薛　潔， 宋曉青， 邢　婧， 戰(zhàn)文斌

(中國海洋大學(xué)水產(chǎn)動物病害與免疫學(xué)研究室，山東 青島 266003)

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牙鲆注射免疫鰻弧菌滅活疫苗后13種免疫相關(guān)基因表達的變化?

薛潔， 宋曉青， 邢婧??， 戰(zhàn)文斌

(中國海洋大學(xué)水產(chǎn)動物病害與免疫學(xué)研究室，山東 青島 266003)

摘要：為制備鰻弧菌(Vibrio anguillarum)全菌滅活疫苗，采用腹腔注射的方式免疫牙鲆(Paralichthys olivaceus)。于免疫后0、4、8、12、24、48、72、96 h和7、14 d取脾、頭腎、鰓組織，提取mRNA，應(yīng)用實時熒光定量PCR法檢測3個組織中Toll-like受體(TLR)2、TLR5M、髓樣分化因子MyD88、核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB、白介素(IL)-6、干擾素(IFN)γ、趨化因子CXC、補體C3、C型溶菌酶(C-Lyz)、熱休克蛋白(Hsp)-70、主要組織相容性復(fù)合體MHC II、T細胞表面受體CD4和膜結(jié)合型免疫球蛋白(mIg)D這13種免疫相關(guān)基因的表達。研究顯示：注射免疫后，3個組織中，除了mIgD和TLR5M基因，其余11種基因與對照組相比均呈上調(diào)表達，上調(diào)表達高峰均在12～72 h，基因表達量最高值是對照組的2～30倍；mIgD基因的表達顯著下調(diào)或無顯著差異，基因表達量最低值出現(xiàn)在8～12 h，最低值是對照組的0.02～0.2倍；TLR5M基因的表達無顯著變化。在頭腎和脾臟組織中，除了TLR5M、CXC、C-Lyz和mIgD 4個基因其余9個基因的表達量顯著高于鰓組織，且表達量最大值的出現(xiàn)時間均早于鰓組織。研究結(jié)果表明：腹腔注射免疫鰻弧菌全菌滅活疫苗能引起牙鲆脾臟、頭腎和鰓免疫相關(guān)基因的快速變化。脾臟、頭腎中基因的表達量大多顯著高于鰓組織，且表達高峰值的出現(xiàn)早于鰓組織。注射免疫后，脾臟或頭腎組織中TLR2、NF-κB和IL-6基因的表達量上調(diào)較快、較高，可作為注射免疫鰻弧菌全菌滅活疫苗效果的主要評價指標。本研究為牙鲆疫苗免疫效果的評價提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：牙鲆；鰻弧菌；滅活疫苗；注射免疫；免疫相關(guān)基因

XUE Jie, SONG Xiao-Qing, XING Jing, et al. Expression analysis of thirteen immune related genes of flounder (Paralichthys olivaceus) vaccinated with formalin-inactivated vibrio anguillarum [J]. Periodical of Ocean University of China, 2016, 46(2)： 42-53.

疫苗因具有無污染、無殘留且不易引起耐藥性等優(yōu)點[1]，已經(jīng)成為防治魚類細菌性、病毒性疾病的有效方法。對于魚類疫苗免疫效果的評價主要集中在魚類血清及黏液抗體水平變化[2,4-5]、免疫相關(guān)酶活性[3,6]、淋巴細胞數(shù)量[3-5]、呼吸爆發(fā)[6]和補體活性[6-7]等免疫指標。近年來，從基因水平對疫苗免疫效果進行研究的報道也越來越多，Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)信號通路、淋巴細胞表面標志、免疫應(yīng)答關(guān)鍵分子、細胞因子等在魚類非特異性和特異性免疫應(yīng)答中起重要調(diào)節(jié)作用的相關(guān)因子均是疫苗免疫后主要的檢測指標[8-13]。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)識別病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，啟動信號級聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)，TLR信號激活宿主免疫和前炎性基因的表達，引發(fā)針對所識別病原的免疫反應(yīng)。而MyD88被許多實驗證明除TLR3外介導(dǎo)絕大多數(shù)TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。魚類的主要組織相容性復(fù)合體MHC II類基因產(chǎn)物的主要功能是結(jié)合外源性抗原并呈遞給CD4+T細胞，從而激發(fā)一系列的特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)[24]；Hsp70在蛋白質(zhì)的折疊、裝配、轉(zhuǎn)運和不可復(fù)性多肽的降解及其調(diào)控過程中起關(guān)鍵作用，與生物體的適應(yīng)能力有著重要的相關(guān)性，其大量表達有助于維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、改善細胞的生存能力和提高對環(huán)境脅迫或傷害的耐受性[33]；干擾素γ(IFNγ)屬于II型干擾素，除抗增殖活性外，其主要生物學(xué)活性為免疫調(diào)節(jié)作用；補體及溶菌酶都是在非特異性中發(fā)揮著重要作用，溶菌酶還具有裂解入侵細菌的作用；趨化因子CXC能夠募集免疫細胞遷移，在炎性反應(yīng)及病原侵染中發(fā)揮重要作用；而IL-6在非特異性及特異性免疫應(yīng)答中都能發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[30]。

