鎮(zhèn)肝熄風湯對帕金森病肝陽上亢證大鼠中腦Akt和GSK-3β磷酸化的影響＊

王曉麗，孫 影，朱蘭芹，綦艷秋，張麗華，張紅宇，董妙先＊＊

（1.齊齊哈爾醫(yī)學院藥學院 齊齊哈爾 161006；2. 齊齊哈爾醫(yī)學院衛(wèi)生所 齊齊哈爾 161006）

鎮(zhèn)肝熄風湯對帕金森病肝陽上亢證大鼠中腦Akt和GSK-3β磷酸化的影響＊

王曉麗1，孫 影2，朱蘭芹2，綦艷秋2，張麗華2，張紅宇2，董妙先2＊＊

（1.齊齊哈爾醫(yī)學院藥學院 齊齊哈爾 161006；2. 齊齊哈爾醫(yī)學院衛(wèi)生所 齊齊哈爾 161006）

目的：本研究主要觀察鎮(zhèn)肝熄風湯對帕金森病肝陽上亢證大鼠中腦Akt及其下游靶分子GSK-3β磷酸化的影響。方法：105只大鼠隨機分為對照組、假手術(shù)組、模型組、鎮(zhèn)肝熄風湯高、中、低劑量組和司來吉蘭組。采用6-OHDA中腦微量注射合并附子湯灌胃制備帕金森病肝陽上亢證模型，采用分光光度法檢測中腦組織caspase-3活性，Western blot檢測腦組織Akt和GSK-3β磷酸化水平。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，帕金森病肝陽上亢證大鼠中腦caspase-3活性明顯增強，Akt和GSK-3β磷酸化水平明顯升高，而鎮(zhèn)肝熄風湯組中腦caspase-3活性明顯減弱，Akt和GSK-3β磷酸化水平明顯升高。結(jié)論：鎮(zhèn)肝熄風湯能夠減弱帕金森病肝陽上亢證大鼠中腦caspase-3活性，其機制可能與Akt活化和GSK-3β失活有關(guān)。

肝陽上亢證 鎮(zhèn)肝熄風湯 帕金森病 半胱天冬酶3 糖原合成酶激酶-3β

帕金森病（Parkinson’s Disease，PD）是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，特征性病理表現(xiàn)為黑質(zhì)紋狀體多巴胺神經(jīng)元凋亡[1]。左旋多巴制劑是目前國際治療PD最有效的補充治療措施[2]，但是長期服用會出現(xiàn)不良反應(yīng)和療效遞減；左旋多巴制劑雖能緩解癥狀但不能阻止其病理進程[3]。中藥復方多組分和多靶點調(diào)節(jié)作用，符合PD的多因素和多途徑發(fā)病以及癥狀的復雜性和進展性等特點及其治療需求[4]。近期國際研究提示中醫(yī)藥治療PD具有良好的前景[5]，在中醫(yī)辨證論治理論指導下，臨床應(yīng)用鎮(zhèn)肝熄風湯治療PD肝陽上亢證取得良好效果[6]，但機制尚不完全清楚。本研究在既往工作基礎(chǔ)上，探討鎮(zhèn)肝熄風湯對PD肝陽上亢證大鼠中腦神經(jīng)元凋亡（以caspase-3活性為指標）及蛋白激酶B（Protein Kinase B，PKB/Akt）和糖原合成激酶-3β（GlycogenSynthase Kinase-3β，GSK-3β）磷酸化的影響，為鎮(zhèn)肝熄風湯治療PD提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量220-240 g，維通利華（北京）實驗動物科技有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2012-0001。鼠顆粒飼料飼養(yǎng)，自由飲食。

1.1.2 藥物

附子湯由單味制附子組成，附子（黃岡金貴中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司，批號：D4120201）。鹽酸司來吉蘭片（成都蓉藥集團四川長威制藥有限公司，批號：20130902）。鎮(zhèn)肝熄風湯由懷牛膝30 g、代赭石30 g、生龍骨15 g、生牡蠣15 g、生龜板15 g、生白芍15 g、元參15 g、天冬15 g、川楝子6 g、生麥芽6 g、茵陳6 g和甘草4.5 g組成（哈爾濱市盛泰中藥飲片加工廠：批號分別為：130501、30301、130501、140301、140701、130401、130601、13110、140301、130501、130201、130601），水煎2次后合并煎液，過濾濃縮（含生藥3.0 g·mL-1）。6-羥基多巴胺（美國Santa Cruz公司，批號：#D2312）。

