皇甫冰，龐文彪，張銳虎，郭　 民，高繼萍，宋國華*（山西醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物與人類疾病動物模型山西省重點實驗室，山西 太原 030001）

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中國地鼠口腔頰囊黏膜癌模型的建立及癌變的動態(tài)觀察

皇甫冰，龐文彪，張銳虎，郭 民，高繼萍，宋國華*
（山西醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物與人類疾病動物模型山西省重點實驗室，山西 太原 030001）

【摘要】目的： 利用二甲基苯并蒽(DMBA)涂抹法建立中國地鼠頰囊黏膜癌的實驗動物模型，觀察癌變不同時期的組織學動態(tài)變化過程。方法：將60只雄性中國地鼠隨機分為3組，分別為模型組(24只)、溶劑對照組(12只)、空白對照組(24只)。溶劑對照組僅涂丙酮液，空白對照組不作任何處理，模型組以0.5% DMBA涂抹中國地鼠兩側頰囊，每周3次，共15周。分別于第6、9、12、15周將模型組和空白對照組隨機處死6只，溶劑對照組處死3只，在肉眼及光鏡下動態(tài)觀察頰囊黏膜癌變?nèi)^程的形態(tài)學和顯微組織學改變。結果：與對照組比較，DMBA長時間處理后模型組地鼠相繼出現(xiàn)口腔內(nèi)黏膜充血、增厚、潰爛化膿、白斑及菜花狀贅生物等變化，經(jīng)歷了單純上皮增生(6~9周)、不同程度上皮異常增生(9~12周)、原位癌及鱗狀細胞癌(12~15周)等階段。結論：DMBA涂抹法可成功建立中國地鼠頰囊黏膜癌前病變、鱗狀細胞癌模型，發(fā)病過程與人類口腔鱗狀細胞癌相似，為口腔鱗癌的多階段、多步驟研究提供了一個較為理想的動物模型。

【關鍵詞】中國地鼠；頰囊黏膜；口腔鱗狀細胞癌；二甲基苯并蒽；動物模型

作者信息： 皇甫冰，E-mail：bhuangfu@hotmail.com。*通信作者，宋國華，E-mail：ghsongg@hotmail.com

Development of oral buccal pouch mucosa cancer in Chinese hamsters and dynamic observation of their carcinogenesis

HUANGFU Bing，PANG Wenbiao，ZHANG Ruihu，GUO Min，GAO Jiping，SONG Guohua*
(Laboratory Animal Center, Shanxi Key Laboratory of Experimental Animal Science and Human Disease Animal Model, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi, China)

【ABSTRACT】OBJECTIVE：To observe the dynamic histological changes in dimethylbenzanthracene(DMBA)-induced cancer in the Chinese hamster’s buccal pouch mucosa cancer experimental animal model. METHODS： 60 male Chinese hamsters were randomly divided into three groups：experimental group(24 hamsters)，solvent control group (12 hamsters) and control group(24 hamsters). In the solvent control group，the site was only coated with acetone solution. The buccal pouch mucosas were treated with 0.5% DMBA 3 times a week for 15 weeks. For the experimental and the control groups，6 hamsters were randomly selected and killed after 6 weeks，9 weeks，12 weeks and 15 weeks. For the solvent control group，3 hamsters were killed each time. The morphological and histological changes of buccal pouch mucosa were dynamic observed under naked eye and light microscope. RESULTS：Compared with the control group，a series of abnormal changes was consecutively observed in the experimental group：hyperemia，incrassation，festering Canker，leukoplakia， Cauliflower shape vegetations. The stages of histological changes had the simple hyperplasia(6th-9thweek)，the epithelial dysplasia of different degrees(9th-12thweek)，carcinoma in situ and squamous cell carcinomas (12th-15thweek). CONCLUSION：Our experimental model shows similar changes to that of human oral squamous cell carcinoma. Therefore，the model can be used to study oral squamous cell carcinoma in multi-stage and multi-step dynamic development.

