唐 嬌趙 敏楊 穎李 慶黃俊明*楊杏芬*（. 廣 東省疾病預(yù)防控制中心衛(wèi)生毒理所廣東 廣州 5430；2. 廣 東省生物制品與藥物研究所藥理研究室廣東 廣州 50440）

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三七的急性毒性及致突變性試驗(yàn)研究

唐 嬌1，2，趙 敏1，楊 穎1，李 慶1，黃俊明1，*，楊杏芬1，*
（1. 廣 東省疾病預(yù)防控制中心衛(wèi)生毒理所，廣東 廣州 511430；2. 廣 東省生物制品與藥物研究所藥理研究室，廣東 廣州 510440）

【摘要】目的： 探討三七的急性毒性和致突變性，為評(píng)價(jià)其安全性提供毒理學(xué)依據(jù)。方法：采用小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)和Ames試驗(yàn)，參考《食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序》進(jìn)行。小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)采用最大耐受劑量法，折合劑量為15 g/kg。小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)及小鼠精子畸形試驗(yàn)均設(shè)10.00、5.00、2.50 g/kg劑量組，另設(shè)溶劑和陽(yáng)性對(duì)照組。Ames試驗(yàn)設(shè)2、8、40、200、1 000、5 000 μg/皿劑量組，另設(shè)自發(fā)回變組、溶劑及陽(yáng)性對(duì)照組。結(jié)果：急性毒性試驗(yàn)顯示小鼠對(duì)三七經(jīng)口灌胃的最大耐受劑量>15 g/kg。小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)和精子畸形試驗(yàn)中，各劑量組的微核率和精子畸形率與溶劑對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Ames試驗(yàn)中，在加與不加S9時(shí)各劑量組回變菌落數(shù)均未超過(guò)自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍，亦無(wú)劑量-反應(yīng)關(guān)系，結(jié)果為陰性。結(jié)論：在本實(shí)驗(yàn)條件下，三七對(duì)小鼠的經(jīng)口急性毒性屬于無(wú)毒級(jí)，對(duì)小鼠體細(xì)胞、雄性生殖細(xì)胞和鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型菌株均未見潛在的致突變性。

【關(guān)鍵詞】三七；急性毒性；致突變性；微核試驗(yàn)；精子畸形試驗(yàn)；Ames試驗(yàn)

作者信息： 唐 嬌，E-mail：tangjiao85@163.com。*通信作者，黃俊明，E-mail：huangjunming@cdcp.org.cn；楊杏芬，E-mail：yangxingfen

Study on acute toxicity and mutagenicity of Panaxnotoginseng

TANG Jiao1，2，ZHAO Min1，YANG Ying1，LI Qing1，HUANG Junming1，*，YANG Xingfen1，*
(1. Institute of Toxicology, Guangdong Provincial Center for Disease Control and Prevention, Guangzhou 511430; 2. Department of Pharmacology, Guangdong Provincial Institute of Biological Products and Materia Medica, Guangzhou 510440, Guangdong, China)

【ABSTRACT】OBJECTIVE: To access the safety of Panaxnotoginseng as a health food through assessing its acute toxicity and mutagenicity. METHODS：Oral acute toxicity test，mouse bone marrow micronucleus test，mouse sperm malformation test，Ames test were performed according to the national standard procedures for toxicological assessment of foods. RESULTS：The MTD of Panaxnotoginseng in mouse was more than 15 g/kg，the polychromatic eryrocyte micronucleus rates，sperm abnormality rates at all doses (10.00，5.00，2.50 g/kg) were not significantly different from the solvent control. In the presence or absence of S9 or not，the number of revertant colonies in six dose groups (2，8，40，200，1 000，5 000 μg/plate) did not exceed 2- fold of the spontaneous revertant colony number，nor was there a dose-response relationship，the results of Ames test was negative. CONCLUSION：Panaxnotoginseng did not show acute toxicity and mutagenicity u nder our study conditions.

