沈　菁,雷曉明,宋　洋,譚　杏,劉　琴,戴麗雯,李文慧,郁　潔*（.湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，湖南長沙4008;.湖南中醫(yī)藥大學(xué)教務(wù)處，湖南長沙4008）

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電針內(nèi)關(guān)、百會穴對腦缺血/再灌注大鼠GRP78和Caspase-12基因表達的影響

沈菁1,雷曉明2,宋洋1,譚杏1,劉琴1,戴麗雯1,李文慧1,郁潔1*
（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，湖南長沙410208;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)教務(wù)處，湖南長沙410208）

〔摘要〕目的觀察電針內(nèi)關(guān)、百會穴對腦缺血/再灌注（Ischemia/Reperfusion，I/R）大鼠腦GRP78和Caspase-12基因表達的影響，探討針刺發(fā)揮腦保護作用是否與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路有關(guān)。方法100只大鼠隨機分為5組，每組20只，即正常組、假手術(shù)組、手術(shù)造模組、依達拉奉組和針刺干預(yù)組。采用線栓法建立大鼠大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）腦I/R模型。采用TUNEL染色法，檢測大鼠神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)；采用實時定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-Time polymerase chain reaction，RT-PCR），檢測GRP78、Caspase-12 mRNA表達。結(jié)果與正常組和假手術(shù)組相比，手術(shù)造模組、依達拉奉組和針刺干預(yù)組大鼠細胞凋亡指數(shù)升高，GRP78和Caspase-12 mRNA表達增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與手術(shù)造模組相比，依達拉奉組和針刺干預(yù)組大鼠細胞凋亡指數(shù)和Caspase-12 mRNA表達均明顯降低（P＜0.01），GRP78 mRNA表達明顯升高（P＜0.01）；與依達拉奉組相比，針刺干預(yù)組大鼠各項指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論針刺內(nèi)關(guān)、百會穴可以有效抑制腦缺血神經(jīng)元細胞凋亡，其保護機制可能上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激保護性GRP78表達，同時抑制促凋亡Caspase-12表達有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕細胞凋亡;電針;腦缺血/再灌注損傷;百會;內(nèi)關(guān);GRP78;Caspase-12

Effect of Electroacupuncture at Neiguan and Baihui Points on GRP78 and Caspase-12 Gene Expression in Rats with Ischemia-Reperfusion Injury

SHEN Jing1, LEI Xiaoming2, SONG Yang1, TAN Xing1, LIU Qin1, DAI Liwen1,
Li Wenhui1, YU Jie1*
（1. Acupuncture and Tuina Massage School, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410208, China；2. Academic Affairs Division, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410208, China）

〔Abstract〕Objective To observe the effects of electro-acupuncture（EA）at Neiguan and Baihui point on GRP78 and Caspase-12 gene expression in rats with ischemia/ reperfusion（IR）injury and investigate protective effects of acupuncture wheather related to endocytoplasmic reticulum（ER）stressapoptosis passage. Methods 100 rats were randomly assigned to five groups, 20 in each group: the normal group, sham-operation group, operation model group, edaravone group and EA group. The IR model of middle cerebral artery occlusion（MCAO）was established by suture embolic method. The apoptosis index of nerve cells in rats were measured by TUNEL staining method. The mRNA expression of GRP78 and Caspase-12 were measure by Real-time polymerase chain reaction（RT-PCR）. Results Compared with normal group and sham-operation group, the apoptosis indexes and mRNA expression of GRP78 and Caspase-12 in operation group, Edaravone group and EA group were increased, with statistical significance（P＜0.05 or P＜0.01）; Compared with operation model group, the apoptosis indexes and Caspase-12 mRNA expression in edaravone group and EA group were decreased（P＜0.01）, GRP78 mRNA expression were increased obviously（P＜0.01）; there were no significant difference between edaravone group and EA group on the above indexes（P＞0.05）. Conclusion Acupuncture at Neiguan and Baihui points could effectively suppress the nerve cell apoptosis in cerebral ischemia. The underlying mechanism might be related to upregulation of the ERS-protective GRP78 expression and inhibition of apoptosis-promotion Caspase-12 expression.