1.1.3 試劑

碧波caspase-3活性分光度法檢測試劑盒（南京碧波生物科技有限公司，批號：BA30100），細胞漿蛋白與核蛋白抽提試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：P0028），ECL顯影液（美國Thermo公司，批號：PH203837），p-GSK-3β抗體（美國Cell Signaling Technology公司，批號：0005），p-Akt抗體（美國Santa Cruz公司，批號：C0164），山羊抗小鼠 IgG HRP-conjugated和山羊抗兔IgG HRP-conjugated（北京康為世紀生物科技公司，批號：00051405、00081403）。

1.1.4 儀器

電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，型號：JY-ZY2和JY-CZ1），Image Analysis System（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司，型號：Smart Chemi?），超純水系統(tǒng)（美國波爾公司，型號：PURELAB PLUS），Eppendorf Centrifuge離心機（德國Eppendorf公司，型號：5417R），移液器（美國RAININ公司，型號：L-1000），分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司，型號：XPE504），Thermo超低溫冰箱（美國Thermo公司，型號：88000），微量進樣器（上海高鴿工貿(mào)有限公司），全自動酶標儀（美國BioTek公司，型號：ELX800）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、造模及給藥

Wistar大鼠隨機分為7組：對照組、假手術(shù)組、模型組、鎮(zhèn)肝熄風湯高、中、低劑量組（32、16、8 g·kg-1）和司來吉蘭組，每組15只。微量注射6-羥基多巴胺（6-Hydroxydopamine，6-OHDA）單側(cè)損毀大鼠黑質(zhì)，建立PD模型；在此基礎(chǔ)上，聯(lián)合附子湯（生藥2 g·kg-1）連續(xù)灌胃4周建立PD肝陽上亢病證結(jié)合模型。微量注射步驟為：1%戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1）腹腔注射麻醉和常規(guī)消毒，固定于立體定向儀，沿正中線切開大鼠顱頂皮膚，剝離骨膜，暴露前后囟；將前囟確定為0，按下列坐標將2 μL 6-OHDA（溶于含0.2%抗壞血酸的生理鹽水中，濃度為4 μg·μL-1）注射至右側(cè)黑質(zhì)致密部，即前囟后5.2 mm，正中線右側(cè)1.8 mm，硬膜下7.6 mm，假手術(shù)組注射2 μL生理鹽水（含0.2%抗壞血酸）。模型制備結(jié)束后，對照組和模型組（每日蒸餾水10 mL·kg-1），司來吉蘭組（每日0.9 mg·kg-1）、鎮(zhèn)肝熄風湯低劑量組（每日8 g·kg-1）、鎮(zhèn)肝熄風湯中劑量組（每日16 g·kg-1）、鎮(zhèn)肝熄風湯高劑量組（每日32 g·kg-1）大鼠連續(xù)灌胃用藥28天。

1.2.2 分光光度法檢測caspase-3活性

中腦組織剪碎，加入冰冷裂解液，勻漿、離心、取上清，按照碧波caspase-3活性分光光度法檢測試劑盒說明書檢測。

1.2.3 Western blot法檢測大鼠磷酸化Akt和GSK-3β水平

取大鼠中腦黑質(zhì)部位組織，蛋白提取試劑盒抽提組織漿蛋白，蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，加入抗p-Akt（1：500）或抗p-GSK-3β（1：1 000），4℃孵育過夜。TBST洗滌后加入辣根過氧化酶標記的二抗，室溫孵育2 h。TBST洗滌，將ECL顯影溶液加于膜上，用X線膠片曝光，磷酸化水平采用Alpha Ease FC圖像分析軟件進行分析。

1.2.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間差異采用單因素方差分析，兩兩比較用SNK檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 鎮(zhèn)肝熄風湯抑制PD肝陽上亢證模型大鼠中腦caspase-3活性

分光光度法檢測caspase-3活性結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，PD肝陽上亢證模型組大鼠中腦caspase-3活性明顯增加（P＜0.05），而鎮(zhèn)肝熄風湯高、中、低劑量組和司來吉蘭組中腦caspase-3活性明顯降低（P＜0.05）。與司來吉蘭組比較，鎮(zhèn)肝熄風湯高、中、低劑量組中腦caspase-3活性明顯降低（P＜0.05）。鎮(zhèn)肝熄風湯對PD肝陽上亢證模型大鼠中腦caspase-3活性影響見圖1。

2.2 鎮(zhèn)肝熄風湯促進PD肝陽上亢證模型大鼠中腦Akt磷酸化

Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠中腦磷酸化Akt水平升高（P＜0.05）。與模型組相比，鎮(zhèn)肝熄風湯低、中、高劑量組大鼠中腦磷酸化Akt明顯增加（P＜0.05），司來吉蘭組大鼠中腦磷酸化Akt水平未見明顯變化（P＞0.05）。鎮(zhèn)肝熄風湯對PD肝陽上亢證模型大鼠中腦Akt磷酸化水平的影響詳見圖2。

