纖維素高效降解菌群構(gòu)建及產(chǎn)酶底物優(yōu)化

李文哲，朱巧銀，范金霞，丁清華，李　翯（東北農(nóng)業(yè)大學工程學院，哈爾濱　150030）

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纖維素高效降解菌群構(gòu)建及產(chǎn)酶底物優(yōu)化

李文哲，朱巧銀，范金霞，丁清華，李翯
（東北農(nóng)業(yè)大學工程學院，哈爾濱150030）

摘要：為促進堆肥腐熟、縮短堆肥周期，通過平板初篩及酶活測定，從腐爛竹子、玉米秸稈中獲得4株酶活性較高纖維素降解菌并混合培養(yǎng)，得到理想組合Cro-2/Bam-Q/Bam-3/Bam-1，其內(nèi)切葡聚糖酶（CX）、外切葡糖酶（C1）、β-外切葡萄糖苷酶（CB）及纖維素全酶（FPA）活性分別為12.54、14.65、7.71、11.98 U，均高于單一菌株酶活性。對混合菌群產(chǎn)酶底物優(yōu)化結(jié)果表明，當沼渣與水稻秸稈1∶1混合，麩皮為氮源時，可有效提高混合菌群產(chǎn)酶活性。

關鍵詞：沼渣；纖維素降解菌；酶活；混合菌群

李文哲,朱巧銀,范金霞,等.纖維素高效降解菌群構(gòu)建及產(chǎn)酶底物優(yōu)化[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報, 2016, 47(1): 81-86. Li Wenzhe, Zhu Qiaoyin, Fan Jinxia, et al. Construction of microbial community with high cellulose-degrading capacity and optimization of fermentation substrate[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2016, 47(1): 81-86. (in Chinese with English abstract)

農(nóng)作物秸稈纖維素含量高，纖維素分子質(zhì)量大，一般由1 400~10 000個葡萄糖分子組成，呈直線排列，分子間以牢固化學健連接，性質(zhì)穩(wěn)定，實際應用中難于降解。因此，篩選纖維素降解能力高菌株，提高纖維素酶產(chǎn)生菌產(chǎn)酶活性，實現(xiàn)木質(zhì)纖維素類物質(zhì)快速降解受到關注[1-4]。目前纖維素分解菌研究廣泛，微生物主要以真菌及部分細菌為主[5-7]。

本研究提出采用沼渣液與農(nóng)作物秸稈混合堆肥，既可解決沼液沼渣肥料化，又可避免沼氣工程排放沼渣液造成二次污染。通過平板初篩從腐爛竹子、玉米秸稈中篩選出纖維素降解真菌，通過測定纖維素酶活方法復篩，將獲得降解纖維素能力較強菌株混合培養(yǎng)，構(gòu)建纖維素產(chǎn)酶活性較強混合菌群，并優(yōu)化發(fā)酵底物。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源

腐爛竹子、玉米秸稈。

1.1.2沼渣及作物秸稈

沼渣取自東北農(nóng)業(yè)大學工程學院沼氣中試實驗室，為牛糞厭氧發(fā)酵剩余物。5 000 r·min-1離心3 min，去除上清液將沉淀物45℃下低溫烘干，烘干后粉碎過0.2 mm篩。玉米秸稈、水稻秸稈取自本校試驗田，自然風干，粉碎過0.2 mm篩。

1.2培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：1.4 g（NH4）2SO4，2.0 g KH2PO4，0.3 g MgSO4·7H2O，0.3 g CaCl2，1 g沼渣，加入1 L蒸餾水。

分離培養(yǎng)基：PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂）稱取26.0 g，溶解于1 000 mL蒸餾水中，加熱使之完全溶解，分裝，121℃高壓滅菌15 min備用。

種子液培養(yǎng)基：PD（馬鈴薯葡萄糖水）稱取38.0 g，加入1 000 mL蒸餾水中，分裝于150 mL三角瓶，121℃高壓滅菌20 min待用。

Mandels營養(yǎng)液：1.4 g（NH4）2SO4，2 g KH2PO4，0.3 g尿素，0.3 g MgSO4·7H2O，0.3 g CaCl2溶于1 L蒸餾水。

液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基：50 mL Madels營養(yǎng)液中加入1 g沼渣，121℃滅菌20 min。

固體產(chǎn)酶培養(yǎng)基：4 g沼渣，加入10 mL Madels營養(yǎng)液，121℃，滅菌20 min。

1.3方法

1.3.1菌種富集

稱量腐爛玉米秸稈、竹子各10.0 g，置于200 mL富集培養(yǎng)基中，28℃，120 r·min-1恒溫培養(yǎng)7 d，吸取10 mL培養(yǎng)液加入新富集培養(yǎng)基中，連續(xù)富集3代。