〔Keywords〕cell apoptosis, electroacupuncture, cerebral ischemia/reperfusion injury, Baihui point; Neiguan point; GRP78, Caspase-12

近年來有關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)凋亡通路的研究受到廣泛關(guān)注，已發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與許多疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，比如糖尿病、腫瘤等。在這種形勢下，明確內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與腦缺血/再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）損傷的關(guān)系顯得十分必要。本研究通過觀察電針對腦I/R大鼠GRP78和Caspase-12基因表達的影響,探討針刺腦保護作用與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路的關(guān)系，力求為臨床針刺治療中風(fēng)提供一定實驗基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1動物分組

10～12周健康雄性清潔級SD大鼠100只，體質(zhì)量230～250 g（由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：湘醫(yī)動字20-002）。所有大鼠隨機分為3組，即正常對照組（A組）20只、假手術(shù)組（B組）20只、造模組60只。造模組成功后的大鼠隨機分為手術(shù)造模組（C組）20只、依達拉奉組（D組）20只和針刺干預(yù)組（E組）20只。

1.2主要儀器與試劑

DK-8D型電熱恒溫水槽（上海森信實驗儀器有限公司）；DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（上海琪特分析儀器有限公司）；H6-1微型電泳槽（上海精益有機玻璃制品儀器廠）；Rotor-Gene3000 Rea1timePCR儀、引物設(shè)計軟件Primer5.0、Rotor-gene6.0（CorbettReseareh）等。

TRIZOL試劑（上海生工生物工程有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)RT-PCR試劑盒（上海生工生物工程有限公司）；MMLV反轉(zhuǎn)錄酶、10×RT緩沖液（Epicentre）；2.5 mM dNTP混合液（HyTest Ltd）；Oligo（dT）18、瓊脂糖、溴化乙錠（EB）（上海生工生物工程有限公司）；DEPC（焦炭酸二乙基酯）、氯仿、異丙醇（上?；瘜W(xué)試劑有限公司）等。

1.3模型制備

參考Longa等[1]報道的線栓法制備局灶性大腦中動脈腦缺血（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。動物用10%水合氯醛（35 mg/kg）腹腔注射麻醉。仰臥位固定，依次分離左側(cè)頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內(nèi)動脈（ICA）。在距ECA分叉部4 mm處剪一小口，將拴線插入深度約18 mm。手術(shù)后2 h將栓線拔出。手術(shù)過程中及術(shù)后大鼠蘇醒前予以燈照保暖。假手術(shù)組插入深度為8～10 mm，其余操作同手術(shù)組。根據(jù)神經(jīng)功能缺損評分法[2]，于針刺干預(yù)組大鼠蘇醒后即刻對所有大鼠進行評分，滿分為11分，分?jǐn)?shù)越高，說明動物行為障礙越嚴(yán)重。凡造模手術(shù)中動物死亡、蛛網(wǎng)膜下腔出血或無對側(cè)偏癱體征均視為手術(shù)造模失敗。

1.4依達拉奉注射方法

取10 mg依達拉奉注射液（商品名：必存，批號：H20031342，規(guī)格：10 mg/5 mL）以5 mL生理鹽水稀釋，配制成l mg/mL的濃度。依達拉奉組大鼠在腦I/R即刻一次性予尾靜脈注射依達拉奉3 mg/kg。手術(shù)造模組在同一時刻給予注射等量生理鹽水。

1.5穴位定位與針刺方法

根據(jù)新世紀(jì)全國高等中醫(yī)藥院校規(guī)劃教材《實驗針灸學(xué)》[3]大鼠針灸穴位定位方法及擬人比照法定位。內(nèi)關(guān)穴位于前肢內(nèi)側(cè)，距腕關(guān)節(jié)上3 mm左右的尺橈骨間，直刺2 mm；百會穴位于頂骨正中，向前沿皮斜刺2 mm。以醫(yī)用10 mm、28號毫針刺入穴位，于針柄處接華佗牌SDZ-Ⅱ型電針治療儀。疏密波（疏波10 Hz，密波50 Hz），第一對電極負(fù)極接左側(cè)內(nèi)關(guān)穴，第二對電極負(fù)極接百會穴，正極均接鼠尾。強度以鼠尾輕顫為度，刺激時間30 min。

1.6實驗步驟

第1天：正常對照組大鼠捆綁約30 min；假手術(shù)組大鼠行假手術(shù)，待大鼠清醒并評分后注射生理鹽水；手術(shù)造模組大鼠造模，待大鼠清醒并評分后注射生理鹽水；依達拉奉組大鼠造模，待大鼠清醒并評分后注射依達拉奉；針刺干預(yù)組大鼠造模，待大鼠清醒并評分后予以針刺干預(yù)。第2～4天：針刺干預(yù)組大鼠針刺干預(yù)，其余各組捆綁約30 min。

處理完畢后，全部大鼠用10%水合氯醛進行深度麻醉，每組取10只大鼠沿胸骨旁線剪開胸腹腔，剪開右心耳生理鹽水沖洗至肝臟變白、右心耳流出的液體清亮后灌注4%多聚甲醛約300 mL至大鼠四肢強直僵硬后停止灌注。剝離腦組織，取視交叉后2 mm腦組織，4%多聚甲醛固定過夜，制作腦組織蠟塊，4℃保存，以備檢測細胞凋亡指數(shù)（apoplosis index，AI）；每組另10只大鼠麻醉后斷頭取腦組織。切取缺血側(cè)頂葉大腦皮質(zhì)約100 mg（冠狀面距額極7～11 mm，扇形分出缺血半暗帶，即大腦縱裂到大腦外側(cè)溝皮層上1/3），迅速放入已編號的凍存管中，液氮中保存，以備RT-PCR檢測。