有研究報道，注射免疫愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)疫苗后，斑馬魚(Daniorerio)脾組織中Toll-like受體(TLR)2、TLR4、TLR5b、髓樣分化因子MyD88、IFNγ、白介素(IL)-8等20種免疫相關(guān)基因的mRNA表達量呈現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)的趨勢[8]；注射免疫愛德華氏菌疫苗后牙鲆(Paralichthysolivaceus)頭腎和腸中TLR5M、TLR5S表達量顯著上調(diào)[28];脾中MHC II表達水平明顯上調(diào)[9]；注射免疫愛德華氏菌疫苗后南亞野鯪(Labeorohita)腎臟中CXC在6～12 h內(nèi)呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達[10]；鏈球菌腹腔注射吉富羅非魚后，脾臟中Hsp70基因表達量在48 h之內(nèi)上調(diào)至對照組的5倍多[11]；利用哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)滅活疫苗免疫斜帶石斑魚后,MHC II在鰓、脾和前腎中的相對表達量顯著高于對照組[12]；大黃魚(Pseudosciaenacrocea)[13]中也出現(xiàn)類似結(jié)果。這些研究中基因的選擇類別相對較少，大部分的研究組織較為單一。本文通過制備鰻弧菌(Vibrioanguillarum)全菌滅活疫苗，注射免疫牙鲆，利用熒光定量PCR法研究免疫后牙鲆脾、頭腎和鰓組織中TLR2、TLR5M、髓樣分化因子MyD88、核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB、IL-6、IFNγ、趨化因子CXC3、補體C3、C型溶菌酶(C-Lyz)、熱休克蛋白(Hsp)-70、MHC II、T細胞表面受體CD4和膜結(jié)合型免疫球蛋白(mIg)D這13種免疫相關(guān)基因表達的動態(tài)變化，從基因水平研究篩選疫苗免疫效果評價的主要指標。

1材料與方法

1.1 實驗動物

牙鲆購自山東日照某牙鲆養(yǎng)殖場，體長為10～13 cm，實驗前于水槽中暫養(yǎng)1周，水溫20～22 ℃，連續(xù)充氣，在此期間及時將染病及死亡的魚撈出。

1.2 鰻弧菌全菌滅活疫苗的制備

鰻弧菌(Vibrioanguillarum)由本實驗室保存，將菌種接種于2216 E固體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落至2216 E液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)24 h使細菌生長基本達到對數(shù)期，之后，6 000g/min 4 ℃離心15 min，去上清液，無菌磷酸鹽緩沖液(PBS, pH7.4)清洗沉淀3次，最后以含0.5%甲醛(v/v)的PBS重懸，4 ℃放置48 h，平板培養(yǎng)檢測無活菌存在，再以PBS離心洗滌3次后調(diào)整菌液濃度為1×1010CFU/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 牙鲆的免疫及取樣

將暫養(yǎng)后的牙鲆隨機分為2組，根據(jù)死亡率50%計算每組60尾魚。第一組腹腔注射濃度為1×108CFU/mL的鰻弧菌滅活疫苗，每尾0.1 mL；第二組注射PBS作為對照。處理后于0、4、8、12、24、48、72、96 h和7和14 d隨機在各組取3尾牙鲆，分別取脾、頭腎和鰓組織用于檢測免疫相關(guān)基因的表達。

1.4 RNA的提取及cDNA的合成

取各組織樣品約20 mg，應(yīng)用Trizol法提取總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，以微量核酸測定儀(NanoDrop 8000，Thermo，美國)測定RNA的濃度和純度，確定所提取RNA不含DNA及蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。提取的RNA利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied Biosystems)經(jīng)RT-PCR合成cDNA，其中反轉(zhuǎn)錄引物是使用隨機引物。所得cDNA樣品-20 ℃保存、備用。