【KEY WORDS】Chinese hamster； buccal pouch mucosa；oral squamous cell carcinoma；dimethylbenzanthracene；animal m odel

口腔癌是全球第6大常見惡性腫瘤，全世界每年估計有27.5萬例新增病例和12.8萬例死亡人數(shù)，已成為一個重要的全球性健康問題[1]。口腔黏膜癌是一種發(fā)病率高、浸潤和轉移較快的黏膜上皮性腫瘤，絕大多數(shù)為口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)，目前臨床療效不佳，中期患者預后較差、生存率低[2]，因而有必要建立口腔黏膜癌模型來滿足口腔癌的研究需要。基礎及臨床研究均證實口腔黏膜癌變是一個多階段、多步驟的動態(tài)發(fā)展過程[3-6]，但目前仍缺乏更細致全面的癌變動態(tài)觀察。國內(nèi)主要有金黃地鼠口腔頰囊黏膜癌前病變及鱗癌等動物模型[7-9]。根據(jù)中國地鼠雙側頰囊菲薄，血管豐富，便于牽出的優(yōu)勢，我們采用0.5%二甲基苯并蒽 (9，10-dimethyl-1，2-benzanthracene，DMBA)通過雙側頰囊涂抹的方式建立口腔頰囊黏膜癌前病變及鱗癌中國地鼠模型，對其癌變過程進行動態(tài)觀察分析，旨在研究口腔癌動態(tài)發(fā)展的病理形態(tài)變化，為探討口腔癌的發(fā)病機制，監(jiān)測癌前病變惡化及對口腔癌的治療和預防提供指導。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

清潔級健康雄性中國地鼠60只，由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供(許可證號SCXK晉2015-0001)， 體質量21~25 g，8~10周齡，在干燥、空氣流通、24 h 光暗循環(huán)條件下飼養(yǎng)。將DMBA(美國Sigma公司)與分析純丙酮溶液配制成5 g/L的DMBA丙酮溶液。

1.2 分組及HE染色

隨機將60只雄性中國地鼠分為3組，分別為模型組(24只)、溶劑對照組(12只)、空白對照組(24只)。每周一、三、五上午9：00用小頭棉簽在模型組地鼠雙側頰囊涂擦0.5% DMBA丙酮液，用洗耳球吹干并禁食禁水2 h；溶劑對照組僅涂丙酮液；空白對照組不作任何處理。分別于第6、9、12、15周將模型組和空白對照組隨機處死6只，溶劑對照組隨機處死3只，取口腔一側完整頰囊黏膜組織于10%的中性福爾馬林溶液中固定、脫水、石蠟包埋、切片、HE染色、封片。

1.3 實驗觀察

1.3.1 肉眼觀察 實驗中每天觀察記錄中國地鼠的精神狀況、毛色情況及進食飲水量，重點觀察口腔內(nèi)黏膜變化，觀察是否出現(xiàn)充血、黏膜增厚、潰爛化膿、白斑及菜花狀贅生物等變化。

1.3.2 光鏡觀察 每例在光鏡下觀察3個視野，將病理改變按WHO標準的12項分級記錄進行判定[10]，分為單純性上皮增生，異常增生(輕、中、重度)，原位癌和鱗癌。

2 結 果

2.1 中國地鼠基本情況及頰囊形態(tài)學改變

空白對照組中國地鼠精神、食欲、靈敏度良好，毛色光滑明亮。實驗始末頰囊黏膜未見潰爛及新生物，光滑紅潤，乳膜下血管清晰可見，與鄰近組織無明顯差異(圖1A)。溶劑對照組形態(tài)、質地與空白對照組一致(圖1B)。而模型組在DMBA持續(xù)作用下中國地鼠變得精神萎靡、食欲不佳、活動遲緩，毛色晦暗粗糙，明顯消瘦。在給藥第3～4周時，頰囊黏膜出現(xiàn)輕度的充血及水腫；5～6周時黏膜逐漸變粗糙，增厚不明顯，黏膜光滑紅潤，彈性較好，可見黏膜下血管(圖1C)；第9周時黏膜明顯增厚，在粗糙的基礎上出現(xiàn)不規(guī)則的糜爛面和淺表潰瘍，局部可見有白色斑塊病損，涂擦時容易出血(圖1D)；12周時表面可見大量粗糙突出的白色斑塊病損，糜爛和潰瘍增大，部分出現(xiàn)贅生物，探之易出血，黏膜彈性降低(圖1E)；第15周時地鼠腮幫腫大，大多數(shù)黏膜有贅生物，開始形成黃豆大小的腫塊，表面呈菜花狀，質地較硬，并不斷增大，手術分離黏膜時，極脆易碎。病變頰囊趨于黏連生長，頰囊袋子變小變淺，出現(xiàn)癌性潰瘍，中央潰瘍，周圍有硬結(圖1F)。