1.7觀察指標(biāo)及檢測方法

1.7.1細胞凋亡指數(shù)（AI）TUNEL染色法。具體步驟按試劑盒說明書進行。

凋亡細胞核呈棕黃色或棕褐色。測定部位為頂葉缺血區(qū)周圍，每個標(biāo)本在高倍鏡（×400）下隨機觀察梗死灶周邊區(qū)域5個不重疊的視野，計算不同視野的凋亡陽性細胞數(shù)百分比，取平均值作統(tǒng)計。正常對照組和假手術(shù)組取腦相應(yīng)部位觀察。

1.7.2GRP78和Caspase-12基因表達RT-PCR檢測。

（1）引物設(shè)計：GRP78、Caspase-12引物由上海生工生物公司合成。各引物序列、產(chǎn)物長度、PCR反應(yīng)的退火溫度見表1。

表1　引物序列

（2）結(jié)果與計算：各樣品的目的基因和管家基因分別進行Realtime PCR反應(yīng)。根據(jù)繪制的梯度稀釋DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線，各樣品目的基因和管家基因的濃度結(jié)果直接由機器生成。每個樣品的目的基因濃度除以其管家基因的濃度，即為此樣品此基因的校正后的相對含量。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)使用SPSS17 for Windows軟件進行處理。數(shù)據(jù)用“±s”表示，各指標(biāo)5組計量資料均采用單因素方差分析，細胞凋亡指數(shù)方差齊性檢驗顯示方差不齊，兩兩比較采用Tamhane's T2法；GRP78和Caspase-12表達方差齊性檢驗顯示方差齊，兩兩比較采用LSD法。

2　結(jié)果與分析

2.1電針百會、內(nèi)關(guān)穴對I/R大鼠腦神經(jīng)元AI的影響

與正常對照組比較，假手術(shù)組大鼠腦神經(jīng)元AI無明顯變化（P＞0.05）。與正常對照組和假手術(shù)組比較，手術(shù)造模組、依達拉奉組和針刺干預(yù)組大鼠AI明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與手術(shù)造模組比較，依達拉奉組和針刺干預(yù)組大鼠AI明顯降低（P＜0.01）。針刺干預(yù)組與依達拉奉組比較差異不明顯（P＞0.05）。見表2。

圖1所示，藍色為正常細胞，紅色為凋亡細胞。正常對照組與假手術(shù)組可見少量凋亡細胞，手術(shù)造模組可見大量凋亡細胞，依達拉奉組與針刺干預(yù)組凋亡細胞數(shù)量較造模組減少。

表2　電針對I/R大鼠腦神經(jīng)元AI的影響?。ā纒）

表2　電針對I/R大鼠腦神經(jīng)元AI的影響?。ā纒）

注：與正常對照組相比，**P＜0.01；與假手術(shù)組相比，▲▲P＜0.01；與手術(shù)造模組相比，＃＃P＜0.01。

組別正常對照組假手術(shù)組手術(shù)造模組依達拉奉組針刺干預(yù)組F n 10 10 10 10 10 AI（%）6.12±0.93 5.88±1.48 41.79±4.99**▲▲30.08±2.93**▲▲＃＃32.78±4.07**▲▲＃＃253.535

A.正常對照組；B.假手術(shù)組；C.手術(shù)造模組；D.依達拉奉組；E.針刺干預(yù)組圖1　各組大鼠腦神經(jīng)元細胞凋亡光鏡觀察圖（×400）

2.2電針百會、內(nèi)關(guān)穴對I/R大鼠腦GRP78和Caspas-12基因表達的影響

與正常對照組比較，假手術(shù)組大鼠腦GRP78 和Caspase-12 mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與正常對照組和假手術(shù)組比較，手術(shù)造模組、依達拉奉組和針刺干預(yù)組大鼠GRP78和Caspase-12 mRNA表達均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。與手術(shù)造模組相比，依達拉奉組和針刺干預(yù)組大鼠GRP78 mRNA表達顯著增加（P＜0.01），同時Caspase-12 mRNA表達明顯減少（P＜0.01）。與依達拉奉組比較，針刺干預(yù)組大鼠GRP78和Caspase-12 mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表2　電針對I/R大鼠腦GRP78和Caspase-12基因表達的影響?。╪＝10，±s）

表2　電針對I/R大鼠腦GRP78和Caspase-12基因表達的影響?。╪＝10，±s）

注：與正常對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與假手術(shù)組相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與手術(shù)造模組相比，＃＃P＜0.01。