1.5 熒光定量PCR所用引物的設(shè)計與驗證

根據(jù)已知的牙鲆核糖體RNA(18sRNA)、TLR2、TLR5M、MyD88、NF-κB、MHCⅡα、CD4-1、mIgD、IL-6、IFNγ、CXC、C3、C-Lyz和Hsp-70基因序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計各基因特異性引物，選取對照組及實驗組的脾、頭腎、鰓的cDNA樣品，進行PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇產(chǎn)物為單一條帶的引物，利用SYBR?Premix Ex Taq試劑盒(Takara)在熒光定量PCR儀(Light Cycler?480ⅡPCR，Roche，德國)上進行擴增，最終以擴增反應(yīng)產(chǎn)生的熔解曲線是單一波峰的引物作為熒光定量PCR的特異性引物。

1.6 熒光定量PCR檢測

將所有取樣組織cDNA樣品濃度調(diào)為一致，以18S RNA為內(nèi)參基因，利用SYBR?Premix Ex Taq試劑盒在Light Cycler?480ⅡPCR上進行擴增，擴增體系為20 μL，即：模板cDNA 2 μL，正反向引物各0.4 μL(引物濃度為10 μmol/L)，反應(yīng)混合液10 μL，無菌水7.2 μL。每個樣品設(shè)置3個平行，擴增的條件為：95 ℃ 30 s，1個循環(huán)；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，45個循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 5 s，1個循環(huán)；40 ℃冷卻。再次確認每個樣品擴增反應(yīng)產(chǎn)生的熔解曲線是單一波峰，并獲取Ct值，用于數(shù)據(jù)處理及分析。進行3次重復(fù)實驗。

1.7 數(shù)據(jù)處理及分析

2結(jié)果與分析

2.1 熒光定量PCR所用引物的獲得

經(jīng)過常規(guī)PCR-瓊脂糖凝膠電泳及熒光定量PCR溶解曲線驗證，最終獲得13種基因的特異性引物，各基因引物名及引物序列、退火溫度等信息見表1。應(yīng)用特異性引物進行熒光定量PCR，所有檢測樣品的擴增結(jié)果均為單一產(chǎn)物。

2.2 TLR2在脾臟、頭腎和鰓中的表達

注射免疫鰻弧菌滅活疫苗后，在脾臟中，TLR2基因的表達量自4 h起顯著高于對照組，之后快速上升，24 h達到最高值，是對照組的30.02倍，而后逐漸下降，至96 h時降至與對照組無顯著差異(P<0.05)(見圖1A)；在頭腎中，TLR2基因的表達量自4 h起顯著高于對照組，12 h達到最高值，是對照組的8.11倍，而后逐漸下降，至7 d與對照組無顯著差異(見圖1B)；在鰓中，TLR2基因的表達量自24 h起顯著高于對照組，之后快速上升，48 h達到最高值，是對照組的2.73倍，之后逐漸下降，至96 h時與對照組無顯著差異(見圖1C)。注射免疫鰻弧菌滅活疫苗后，3種組織的TLR2基因都有明顯的上調(diào)，其中脾臟的上調(diào)表達水平顯著高于其他2種組織；最高值出現(xiàn)時間為頭腎最早，其次是脾臟，鰓中TLR2基因表達量最高值出現(xiàn)最晚。

表1　熒光定量PCR所用引物

(“*”表示此時間點表達量顯著高于對照組(P<0.05)。Asterisks indicated significant difference compared to the control (P<0.05).)

2.3 TLR5M在脾臟、頭腎和鰓中的表達

脾臟中，TLR5M基因的表達量雖然略有變化，但相對于對照組變化不顯著(見圖2A)；頭腎中，TLR5M基因的表達相對于對照組也無顯著變化(見圖2B)；鰓中，注射組TLR5M基因的表達與脾臟、頭腎一致，均無顯著變化(見圖2C)。因此，整體來看，注射免疫鰻弧菌滅活疫苗后，3種組織的TLR5M基因都沒有明顯的變化。

(“*”表示此時間點表達量顯著高于對照組(P<0.05)。Asterisks indicated significant difference compared to the control. (P<0.05).)

2.4 MyD88在脾臟、頭腎和鰓中的表達

脾臟中，MyD88基因的表達量自12 h起顯著高于對照組，之后快速上升，24 h達到最高值，是對照組的5.52倍，而后逐漸下降，至96 h降至與對照組無顯著差異(見圖3A)；頭腎中，MyD88基因的表達量自4 h起顯著高于對照組，24 h達到最高值，是對照組的14.96倍，而后逐漸下降，至7 d時降至與對照組無顯著差異(見圖3B)；鰓中，MyD88基因的表達量自24 h起高于對照組，之后快速上升，48 h達到最高值，是對照組的3.14倍，之后逐漸下降，至96 h時與對照組無顯著差異(見圖3C)。注射免疫鰻弧菌滅活疫苗后，3種組織的MyD88基因都有明顯的上調(diào)，其中頭腎的上調(diào)表達水平顯著高于其他2種組織；最高值出現(xiàn)時間為頭腎和脾臟最早，而鰓中MyD88基因表達量最高值出現(xiàn)較晚。