1.3.2菌株初篩

將富集3代后培養(yǎng)液接種在PDA培養(yǎng)基上分離純化，28℃恒溫培養(yǎng)3~5 d，得到不同單個真菌菌落，再接種到斜面培養(yǎng)基中保存。

1.3.3纖維素酶活性測定

采用DNS法測定纖維素酶活性，纖維素酶活力單位定義為55℃、pH 5.0條件下，以每分鐘催化底物水解生成1 μmol葡萄糖糖所需酶量定義為一個酶活力單位U。

1.3.3.1酶液制備

按5%接種比例，將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃、120 r·min-1培養(yǎng)4 d。

液體培養(yǎng)：將發(fā)酵液移入離心管中，3 000 r·min-1離心10 min，取上清液作為酶液。

固體培養(yǎng)：發(fā)酵結(jié)束后，加入30 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5.0），25℃恒溫震蕩30 min，剩余步驟與液體培養(yǎng)相同。

1.3.3.2酶活性測定

①內(nèi)切型葡聚糖酶（Cx）[8]：以1.5 mL 0.5%用0.2 mol·L-1pH 5.0乙酸-乙酸鈉緩沖液配制CMCNa為底物，加入1 mL酶液，55℃水浴保溫30 min，加2.5 mL DNS終止反應，搖勻，沸水浴10 min，冷水浴10 min，用蒸餾水稀釋到適合濃度，混勻在540 nm下測定吸光度。2.5 mL DNS加1.5 mL蒸餾水作空白對照。

②外切型葡聚糖酶（C1）[9]：以1.5 mL 0.5%用0.2 mol·L-1pH 5.0乙酸-乙酸鈉緩沖液配制微晶纖維素為底物，55℃保溫60 min，其余同CMCase。

③β-葡萄糖苷酶活（CB）[10]：以1.5 mL 0.5%用0.2 mol·L-1pH 5.0乙酸-乙酸鈉緩沖液配制水楊素為底物，其余同Cx。

④濾紙酶活（FPA）[11]：將50 mg濾紙浸入1.5 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液中，后加入1 mL酶液，50℃水浴條件下反應60 min，加入2.5 mL DNS試劑終止反應，沸水浴10 min，冷水浴10 min，用蒸餾水稀釋到適合濃度，混勻在540 nm下測定吸光度。用2.5 mL DNS加1.5 mL蒸餾水作空白對照。

按如下公式計算纖維素酶活力。

纖維素酶活力（U·g-1）=r×Df×1 000/180v/t

式中，r-通過OD540值從標準曲線上查得與葡萄糖標準溶液相對應濃度（μg·mL-1）；v-反應酶液體積；t-反應時間；Df-稀釋倍數(shù)。

1.3.4菌株復篩

將初篩得到菌株接種到PD培養(yǎng)基中，28℃、120 r·min-1恒溫培養(yǎng)96 h獲得種子液，按照5%接種量接種到液體培養(yǎng)基中，28℃、120 r·min-1恒溫培養(yǎng)96 h，分別測定Cx酶活、C1酶活、CB酶活及FPA酶活，篩選出產(chǎn)酶活性較高菌株。

1.3.5菌株混合培養(yǎng)

將復篩獲得產(chǎn)酶活性較高菌株混合培養(yǎng)，各組合中菌株均按照1∶1比例分別接種于液體和固體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，通過測定Cx酶活、C1酶活、CB酶活及FPA酶活優(yōu)選出產(chǎn)酶活性最高混合菌群及適宜培養(yǎng)基。

1.3.5.1高效降解纖維素菌群優(yōu)選

將復篩獲得產(chǎn)酶活性較高株真菌均按照1∶1混合培養(yǎng)，得到9種組合方案：1（Cro-2/Bam-Q/ Bam-3/Bam-1）；2（Cro-2、Bam-Q、Bam-3）；3 （Bam-Q、Bam-3、Bam-1）；4（Cro-2、Bam-3、Bam-1）；5（Cro-2、Bam-Q）6（Bam-Q、Bam-3）；7（Bam-3、Bam-1）；8（Cro-2、Bam-3）；9 （Cro-2、Bam-1）。將以上9種組合分別接種到液體、固體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)，25℃、120 r·min-1恒溫培養(yǎng)4 d；固體培養(yǎng)，25℃恒溫培養(yǎng)4 d，搖動1次·d-1，測定酶活。