組別正常對照組假手術(shù)組手術(shù)造模組依達拉奉組針刺干預(yù)組F GRP78 mRNA 10.697±1.613 10.881±1.447 13.471±1.657**▲▲17.472±1.663**▲▲＃＃16.780±1.698**▲▲＃＃38.758 Caspases-12 mRNA 0.263±0.075 0.278±0.072 0.623±0.104**▲▲0.356±0.055*▲＃＃0.384±0.087**▲▲＃＃32.449

3　討論

腦血管病屬于祖國醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”病的范疇，臨床上以突然昏仆、半身不遂、口舌歪斜等為主癥的一種病證，與西醫(yī)所稱的腦血管病相似。缺血性中風(fēng)病急性期以標(biāo)實為主，而標(biāo)實又以血瘀為本。針刺治療中風(fēng)病是行之有效的治療方法之一[4-6]，故本實驗以通經(jīng)絡(luò)、行氣血、開腦竅為其針刺大法，選取百會、內(nèi)關(guān)二穴。百會穴位于巔頂，屬于督脈，是督脈、足太陽膀胱經(jīng)、手少陽三焦經(jīng)、足少陽膽經(jīng)、足厥陰肝經(jīng)的交會處，督脈由此入于腦，任、督、沖三脈同出一源，故針刺百會可調(diào)陰陽、熄肝風(fēng)、填精補髓、益氣養(yǎng)血、醒神開竅。內(nèi)關(guān)為手厥陰心包經(jīng)絡(luò)穴，有寧心定志、調(diào)理三焦氣機之功，同時是八脈交會穴之一，通過陰維脈主一身之里，調(diào)節(jié)周身陰氣。二穴一主陽，一主陰，共奏開竅醒神、活血去風(fēng)之功效，對中風(fēng)疾病具有較好的效果。

腦I/R損傷使腦神經(jīng)元內(nèi)外環(huán)境產(chǎn)生缺氧、缺血變化，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。一方面開啟自我保護性途徑，GRP78代償性增多。GRP78被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）的經(jīng)典標(biāo)志物，GRP78的上調(diào)表達對于ERS引起的神經(jīng)元細胞有保護作用[7]，又可以間接抑制Caspase-12表達，阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡。另一方面，過長過久的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，可以直接激活Caspase-12。Caspase-12是ERS導(dǎo)致凋亡的特異性介質(zhì)。Caspase-12缺陷鼠能抵抗ERS引起的凋亡，而與非ERS介導(dǎo)的凋亡無關(guān)[8]。有研究表明，局部腦缺血和全腦缺血均引起GRP78/ BIP表達的被上調(diào)[9-10]。Hayashi等[11]研究亦發(fā)現(xiàn)，缺血預(yù)處理可以誘導(dǎo)GRP78表達上調(diào)抑制神經(jīng)細胞的凋亡，從而起到腦細胞的保護作用。caspase-12其表達上調(diào)在腦I/R動物模型中發(fā)現(xiàn)，而且，隨著缺血再灌注時間的延長，保護性因子GRP78的活性被caspase-12抑制[12]。另外發(fā)現(xiàn)，caspase-12基因敲除的小鼠無明顯的發(fā)育或行為缺陷[13]，可明顯阻抑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化應(yīng)激引起的凋亡，說明通過caspase-12的阻斷來阻抑ERS介導(dǎo)的凋亡有效。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)：模型組大鼠腦I/R損傷，啟動ERS，一方面GRP78mRNA表達代償升高，進行腦組織保護；同時Caspase-12mRNA表達顯著增加，啟動促細胞凋亡途徑，AI明顯升高。針刺干預(yù)組在大鼠腦I/R損傷一開始，就進行針刺百會穴和內(nèi)關(guān)穴干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與模型組相比，GRP78mRNA表達進一步明顯增加；同時Caspase-12mRNA表達均顯著降低，AI明顯下降。

綜上所述，針刺內(nèi)關(guān)、百會穴可以有效抑制腦神經(jīng)元細胞凋亡，其途徑可能是通過激活ERS產(chǎn)生的。針刺發(fā)揮腦保護的內(nèi)在機制可能與一方面上調(diào)GRP78表達，另一方面抑制Caspase-12表達有關(guān)。

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（本文編輯匡靜之）

〔通訊作者〕*郁潔，女，碩士研究生導(dǎo)師，副教授，E-mail：47060463@qq.com。

〔作者簡介〕沈菁，女，醫(yī)學(xué)博士，講師，研究方向：針灸治病機制的研究。

〔基金項目〕國家自然科學(xué)基金青年項目（81202771）;教育部新教師類項目（20114323120005）;針灸推拿湖南省重點學(xué)科資助。

〔收稿日期〕2015-08-24

〔中圖分類號〕R245.3

〔文獻標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕

doi:10.3969/j.issn.1674-070X.2016.02.015