2.5 NF-κB在脾臟、頭腎和鰓中的表達

脾臟中，NF-κB基因的表達量自4 h起顯著高于對照組，之后快速上升，24 h達到最高值，是對照組的28.85倍，而后逐漸下降，至7 d時降至與對照組無顯著差異(見圖4A)；頭腎中，NF-κB基因的表達量自4 h起顯著高于對照組，12 h達到最高值，是對照組的14.22倍，而后逐漸下降，至96 h時降至與對照組無顯著差異(見圖4B)；鰓中，NF-κB基因的表達量自4 h起顯著低于對照組，而后逐漸上升，48 h起顯著高于對照組，之后快速上升，72 h達到最高值，是對照組的2.19倍，之后逐漸下降，至96 h時與對照組無顯著差異(見圖4C)。注射免疫鰻弧菌滅活疫苗后，脾臟和頭腎中的NF-κB基因都有明顯的上調(diào)，其中脾臟的上調(diào)表達水平顯著高于其他2種組織；頭腎的NF-κB基因表達量最高值出現(xiàn)時間較脾臟早，而鰓中基因表達變化與其他2種組織明顯不同，基因表達量首先出現(xiàn)了逐漸下調(diào)的變化，從24 h處才開始出現(xiàn)上調(diào)變化，且最高值出現(xiàn)較晚。

(“*”表示此時間點表達量顯著高于對照組(P<0.05)。Asterisks indicated significant difference compared to the control(P<0.05).)

(“*”表示此時間點表達量顯著高于對照組(P<0.05)。Asterisks indicated significant difference compared to the control (P<0.05).)

2.6 MHC II在脾臟、頭腎和鰓中的表達

脾臟中，MHC II基因的表達量自4 h起顯著高于對照組，之后快速上升，72 h達到最高值，是對照組的4.56倍，而后逐漸下降，至14 d時降至與對照組無顯著差異(見圖5A)；頭腎中，MHC II基因的表達量自12 h起顯著高于對照組，72 h達到最高值，是對照組的12.75倍，而后逐漸下降，至14 d時降至與對照組無顯著差異(見圖5B)；鰓中，MHC II基因的表達量自24 h起高于對照組，之后快速上升，72 h達到最高值，是對照組的2.63倍，之后逐漸下降，至96 h時與對照組無顯著差異(見圖5C)。注射免疫鰻弧菌滅活疫苗后，3種組織的MHC II基因都有明顯的上調(diào)，其中頭腎的上調(diào)表達水平顯著高于其他2種組織；3種組織基因表達最高值出現(xiàn)時間相差不大。

2.7 CD4在脾臟、頭腎和鰓中的表達

脾臟中，CD4基因的表達量自12 h起顯著高于對照組，之后快速上升，48 h達到最高值，是對照組的16.81倍，而后逐漸下降，至14 d時降至與對照組無顯著差異(見圖6A)；頭腎中，CD4基因的表達量自4 h起高于對照組，72 h達到最高值，是對照組的19.75倍，而后逐漸下降，至14 d時降至與對照組無顯著差異(見圖6B)；鰓中，CD4基因的表達量自8 h起高于對照組，之后緩慢上升，72 h達到最高值，是對照組的1.63倍，之后逐漸下降，至7 d時與對照組無差異(見圖6C)。注射免疫鰻弧菌滅活疫苗后，脾臟和頭腎中的CD4基因都有明顯的上調(diào)，其中頭腎和脾臟的上調(diào)表達水平顯著高于鰓組織；最高值出現(xiàn)時間脾臟最早，頭腎和鰓中CD4基因表達量最高值出現(xiàn)相差不大。

(“*”表示此時間點表達量顯著高于對照組(P<0.05)。Asterisks indicated significant difference compared to the control (P<0.05).)