1.3.5.2氮源優(yōu)選

去除Mandels營養(yǎng)液中含氮試劑，分別向培養(yǎng)基中加入0.4 g麩皮、豆粕、玉米粉、黃豆粉、尿素、硝酸銨、硫酸銨、硝酸鈉作為氮源，25℃恒溫培養(yǎng)4 d，搖動2~3次·d-1，發(fā)酵結(jié)束后測定酶活。

2結(jié)果與分析

2.1菌株初篩

將腐爛玉米秸稈、竹子在富集培養(yǎng)基中連續(xù)富集3代，再通過PDA培養(yǎng)基分離純化，共得到真菌11株，將其接種到斜面培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)96 h，保存于4℃冰箱中。

2.2菌株復篩

纖維素酶是纖維素水解酶總稱[12-14]，研究表明，纖維素酶為內(nèi)切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶組成。濾紙酶活表征纖維素酶系總酶活力，反映各組分酶協(xié)同作用[15]。

本研究通過測定以上4種酶活性，作為優(yōu)選降解纖維能力較強菌株依據(jù)。將分離所得11株真菌接種到液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4 d后測定酶活，結(jié)果見表1。

表1不同菌株酶活力測定結(jié)果Table1 Result of enzyme activity of different strains　(U)

由表1可知，Bam-Q和Bam-3 CX酶活性較高；Bam-3 C1酶活最高，Bam-1和Bam-6次之；Cro-2 CB酶活性最高，Bam-3略低于Cro-2；綜合酶活性Bam-1最高。經(jīng)4種不同纖維素酶活性綜合評定Cro-2、Bom-Q、Bom-3、Bom-1為纖維素降解降解能力較高菌株。

由表1可知，不同菌株同種纖維素酶活不同，而同菌株不同纖維素酶活存在差異性。因此，提高菌株對纖維素降解能力需各種酶協(xié)同作用，這也是單一菌株降解纖維素效率較低主要原因[16]。

2.3高效降解纖維素菌群優(yōu)選

發(fā)酵結(jié)束后，各組合酶活性測定結(jié)果見表2~3。

表2不同混合菌群酶活性Table 2 Enzyme activity of different cellulose-degrading strains (U)

表3單一菌株與混合菌群酶活性比較Table 3 Comparison of the enzyme activity of cellulose-degrading strains and combination (U)

由表2~3可知，液體或固體培養(yǎng)基中，當Cro-2、Bam-Q、Bam-3、Bam-1四株真菌按照1∶1∶1∶1比例時，4種纖維素酶活性均最高，且均高于單一菌種產(chǎn)酶活性。原因是：組合培養(yǎng)能利用不同菌株不同作用效果差異互補，酶系比例協(xié)調(diào)，提高發(fā)液體培養(yǎng)產(chǎn)酶能力[17]。Bam-Q和Bam-3單獨培養(yǎng)時，酶活性較高，但將其混合培養(yǎng)，在所有組合中酶活性最低，酶活大幅低于其單獨培養(yǎng)，可能是由于Bam-Q和Bam-3混合培養(yǎng)時，產(chǎn)生拮抗作用，抑制產(chǎn)酶。對于同一種組合液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)，固體培養(yǎng)產(chǎn)酶活性高于液體培養(yǎng)。這是由于固體培養(yǎng)營養(yǎng)物質(zhì)濃度高，碳源、氮源及沼渣中含有微生物生長所需微量元素充足，促進菌株生長繁殖，提高產(chǎn)酶量。

2.4碳源優(yōu)選

將沼渣、玉米秸稈、水稻秸稈單一及按1∶1比例混合作為發(fā)酵底物，將Cro-2、Bam-Q、Bam-3、Bam-1按1∶1∶1∶1比例接種于固體培養(yǎng)基，研究不同底物對混合菌群產(chǎn)酶影響。纖維素酶活性測定結(jié)果見表4。

表4不同碳源對產(chǎn)酶影響Table 4 Effect of various carbon source on cellulase production (U)

纖維素酶是誘導酶，底物不同微生物產(chǎn)纖維素酶活性不同[18]。農(nóng)作物秸稈及沼渣中含有大量纖維素，對纖維素酶產(chǎn)生誘導作用。碳源在微生物繁殖過程中起決定性作用，碳源在滿足微生物生長及產(chǎn)酶條件下，才能產(chǎn)生更多纖維素酶，促進纖維素分解。由表4可知，當采用單一碳源發(fā)酵時，沼渣作為碳源CX酶活性最高，玉米秸稈作為碳源CB酶活性最高，水稻秸稈C1與FPA酶活性均最高。這是由于不同碳源誘導作用不同，同一種碳源不同纖維酶活性不同，不同碳源同一種纖維