【KEY WORDS】Panaxnotoginseng；acute toxicity；mutagenicity；micronucleus test；mouse sperm malformation test；Ames test

三七為五加科植物三七的干燥根，主產(chǎn)于云南、廣西等地，多數(shù)情況為磨粉直接食用[1]。三七含有人參皂苷、三七皂苷及多糖等活性成份[2]。藥理分析表明，其具有降血脂[3]，鎮(zhèn)靜安神、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能[4-5]，緩解動(dòng)脈粥樣硬化[6]，抗腫瘤[7]等多種功能。由于三七的上述作用，三七不但用于臨床治療，還廣泛應(yīng)用于食療藥膳中，具有提高人體免疫力，增強(qiáng)體質(zhì)，延緩衰老的作用[8]。近幾年，隨著食品藥品加工技術(shù)的進(jìn)步，三七應(yīng)用于具有安神助眠、提高免疫力、降低血脂等功能的保健產(chǎn)品的開發(fā)。但是，鮮見三七作為保健食品長(zhǎng)期服用方式的安全性評(píng)價(jià)。本文對(duì)三七的經(jīng)口急性毒性和致突變性進(jìn)行研究，完善其安全性評(píng)價(jià)基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試物 采用產(chǎn)自云南文山州的三七作為試驗(yàn)材料，購(gòu)于廣州健安堂藥業(yè)有限公司。機(jī)械粉碎成粉末，過(guò)120目網(wǎng)篩供試驗(yàn)用。經(jīng)中國(guó)廣州分析測(cè)試中心檢測(cè)其中三七皂苷R1的含量為1.92%。因其不溶于水，以羧甲基纖維素鈉將其配成混懸液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)條件 采用廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的NIH種SPF級(jí)健康小白鼠，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵)2008-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境動(dòng)物房，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(粵)2008-0011，室溫20～26℃，濕度40%～70%。

1.1.3 菌種及S9混合液 鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102試驗(yàn)菌株，經(jīng)過(guò)生物學(xué)鑒定符合要求。大鼠肝S9混合液由廣東省疾病預(yù)防控制中心毒理所提供。

1.1.4 主要試劑 疊氮鈉、敵克松、1，8-二羥蒽醌，羧甲基纖維素、Giemsa染料均購(gòu)自Sigma公司；2-乙酰胺基芴購(gòu)自Fluka公司，絲裂霉素-C購(gòu)自Roche公司，生物素購(gòu)自上海源聚生物科技有限公司，組氨酸由中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 小鼠急性毒性試驗(yàn)[9]采用最大耐受量法。選用體質(zhì)量18～22 g的健康NIH種小白鼠20只，雌雄各半，觀察3 d后，禁食16 h，不限制飲水。試驗(yàn)時(shí)，用羧甲基纖維素配置受試物濃度為0.25 g/mL，充分混勻后按20 mL/kg灌胃，24 h內(nèi)灌胃3次，每次間隔4 h 以上，累計(jì)劑量15 g/kg。灌胃后立即觀察小鼠有無(wú)異常表現(xiàn)及程度、出現(xiàn)時(shí)間、死亡情況等。連續(xù)觀察14 d 。

1.2.2 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)[10]采用30 h給受試物法進(jìn)行試驗(yàn)。選擇NIH種小鼠50只，體質(zhì)量25~30 g，隨機(jī)分為5組即3個(gè)受試物劑量組、溶劑對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照組，每組10只，雌雄各半。根據(jù)急性毒性試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)受試物為10.00、5.00、2.50 g/kg共3個(gè)劑量組，溶劑對(duì)照組給予等量羧甲基纖維素，陽(yáng)性對(duì)照組選用40 mg/kg環(huán)磷酰胺。灌胃量均為20 mL/kg，24 h后以同樣的劑量進(jìn)行第2次染毒，6 h后，處死小鼠取胸骨骨髓制片、染色、油鏡下每只小鼠觀察1 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞(polychromatic erythrocyte，PCE)，計(jì)數(shù)含有微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，計(jì)算各組微核發(fā)生率(‰)，同時(shí)計(jì)數(shù)200個(gè)PCE時(shí)觀察到的正染紅細(xì)胞(normochromatic erythrocyte，NCE)，計(jì)算嗜多染紅細(xì)胞數(shù)與成熟紅細(xì)胞數(shù)比值(nPCE/nRBC)。

1.2.3 精子畸形試驗(yàn)[11]選擇NIH種雄性小鼠25只，體質(zhì)量25～35 g，隨機(jī)分成5組(同微核試驗(yàn))，每組5只。每天灌胃1次，連續(xù)灌胃5 d，灌胃量均為20 mL/kg，首次染毒后第35天處死動(dòng)物取雙側(cè)附睪按常規(guī)制備精子涂片，染色，高倍鏡下每只小鼠觀察1 000個(gè)完整精子，計(jì)數(shù)含有精子畸形的數(shù)量和類型，計(jì)算各組精子畸形發(fā)生率(‰)。