2.8 mIgD在脾臟、頭腎和鰓中的表達

mIgD在脾臟、頭腎和鰓組織中的表達量都呈現(xiàn)下調(diào)的表現(xiàn)，尤其在前腎和脾臟中下調(diào)最為明顯。脾臟中，mIgD基因的表達量自4 h開始顯著低于對照組，之后繼續(xù)下降，至12 h達到最低值，是對照組的0.2倍，而后逐漸上升，至48 h時升至與對照組無顯著差異(見圖7A)；頭腎中，mIgD基因的表達量自4 h起顯著低于對照組，并于8h達到最低值，是對照組的0.02倍，而后逐漸上升，至48 h時與對照組無顯著差異(見圖7B)；鰓中，mIgD基因的表達量雖然也有輕微下調(diào)但下調(diào)的幅度并不大，至48 h達到最低值，是對照組的0.02倍，之后逐漸上升，至96 h時與對照組無差異(見圖7C)。注射免疫鰻弧菌滅活疫苗后，頭腎和脾臟的mIgD基因都有明顯的下調(diào)，其中頭腎的上調(diào)表達水平顯著高于其他2種組織；最低值出現(xiàn)時間為頭腎和脾臟最早，而鰓中mIgD基因表達量最低值出現(xiàn)較晚，且表達量變化最不明顯。

(“*”表示此時間點表達量顯著低于對照組(P<0.05)。Asterisks indicated significant difference compared to the control (P<0.05).)

2.9 IL-6在脾臟、頭腎和鰓中的表達

脾臟中，IL-6基因的表達量自8 h起顯著高于對照組，之后快速上升，12 h達到最高值，是對照組的16.81倍，而后逐漸下降，至96 h時降至與對照組無顯著差異(見圖8A)；頭腎中，IL-6基因的表達量自4 h起顯著高于對照組，12 h達到最高值，是對照組的29.75倍，而后逐漸下降，至7 d時降至與對照組無顯著差異(見圖8B)；鰓中，IL-6基因的表達量自8 h起高于對照組，之后快速上升，24 h達到最高值，是對照組的3.63倍，之后逐漸下降，至7 d時與對照組無顯著差異(見圖8C)。注射免疫鰻弧菌滅活疫苗后，3種組織的IL-6基因都有明顯的上調(diào)，其中頭腎的上調(diào)表達水平顯著高于其他2種組織；最高值出現(xiàn)時間為頭腎和脾臟最早，而鰓中IL-6基因表達量最高值出現(xiàn)較晚。

2.10 IFNγ在脾臟、頭腎和鰓中的表達

IFNγ基因在脾臟和頭腎2種組織中的表達均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而鰓中無顯著變化。脾臟中，IFNγ基因的表達量自8 h起顯著高于對照組，之后快速上升，24 h達到最高值，是對照組的3.18倍，而后逐漸下降，至72 h時降至與對照組無顯著差異(見圖9A)；頭腎中，IFNγ基因的表達量自4 h起顯著高于對照組，24 h達到最高值，是對照組的4.07倍，而后逐漸下降，至96 h時降至與對照組無顯著差異(見圖9B)；鰓中，IFNγ基因的表達量與對照組無顯著差異(見圖9C)。注射免疫鰻弧菌滅活疫苗后，脾臟和頭腎中的IFNγ基因都有明顯的上調(diào)，其中頭腎的上調(diào)表達水平略微高于脾臟；頭腎和脾臟中IFNγ基因表達量最高值出現(xiàn)時間相差不大，而鰓中IFNγ基因的表達量沒有明顯變化。

(“*”表示此時間點表達量顯著高于對照組(P<0.05)。Asterisks indicated significant difference compared to the control (P<0.05).)

(“*”表示此時間點表達量顯著高于對照組(P<0.05)。Asterisks indicated significant difference compared to the control (P<0.05).)

2.11 CXC在脾臟、頭腎和鰓中的表達

脾臟中，CXC基因的表達量自8 h起顯著高于對照組，之后快速上升，24 h達到最高值，是對照組的5.54倍，而后逐漸下降，至96 h時降至與對照組無顯著差異(見圖10A)；頭腎中，CXC基因的表達量自8 h起高于對照組，24 h達到最高值，是對照組的3.24倍，而后逐漸下降，至7 d時降至與對照組無顯著差異(見圖10B)；鰓中，CXC基因的表達量自8 h起高于對照組，之后快速上升，48 h達到最高值，是對照組的4.66倍，之后逐漸下降，至96 h時與對照組無顯著差異(見圖10C)。注射免疫鰻弧菌滅活疫苗后，脾臟和頭腎中的CXC基因表達變化趨勢及達到最高值的時間基本相同，但脾臟和鰓的基因表達量明顯高于頭腎；最高值出現(xiàn)時間為頭腎和脾臟最早，而鰓中CXC基因表達量最高值出現(xiàn)較晚。

(“*”表示此時間點表達量顯著高于對照組(P<0.05)。Asterisks indicated significant difference compared to the control (P<0.05).)