素酶活性存在差異。當沼渣與水稻秸稈1∶1混合時，4種纖維素酶活均最高。

2.5氮源優(yōu)選

發(fā)酵結(jié)束后測定酶活結(jié)果見表5。

氮源種類和性質(zhì)是影響酶活力和產(chǎn)量重要因素，氮源通過影響酶蛋白前體形成，調(diào)控酶合成[19]。本試驗采用4種有機氮源和4種無機氮源研究其對酶活力影響。由表5可知，麩皮作為氮源時，CX、CB、FPA酶活性均最高，黃豆粉作為氮源時，C1酶活最高。

表5不同氮源對產(chǎn)酶影響Table 5 Effect of different nitrogen source on cellulase production (U)

3討論

牛糞厭氧發(fā)酵剩余物主要成分是纖維素，沼渣與玉米秸稈混合堆肥，纖維素含量較高，制約堆肥腐熟。添加纖維素降解能力較強的微生物菌劑可促進纖維素降解，加快堆肥進程。但纖維素結(jié)構(gòu)復雜，纖維素降解須由多種酶協(xié)同完成，單一菌種對纖維素降解效果不理想，通過四株菌組合培養(yǎng)，獲得高效混合菌群，其Cx、C1、CB、FPA酶活與單一菌種比較均有提高。

碳源和氮源對微生物產(chǎn)酶活性影響顯著。本試驗采用玉米秸稈、水稻秸稈和沼渣為碳源，作物秸稈纖維素含量是制約堆肥腐熟主要因素，而沼渣中營養(yǎng)成分豐富，包含大量微生物生長重要營養(yǎng)元素。使用單一碳源時，產(chǎn)酶活性沼渣>水稻秸稈>玉米秸稈，將沼渣分別與水稻秸稈、玉米秸稈按1∶1混合添加到培養(yǎng)基中，以水稻秸稈與沼渣按照1∶1混合時，產(chǎn)酶活性提高，可能因沼渣與玉米秸稈按1∶1混合所含營養(yǎng)成分適合B混合菌群生長且含有適合菌群產(chǎn)酶因子。

氮源優(yōu)選酶活性測定結(jié)果表明，不同氮源對不同纖維素酶活表現(xiàn)產(chǎn)酶活性差異顯著，同種氮源，對不同纖維素酶酶活性影響差異顯著。有機氮源產(chǎn)酶活性優(yōu)于無機氮源，原因是有機氮成分復雜，能為微生物生長提供氮源，包含糖類、淀粉等易分解有機物和氨基酸、微量元素等微生物生長所需營養(yǎng)成分，在發(fā)酵初期，促進菌株生長與繁殖。

4結(jié)論

a.從腐爛竹子和玉米秸稈中分離出11株產(chǎn)纖維素酶真菌，通過酶活性測定，篩選出Cro-2、Bam-Q、Bam-3、Bam-1 4株降解纖維素能力較強菌株。

b.將4株菌株組合培養(yǎng)，通過酶活性比較綜合評定，獲得產(chǎn)酶活性最高混合菌群，Cro-2、Bam-Q、Bam-3、Bam-1按1∶1∶1∶1混合。

c.將混合菌群接種到以沼渣和水稻秸稈按1∶1混合，麩皮作為氮源發(fā)酵底物培養(yǎng)基中，產(chǎn)酶活性得到有效提高，CX、C1、β-Gase、FPA酶活性分別為19.42、13.93、7.83、18.44 U。

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Construction of microbial community with high cellulose-degrading capacity and optimization of fermentation substrate

LI Wenzhe, ZHU Qiaoyin, FAN Jinxia, DING Qinghua, LI He(School of Engineering, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Abstract:In order to promote maturity of the compost, shorten the composting period, therefore, four strains with high cellulose degradation capacity were isolated from rotten bamboo and corn straw. The strains were mixed cultivation, the results showed that Cro-2/Bam-Q/Bam-3/Bam-1were the best community. And the highest activity of Cx, C1, CB and FPA of community was12.54, 14.65, 7.71, 11.98 U, respectively, all the findings illustrated that the cellulose degradation capacity of community was more effective than any single strain. Studied effect of various fermentation substrates on cellulase production which was showed when the renewal was mixed with rice straw 1:1, bran as nitrogen source, could effectively improve the mixture producing enzyme activity.

Key words:biogas residue; cellulose-degrading microorganism; enzyme activity; microbial community

作者簡介：李文哲（1955-），男，教授，博士，研究方向為生物質(zhì)轉(zhuǎn)化及利用。E-mail: liwenzhe9@163.com

基金項目：“十二五”國家科技支撐計劃資助項目（2011BAD15B04）

收稿日期：2015-04-19

中圖分類號：S182

文獻標志碼：A

文章編號：1005-9369（2016）01-0081-06