圖1 鎮(zhèn)肝熄風湯對各組大鼠中腦組織caspase-3活性的影響

圖2 鎮(zhèn)肝熄風湯對PD肝陽上亢證大鼠中腦Akt和GSK-3β磷酸化水平的影響

2.3 鎮(zhèn)肝熄風湯促進PD肝陽上亢證模型大鼠中腦GSK-3β（Ser9）的磷酸化

Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，PD肝陽上亢證模型組大鼠中腦組織p-GSK-3β（Ser9）水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組相比，鎮(zhèn)肝熄風湯低、中、高劑量組大鼠中腦p-GSK-3β（Ser9）明顯增加（P＜0.05）。與模型組相比，司來吉蘭組大鼠中腦p-GSK-3β（Ser9）水平未見明顯變化（P＞0.05）。鎮(zhèn)肝熄風湯對PD肝陽上亢證模型大鼠中腦GSK-3β磷酸化水平的影響詳見圖2。

3 討論

證候是中醫(yī)治療的核心，是中藥復方干預的對象。病證結(jié)合動物模型兼顧現(xiàn)代醫(yī)學疾病的病理特點和中醫(yī)證候特征，在證候生物學基礎(chǔ)未闡明的情況下，是中藥復方藥效和藥理研究的重要工具[7]。6-OHDA單側(cè)損毀PD模型是目前PD研究最常用的模型，與人類PD的病理、生化改變相似[8]。附子為辛、甘、大熱之品，灼傷肝腎之陰而發(fā)生肝陽上亢[9]。灌服附子湯聯(lián)合6-OHDA單側(cè)損毀的方法，從病和證兩方面綜合模擬PD肝陽上亢證模型，與單純PD模型和單純肝陽上亢證候模型相比，在研究鎮(zhèn)肝熄風湯治療PD的藥效評價方面更具特色和優(yōu)勢。本研究發(fā)現(xiàn)PD肝陽上亢證大鼠更易激惹，結(jié)膜充血的發(fā)生率也明顯增加。大鼠經(jīng)阿樸嗎啡誘導后，PD肝陽上亢證大鼠出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)行為，但正常大鼠未出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)行為，表明PD肝陽上亢證大鼠模型制備成功，詳細研究結(jié)果另文報道。

引起PD臨床病理癥狀的直接原因是黑質(zhì)紋狀體通路中的多巴胺（Dopamine，DA）含量大幅減少。黑質(zhì)和紋狀體多巴胺能神經(jīng)元進行性變性是導致多巴胺含量顯著降低的主要原因[10]。近年來，國內(nèi)外研究表明，細胞凋亡速度加快或異常是PD病理進程的重要環(huán)節(jié)[11]。如果對引起DA能神經(jīng)元凋亡的一系列鏈式事件中關(guān)鍵靶點進行干預，就有可能阻止DA能神經(jīng)元的缺失。因此，抗細胞凋亡策略是PD神經(jīng)保護性治療的新途徑。本實驗結(jié)果表明，外源性神經(jīng)毒素6-OHDA單側(cè)損毀黑質(zhì)聯(lián)合灌胃附子湯顯著增加了大鼠中腦caspase-3活性，說明細胞凋亡可能是PD肝陽上亢證大鼠的中腦DA能神經(jīng)遞質(zhì)減少的原因之一，在PD肝陽上亢證發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用。鎮(zhèn)肝熄風湯能顯著抑制了PD肝陽上亢證大鼠中腦caspase-3活性，緩解外源性神經(jīng)毒素聯(lián)合附子湯灌胃所致的中腦神經(jīng)元凋亡的發(fā)生。

Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細胞增殖、分化和抑制細胞凋亡方面起到重要作用。研究表明，Akt蛋白參與了多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生，如腦缺血和PD等[12]。在PD患者的黑質(zhì)Akt磷酸化水平顯著下降，多種神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)保護劑通過活化Akt激酶抑制黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡，發(fā)揮抗PD作用[13]。本實驗發(fā)現(xiàn)在外源性神經(jīng)毒素6-OHDA合并附子湯灌胃誘導的PD肝陽上亢證大鼠模型中，中腦磷酸化Akt水平升高，這與PD患者腦內(nèi)檢測到的磷酸化Akt耗竭的研究結(jié)果不一致，這種矛盾的結(jié)果需要進一步研究。而鎮(zhèn)肝熄風湯顯著增加了PD肝陽上亢證大鼠中腦磷酸化Akt水平，從而保護了6-OHDA單側(cè)損毀黑質(zhì)合并附子湯灌胃誘導的中腦神經(jīng)元凋亡。