1.2.4 Ames試驗(yàn)[12]TA97、TA98、TA100、TA102標(biāo)準(zhǔn)菌株，采用常規(guī)平板摻入法。設(shè)三七粉2、8、40、200、1 000、5 000 μg/皿共6個(gè)劑量組，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組、羧甲基纖維素溶劑對(duì)照組及各菌株的自發(fā)回變組。在加S9和不加S9兩種情況下，每個(gè)菌株每個(gè)劑量均設(shè)3個(gè)平行皿，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)每皿回變菌落數(shù)，計(jì)算各組平均菌落數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0對(duì)微核率、精子畸形率進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。Ames試驗(yàn)中的菌落數(shù)采用-x±s的方式表示，進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠急性毒性試驗(yàn)

在14 d觀察期內(nèi)，雌、雄小鼠外觀均正常，四肢活動(dòng)正常，無(wú)死亡。剖檢未出現(xiàn)肉眼可見病變。獲得雌雄小鼠三七經(jīng)口急性毒性最大耐受劑量(maximum tolerated dose，MTD)>15 g/kg。根據(jù)急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將其判定為無(wú)毒級(jí)物質(zhì)。

2.2 三七對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核率的影響

小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)的結(jié)果見表1，可見各劑量組的PCE微核率與溶劑對(duì)照組比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，試驗(yàn)結(jié)果為陰性；而環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組的PCE微核率明顯高于陰性對(duì)照組(P<0.01)。各劑量組nPCE/nRBC均 在正常值范圍內(nèi)(不能少于陰性對(duì)照組的20%)。

2.3 三七對(duì)小鼠精子畸形率的影響

小鼠精子畸形試驗(yàn)的結(jié)果見表2，各劑量組小鼠的精子畸形率與溶劑對(duì)照組比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，試驗(yàn)結(jié)果為陰性；而環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組的精子畸形率明顯高于陰性對(duì)照組(P<0.01)。

2.4 Ames試驗(yàn)結(jié)果

Ames試驗(yàn)回變菌落數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3，鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102共4株試驗(yàn)菌株，在加及不加S9時(shí)，5 000、1 000、200、40、8、2 μg/皿5個(gè)三七劑量組回變菌落數(shù)均未超過(guò)自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍，亦無(wú)劑量-反應(yīng)關(guān)系，無(wú)致突變性。在本實(shí)驗(yàn)條件下，各陽(yáng)性對(duì)照組均顯示出強(qiáng)烈的誘變作用，而各組自發(fā)回變數(shù)均在正常范圍內(nèi)，表明該試驗(yàn)系統(tǒng)可靠。第2次結(jié)果與第1次相同，未重復(fù)列出。

表1 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果

表2 小鼠精子畸形率統(tǒng)計(jì)(n=5)

表3 Ames試驗(yàn)回變菌落數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3 討 論

目前，三七廣泛用于日常藥膳及保健食品的開發(fā)，然而其保健用途的安全性還缺乏科學(xué)的評(píng)估資料。本試驗(yàn)根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序》，考慮體內(nèi)與體外試驗(yàn)，體細(xì)胞試驗(yàn)與生殖細(xì)胞試驗(yàn)相結(jié)合的原則，選用了小鼠急性毒性試驗(yàn)、Ames試驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)相結(jié)合，綜合評(píng)價(jià)三七的致突變性。

小鼠急性毒性試驗(yàn)MTD>15 g/kg，三七屬于無(wú)毒級(jí)。Ames試驗(yàn)結(jié)果為陰性，表明三七在體外試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)致突變作用。體內(nèi)試驗(yàn)中的小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果表明在本實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)三七對(duì)體細(xì)胞的致突變作用，小鼠精子畸形試驗(yàn)亦未發(fā)現(xiàn)三七對(duì)生殖細(xì)胞的致突變作用。

在以往的相關(guān)研究中，鮮三七液的急性毒性試驗(yàn)的毒性劑量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為無(wú)毒級(jí)；設(shè)定劑量1、2、5 g/kg分別為低、中、高劑量組進(jìn)行小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)和小鼠睪丸生殖細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)，染色體畸變率各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異，未見致突變性[13]。本實(shí)驗(yàn)相對(duì)以往的研究，選用三七粉為受試物，是人們?cè)谌粘１＝≈凶畛Ｊ秤玫氖茉囄餇顟B(tài)，不同于鮮三七液為提取液。并且試驗(yàn)最高劑量提高到10.00 g/kg，拓寬了三七的安全范圍。

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基金項(xiàng)目：國(guó)家十一五863計(jì)劃項(xiàng)目(2010AA023001)；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(S2013010013289)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B010404033)；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(201300000161)；廣東省中藥局課題(20132 108，20121275)

收稿日期：2015-06-16；

修訂日期：2015-11-18

中圖分類號(hào)：Q394.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-616X(2016)01-0066-04

doi:1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.01.014