2.12 C3在脾臟、頭腎和鰓中的表達

脾臟中，C3自8 h起顯著高于對照組，24 h達到最高值，是對照組的3.24倍，而后有所下降，7～14 d時又出現(xiàn)小幅度上調(diào)表達(見圖11A)；頭腎中，C3的表達量自12 h起顯著高于對照組，之后快速上升，24 h達到最高值，是對照組的4.45倍，而后有所下降，7～14 d時又出現(xiàn)小幅度上調(diào)表達，并于7 d達到第二個小高峰，是對照組的3.55倍(見圖11B)；鰓中，C3的表達量自24 h起顯著高于對照組，72 h達到最高值，是對照組的2.58倍，之后有所下降，7 d時又出現(xiàn)小幅度上調(diào)表達并達到第二個小高峰，是對照組的2.15倍(見圖11C)。注射免疫鰻弧菌滅活疫苗后，脾臟和頭腎中的C3基因表達變化趨勢及達到最高值的時間基本相同，但頭腎的基因表達量明顯高于脾臟和鰓；最高值出現(xiàn)時間為頭腎和脾臟最早，而鰓中C3基因表達量最高值出現(xiàn)較晚。

(“*”表示此時間點表達量顯著高于對照組(P<0.05)。Asterisks indicated significant difference compared to the control (P<0.05).)

2.13 C-Lyz在脾臟、頭腎和鰓中的表達

脾臟中，C-Lyz基因的表達量自8 h起顯著高于對照組，之后快速上升，24 h達到最高值，是對照組的2.14倍，而后逐漸下降，至96 h時降至與對照組無差異(見圖12A)；頭腎中，C-Lyz的表達量自8 h起高于對照組，72 h達到最高值，是對照組的2.22倍，而后逐漸下降，至7 d時降至與對照組無差異(見圖12B)；鰓中，C-Lyz基因的表達量自8 h起顯著高于對照組，之后快速上升，24 h達到最高值，是對照組的4.09倍，之后逐漸下降，至96 h時與對照組無顯著差異(見圖12C)。注射免疫鰻弧菌滅活疫苗后，脾臟和頭腎中的C-Lyz基因表達變化趨勢及基因的表達水平基本相同，且基因表達量都明顯低于鰓的表達水平；鰓中C-Lyz基因表達量最高值出現(xiàn)最早。

(“*”表示此時間點表達量顯著高于對照組(P<0.05)。Asterisks indicated significant difference compared to the control (P<0.05).)

2.14 Hsp70在脾臟、頭腎和鰓中的表達

Hsp70在脾臟、頭腎和鰓組織中的表達量都較高，最高峰值均在6倍以上。脾臟中，Hsp70基因的表達量自4 h起顯著高于對照組，之后快速上升，12 h達到最高值，是對照組的10.06倍，而后逐漸下降，至72 h時降至與對照組無顯著差異(見圖13A)；頭腎中，Hsp70基因的表達量自4 h起顯著高于對照組，12 h達到最高值，是對照組的6.70倍，而后逐漸下降，至72 h時降至與對照組無顯著差異(見圖13B)；鰓中，Hsp70基因的表達量自12 h起顯著高于對照組，之后快速上升，24 h達到最高值，是對照組的6.61倍，之后逐漸下降，至96 h時與對照組無顯著差異(見圖13C)。注射免疫鰻弧菌滅活疫苗后，脾臟和頭腎中的Hsp70基因表達量達到最高值的時間基本相同，但脾臟的基因表達量明顯高于頭腎和鰓；最高值出現(xiàn)時間為頭腎和脾臟最早，而鰓中HSP70基因表達量最高值出現(xiàn)較晚。

(“*”表示此時間點表達量顯著高于對照組(P<0.05)。Asterisks indicated significant difference compared to the control (P<0.05).)