GSK-3β也參與調(diào)節(jié)了神經(jīng)元凋亡，最近研究表明，GSK-3β與PD發(fā)生密切相關(guān)[14]。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶注射誘導的PD模型小鼠DA能神經(jīng)元中GSK-3β（Ser9）磷酸化水平降低，即GSK-3β活性增強，誘導了DA能神經(jīng)元凋亡[15]。Gong等研究發(fā)現(xiàn)，6-OHDA通過抑制Akt活性激活GSK-3β，進而誘導神經(jīng)細胞凋亡[16]，抑制GSK-3β活性，即促進GSK-3β磷酸化可以對6-OHDA誘導的神經(jīng)元損傷發(fā)揮保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)6-OHDA單側(cè)損毀黑質(zhì)聯(lián)合附子湯灌胃可使大鼠中腦GSK-3β活性降低，鎮(zhèn)肝熄風湯進一步抑制了PD肝陽上亢證大鼠中腦GSK-3β活性。值得指出的是，6-OHDA誘導了caspase-3活化，同時6-OHDA又促進了具有抗凋亡作用的Akt和p-GSK-3β磷酸化水平的升高，這種似乎矛盾的結(jié)果與Santra等研究結(jié)果相似[17]。這一現(xiàn)象的原因可能是6-OHDA誘導神經(jīng)元凋亡，而DA能神經(jīng)元為了抵抗這種損傷，促使機體代償性地提高了Akt磷酸化和GSK-3β（Ser9）磷酸化水平，以緩解6-OHDA誘導細胞凋亡。在6-OHDA單側(cè)損毀黑質(zhì)合并附子湯灌胃誘導PD肝陽上亢證模型中，鎮(zhèn)肝熄風湯介導的caspase-3活化與Akt磷酸化和GSK-3β（Ser9）磷酸化之間的關(guān)系，需要在GSK-3β基因敲除小鼠和野生型小鼠上做進一步的對比研究[18]。

綜上所述，鎮(zhèn)肝熄風湯對PD肝陽上亢證大鼠中腦神經(jīng)元凋亡具有抑制作用，其機制可能通過活化Akt（磷酸化）和失活GSK-3β（磷酸化），達到緩解PD肝陽上亢證的作用。這表明鎮(zhèn)肝熄風湯在治療PD方面具有較大的應(yīng)用潛力，但其分子機制仍需進一步深入研究。

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Effects of Zhengan Xifeng Decoction on the Phosphorylation of Akt and GSK-3β in the Midbrain in Rats with Parkinson’s Disease and the Syndrome of Liver-Yang Hyperactivity

Wang Xiaoli1, Sun Ying2, Zhu Lanqin2, Qi Yanqiu2, Zhang Lihua2, Zhang Hongyu2, Dong Miaoxian2
(1. Department of Traditional Chinese Medicine, Qiqihar Medical Univeristy, Qiqihar 161006, China;
2. Health Center, Qiqihar Medical Univeristy, Qiqihar 161006, China)

The aim of this study was to investigate the effects of Zhengan Xifeng decoction (ZGXFD) on the phosphorylation of Akt and its downstream target molecule GSK-3β in the midbrain of Parkinson’s disease (PD) rats with the syndrome of liver-yang hyperactivity. A total of 105 pathogen-free male Wistar rats were randomly divided into seven groups∶ the control group, the sham-operated group, the model group, the ZGXFD high-, medium- and low-dose groups and the selegiline group. Microinjection of 6-OHDA into substantia nigra and the intragastric administration of Fuzi decoction were given to establish the rat model of Parkinson’s disease with syndrome of liver-yang hyperactivity. The activity of caspase-3 was detected using spectrophotometry. The phosphorylation of Akt and GSK-3β in the midbrain was analyzed by western blot. It was found that the activity of caspase-3 in the midbrain was enhanced while the phosphorylation of Akt and GSK-3β was increased in the PD rats of the model group compared with the sham-operated group. The activity of caspase-3 in the midbrain was inhibited and the phosphorylation of Akt and GSK-3β was up-regulated in the ZGXFD groups. In conclusion, it was demonstrated that the anti-apoptotic effects of ZGXFD may activate the Akt and suppress of the activity of GSK-3β in the midbrain of PD rats with the syndrome of liver-yang hyperactivity.

Syndrome of liver-yang hyperactivity, Zhengan Xifeng decoction, Parkinson's disease, caspase-3, glycogen synthase kinase 3β

10.11842/wst.2016.08.022

R2-031

A

（責任編輯：朱黎婷，責任譯審：朱黎婷）

2016-04-14

修回日期：2016-05-20

＊ 國家自然科學基金委面上項目（81373629）：基于PI3K/Akt/GSK-3β信號通路的鎮(zhèn)肝熄風法抑制帕金森病氧化應(yīng)激損傷的機制研究，負責人：董妙先。

＊＊ 通訊作者：董妙先，主任醫(yī)師，主要研究方向：中藥藥理學研究。