2.2 中國地鼠頰囊組織病理學改變

正常中國地鼠頰囊黏膜組織病理學上為3～5層細胞組成的復層角化鱗狀上皮，上皮和肌層之間為薄層結締組織，有少量散在的纖維細胞和血管，基底細胞排列整齊，無釘突或釘突不明顯。棘細胞層較薄，基底層細胞明顯，類似人的正常黏膜。溶劑對照組與空白對照組相同，光鏡下組織學表現(xiàn)與正常黏膜一致，無異常改變(圖2A和B)。

模型組在第6周時組織病理檢查見黏膜上皮粒層和棘層呈團塊狀增厚，粒層細胞明顯?；准毎麑釉龊?，細胞形態(tài)正常，基底膜仍整齊清晰。黏膜下散在炎性細胞浸潤，一些血管充血及有血細胞滲出。極少數(shù)頰囊黏膜表現(xiàn)為非典型性增生，釘突形成(圖2C)。

在第9周時多數(shù)上皮角化層增厚，呈過度正角化，少數(shù)錯角化。上皮層次不明顯，黏膜上皮粒層和棘層細胞明顯增厚，基底細胞增生呈明顯復層樣改變，多數(shù)基底細胞極性消失，但基底膜清楚未見破壞，上皮釘突增寬，呈釘狀和乳頭狀。上皮細胞體積變大，細胞形態(tài)不一，胞漿豐富，核漿比例倒置，細胞核濃染，嗜堿性增強。黏膜下層有中度炎性浸潤，漿細胞浸潤。鏡下偶見上皮萎縮，固有層呈明顯炎癥細胞反應，為潰瘍組織學表現(xiàn)(圖2D和E)。

A：空白對照組；B：溶劑對照組；C：模型組第6周；D：模型組第9周；E：模型組第12周；F：模型組第15周.圖1 中國地鼠頰囊黏膜癌變的大體觀察

第12周時上皮明顯增生，分層紊亂，過角化、錯角化嚴重，有些部分形成“V字形過角化”，棘細胞層出現(xiàn)單個或成團細胞角化?；讓蛹毎龊瘢惓Ｔ錾募毎奂吧掀?/3以上，大量細胞極向消失，排列紊亂。上皮細胞間附著減弱或消失，細胞間距增大，偶見上皮裂隙，形態(tài)大小不一，上皮細胞核欠規(guī)則，染色質邊集，核大深染，核漿比例改變，有絲分裂相增加。固有層可見大量炎性細胞浸潤。上皮釘突肥大延伸呈足狀和水滴狀，但基底膜仍完整，未侵入黏膜下層，呈中重度異常增生改變。嗜堿性增強。少數(shù)非典型增生累及上皮全層，滴狀釘突形成并有“滴脫落”現(xiàn)象，為原位癌(圖2F和G)。

第15周時上皮細胞與胞核呈明顯多形性表現(xiàn)，上皮增殖并突破基底膜侵入固有層及結締組織內(nèi)，可見數(shù)個腫瘤島，伴隨初期角化和非典型的核分裂，核仁增大，呈高分化鱗狀細胞癌和接近肌層的浸潤癌(圖2H)。

A：空白對照組；B：溶劑對照組；C：模型組第6周；D：模型組第9周；E：模型組第9周；F：模型組第12周；G：模型組第12周；H：模型組第15周.圖2 中國地鼠頰囊黏膜癌變的組織病理學觀察(HE染色，×200)