3討論

本文結(jié)果顯示，腹腔注射免疫鰻弧菌疫苗后，牙鲆脾臟、頭腎和鰓組織中13種免疫相關(guān)基因，除mIgD、TLR5M基因以外其余11種基因均呈上調(diào)表達；mIgD基因的表達顯著下調(diào)或無顯著差異；TLR5M基因的表達無顯著變化。各基因的表達規(guī)律性主要體現(xiàn)在：TLR2、MyD88、NF-κB、MHC II、CD4、IL-6、CXC、C-Lyz和Hsp70 9種免疫相關(guān)基因的表達均先升高后降低最后降至對照組水平；并且同屬于相同免疫通路上的基因無論在表達量還是表達趨勢上都有相似性，例如，TLR信號通路上的TLR2、MyD88、NF-κB 3類基因都是遵循從4～24 h開始有明顯上調(diào)現(xiàn)象，24～72 h達到表達量高峰的規(guī)律，7～14 d降至對照組水平，從基因水平出發(fā)，在某種程度上證明這個3種基因在TLR信號通路上的具有一定的緊密關(guān)系。之前的研究發(fā)現(xiàn)，利用革蘭氏陰性菌溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)注射感染斜帶石斑魚(Epinephelusdaemelii)后，其脾臟和頭腎中TLR2在72 h后顯著上調(diào)，脾臟中上調(diào)十余倍[14]；革蘭氏陽性菌海分枝桿菌(Mycobacterium)懸液注射能夠使感染后的斑馬魚TLR2轉(zhuǎn)錄水平顯著升高[15]；利用革蘭氏陰性菌愛德華氏菌(Edwardsiellaictaluri)感染斑點叉尾鮰后，其頭腎中TLR2出現(xiàn)小幅下調(diào)后又上調(diào)[16]。本研究中TLR2在脾臟、頭腎和鰓中均顯著上調(diào)，脾臟中其mRNA表達最高值約為30倍，與以上研究者的研究結(jié)果較一致，結(jié)合TLR2識別配體的相關(guān)類型，表明該受體能夠參與革蘭氏陰性菌和陽性菌的識別，但因滅活疫苗成分復(fù)雜，對于TLR2識別配體的具體成分無法做出明確判斷；MyD88是TLR信號通路中重要的接頭分子，除TLR3外，TLR都要通過MyD88向通路下游進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終激活和轉(zhuǎn)錄因子κB,引起前炎性細胞因子的表達[17]。本實驗中，MyD88在各組織中均出現(xiàn)顯著上調(diào)，其中頭腎中上調(diào)表達量最高，約為對照組的15倍。溶藻弧菌注射免疫斜帶石斑魚后脾臟中MyD88基因在3d內(nèi)上調(diào)25倍[14]；愛德華氏菌減毒疫苗注射免疫斑馬魚后脾臟中MyD88基因2d內(nèi)上調(diào)2倍[13]；腹腔注射滅活鰻弧菌后，半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)的脾臟和頭腎中MyD88基因在短時間內(nèi)均呈現(xiàn)顯著上調(diào)[18]；鰻弧菌滅活疫苗免疫鯉魚后其頭腎中MyD88 6 h上調(diào)6倍，脾臟持續(xù)上調(diào)5 d達到6倍[19]；同樣的，利用鰻弧菌滅活疫苗免疫鮸魚(Miichthysmiiuy)后其頭腎和脾臟中該基因在2 d內(nèi)上調(diào)15～20倍[20]；福爾馬林滅活的革蘭氏陰性菌副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)刺激大黃魚,MyD88在相關(guān)免疫器官的表達均表現(xiàn)為上調(diào)趨勢[32]。綜合以上研究可以發(fā)現(xiàn)，疫苗免疫后MyD88基因的表達均在短時間內(nèi)出現(xiàn)顯著變化，表明它在魚類應(yīng)對細菌性病原入侵的免疫反應(yīng)中占據(jù)重要地位，是關(guān)鍵性的免疫相關(guān)因子。眾研究中MyD88基因表達最高峰出現(xiàn)的時間和上調(diào)的倍數(shù)各有差異，可能與不同魚類、不同菌種和不同免疫方式刺激有關(guān)。

在免疫后，上調(diào)表達的11種基因中除MHC II、CD4基因最大表達量出現(xiàn)在72 h外，其他表現(xiàn)出上調(diào)的基因表達量最大值的出現(xiàn)都集中在12～48 h，推測原因可能是基因的激活機制有差異造成的。MHC是一組能夠編碼主要組織相容性系統(tǒng)的基因群,其編碼產(chǎn)物廣泛參與免疫反應(yīng)，魚類的MHC II類基因產(chǎn)物的主要功能是結(jié)合外源性抗原并呈遞給CD4+T細胞[21]。近年來,有關(guān)疫苗免疫后魚類MHC II基因表達變化研究已經(jīng)有較多報道。例如利用哈維氏弧菌滅活疫苗免疫斜帶石斑魚后,MHC II在鰓、脾、前腎中的相對表達量顯著高于對照組[22]；大黃魚中也出現(xiàn)類似結(jié)果[23];牙鲆注射愛德華氏菌疫苗后,脾中MHC II表達水平明顯上調(diào)[9]。與以上研究結(jié)果類似,本研究中免疫刺激發(fā)生后,MHC II在各組織中均出現(xiàn)上調(diào)表達但相較于其他基因，MHC II達到峰值的時間較遲,為48～72 h,可能由于這類基因激活機制與其他基因相比有差異造成的,有研究表明MHC II僅存在于抗原遞呈細胞表面,依賴特定的途徑激活[24],這可能是導(dǎo)致基因表達滯后的原因之一。CD4是T細胞亞群重要的表面分子,CD4+T細胞具有輔助性T細胞功能,為MHC II分子的受體,本結(jié)果也顯示MHC II和CD4的基因表達水平均出現(xiàn)明顯上調(diào)，且達到最高值的時間及表達量高低與CD4具有一致性,由此可以證明在外源性抗原感染時機體傾向于激活MHC II分子的抗原遞呈來增強CD4+T細胞的應(yīng)答，這或許從分子水平揭示了MHC II和CD4在功能上的遞呈關(guān)系。關(guān)于牙鲆中MHC II和CD4在鰻弧菌滅活疫苗免疫后的表達變化本實驗室之前也有過相關(guān)的研究[31]，其研究結(jié)果與本實驗的結(jié)果在基因的表達變化趨勢及達到最大表達量的時間都保持一致，只是在個別時間點的表達量有差別，推測原因可能是養(yǎng)殖條件及魚體的大小、年齡有所不同而造成的差異性。

