobacco zygote,and mark the onset of the maternal-to-zygotic transition[J].Plant J,2011,65(1):131-45.

[18]Nylander M,Svensson J,Palva E T,et al.Stress-induced accumulation and tissue-specific localization of dehydrins inArabidopsisthaliana[J].Plant Molecular Biology,2001,45(3):263-279.

[19]Bravo L A,Close T J,Corcuera L J,et al.Characterization of an 80-kDa dehydrin-like protein in barley responsive to cold acclimation[J].Physiol Plant,1999,106:177-183.

[20]Godoy J A,Lunar R,Torres-Schumann S,et al.Expression,tissue distribution and subcellular localization of dehydrin TAS14 in salt-stressed tomato plants[J].Plant Mol Biol,1994,26:1921-1934.

[21]Ma H,Sun M,An T T,et al.Distribution,structure and function of dehydrin [J].Molecular Plant Breeding,2015,13(7):1668-1672.

Cloning and Analysis of Dehydrin GeneNtDEH1 inNicotianatabacum

LUO An1,ZHAN Ling2

(1.College of Life Science,Yangtze University,Jingzhou434023,China;2.College of Life Science,Wuhan University,Wuhan430072,China)

Abstract：To study the function and mechanism of dehydrin in early embryogenesis of plant,egg cells were isolated from tobacco to construct a cDNA library,and a gene named NtDEH1 were found.The full sequence of NtDEH1 were obtained by RACE,genome cloning and bioinformatics analysis showed that NtDEH1 included a 651 bp CDS region and a 535 bp intron.NtDEH1 which contained 217 amino acids were hydrophilic and acidic,the theory isoelectric point was 5.27.The amino acid homology of NtDEH1 compared Nicotiana tabacum to Nicotiana tomentosiformis,Nicotiana sylvestris,Capsicum annuum,Solanum tuberosum,Solanum lycopersicum and Salvia miltiorrhiza showed that NtDEH1 homologous sequences in all these species were conserved and belonged to SK2type.5′ flanking sequence of NtDEH1 gene was also obtained by genome-walking,and the promoter activity of 5′ flanking sequence was checked by transient gene expression.The result laid a foundation in researching the role of NtDEH1 gene in plant reproduction.

Key words:Tobacco;Dehydrin;Gene cloning; NtDEH1;Promoter;Egg cell

doi:10.7668/hbnxb.2016.01.012

中圖分類號：Q942.1;S572.03

文獻標識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)01-0071-06

作者簡介：羅岸(1984-),男,湖北荊州人，講師，博士，主要從事植物生殖發(fā)育生物學研究。

基金項目：長江大學自然科學基金項目(2014NSFY023)

收稿日期：2015-11-10