3 討 論

口腔鱗狀細胞癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，大約占口腔頜面部惡性腫瘤的90%，手術、放化療是主要治療方式，但預后不佳[11-13]。口腔鱗狀細胞癌手術治療帶來的咀嚼、吞咽、語言等功能障礙及容貌畸形，嚴重影響患者的術后生存質量，術后5年生存率通常在60%左右，晚期患者僅20%~40%[14-15]。充分認識口腔鱗癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，尋找早期診斷指標，特別是進行口腔鱗狀細胞癌不同分化程度的診斷和針對性治療，成為了頭頸部鱗癌研究中的熱點與難點。

頰黏膜鱗癌是一類侵襲性較強、復發(fā)率較高的惡性腫瘤，是我國的常見惡性腫瘤，但相關報道比較有限[16-17]。人頰黏膜鱗狀細胞癌變過程是由正?？谇火つど掀ぁつど掀渭冊錾つど掀ぎ惓Ｔ錾谇击[癌的連續(xù)動態(tài)變化過程[18-19]。本實驗用DMBA成功地誘發(fā)了中國地鼠頰囊黏膜癌，經(jīng)組織學觀察相似于人類頰黏膜鱗狀細胞癌。目前暫無有關DMBA誘導中國地鼠頰囊黏膜癌的報道。中國地鼠較以往實驗常用的金黃地鼠生命力更強、易于飼養(yǎng)；個體較小，易于單手操作；兩側頰囊容易牽引翻脫、血管豐富，是微循環(huán)研究、免疫學研究和腫瘤移植的理想直觀部位，腫瘤易于觀察和切取，是實驗腫瘤學的理想實驗動物[20]； 口腔黏膜與人類十分相似，可模擬人類口腔癌變過程。因此可作為口腔黏膜癌模型研究，該動物模型的建立有助于我們對口腔癌變這一發(fā)生、發(fā)展過程進行更為詳細的多階段、多步驟的動態(tài)觀察。

本研究用DMBA涂擦中國地鼠頰囊黏膜建立的口腔頰黏膜癌前病變和鱗癌模型作為研究對象，通過定期處死動物，分別從肉眼下和光鏡下兩方面動態(tài)觀察了中國地鼠口腔頰囊黏膜癌變的全過程。實驗結果顯示，在肉眼下中國地鼠頰囊黏膜在15周中經(jīng)歷了正?！溲?、糜爛、化膿—增厚、粗糙—白斑樣改變—菜花狀新生物的動態(tài)過程。在DMBA的連續(xù)作用下，口腔頰囊黏膜的彈性緩慢下降，黏膜粗糙性、厚度、糜爛面、潰瘍面及白色斑塊等嚴重程度均呈穩(wěn)定性增長，頰囊黏膜與周圍組織分界不清，并最終出現(xiàn)惡性病變。光鏡下對 DMBA 涂擦中國地鼠頰囊黏膜的顯微組織學觀察表明：依次經(jīng)過正常上皮細胞—單純增生—異常增生(輕度—中度—重度)—原位癌—浸潤癌的序列變化。按WHO癌前病變的判斷標準[6]，6周時主要為單純性上皮增生，9周時呈輕度上皮異常增生和中度上皮異常增生，12周時呈中度上皮異常增生，部分出現(xiàn)原位癌，15周時已發(fā)生癌變，癌細胞突破基底膜侵入固有層及結締組織內(nèi)。在實驗開始1~6周內(nèi)，上皮細胞的形態(tài)呈相對穩(wěn)定狀態(tài)，改變不明顯，在9周以后逐漸出現(xiàn)不典型增生，并逐漸嚴重發(fā)展為癌。因此，本次實驗建模成功，癌變過程的連續(xù)動態(tài)觀察為口腔頰黏膜癌前病變的早期診斷提供參考，為下一步從轉錄水平探索口腔黏膜癌變的發(fā)病機制和尋找更科學合理有效的腫瘤標志物奠定基礎，為口腔黏膜癌變的治療和預后提供有益的方法和思路。

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基金項目：山西省實驗動物專項(2014k08，2015k03)

收稿日期：2015-09-25；

修訂日期：2015-12-01

中圖分類號：R73-3

文獻標志碼：A

文章編號：1004-616X(2016)01-0056-05

doi:1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.01.012