在頭腎和脾臟組織中，除TLR5M、CXC、C-Lyz、mIgD基因外，其余9個基因的表達量最大值出現(xiàn)均高于并早于鰓組織。其中TLR2、MyD88、NF-κB、IL-6和Hsp70在頭腎和脾臟組織中的表達量最大值均出現(xiàn)在12～24 h，是對照組的5～30倍左右；而它們在鰓組織中的表達量最大值均出現(xiàn)在48～72 h，是對照組的2～6倍左右。說明注射免疫后，相較于鰓組織來說，脾臟和頭腎是發(fā)生免疫反應(yīng)的主要的器官，通過與浸泡免疫的比較，發(fā)現(xiàn)在注射免疫后鰓組織各基因表達最高值出現(xiàn)的時間均晚于浸泡免疫[31]，說明注射免疫后鰓中各基因的表達變化比浸泡免疫要緩慢，可能與鰓是魚類黏液免疫的重要器官，浸泡免疫時鰓較早接觸病原，從而引起了黏液免疫應(yīng)答有關(guān)。該結(jié)果也為魚類黏膜免疫的研究和浸泡免疫提供了數(shù)據(jù)支持。在以上列舉的脾臟和頭腎組織中基因表達量高于鰓組織的9個基因中，IFNγ基因的表達存在其獨特性，免疫后表達量在脾臟和頭腎中出現(xiàn)2～4倍的上調(diào)，在鰓組織中無顯著變化，這與LPS注射免疫草魚后其頭腎和脾臟中IFNγ的變化、注射愛德華氏菌減毒疫苗后斑馬魚脾臟中IFNγ的表達變化[8]相似，充分說明IFNγ在病毒和細菌侵染時能夠刺激其表達量的升高，對于鰓組織中的表達差異，推斷注射疫苗未能引起了牙鲆的黏膜免疫或者是實驗操作方面的影響。

滅活鰻弧菌疫苗免疫后，C3基因的表達變化趨勢與其他基因明顯不同，在14 d中呈現(xiàn)出雙波峰現(xiàn)象，基因表達量首先是逐漸升高后達到最大值，而后有所下降，7～14 d時又出現(xiàn)小幅度上調(diào)表達，最后逐漸下降至免疫前水平。結(jié)合補體的活化機制推斷，第一個波峰的出現(xiàn)可能與病原體的直接刺激有關(guān)，C3被病原體激活后，具有誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，增強病原體裂解能力等生物學(xué)作用。基因的第二次高表達可能與抗原抗體復(fù)合物的激活有關(guān)，IgM前體經(jīng)過一系列加工與裝配后合成抗體，分泌到血液、黏液中，形成抗原抗體復(fù)合物，進而激活補體活化途徑。

本研究發(fā)現(xiàn)牙鲆在注射免疫滅活鰻弧菌后，前腎和脾臟中mIgD的表達量都出現(xiàn)了快速顯著的下調(diào)，并分別于8和12 h處達到最低水平，為對照組的0.02和0.2倍，然后逐漸恢復(fù)至正常水平。mIgD主要是作為抗原識別受體存在于B淋巴細胞膜表面，識別和特異性的結(jié)合相應(yīng)的抗原。目前，有關(guān)魚體IgD對免疫刺激的應(yīng)答研究較少，僅在鱖魚及牙鲆中開展了相關(guān)的研究[26,34]，其中在鱖魚中免疫滅活柱狀黃桿菌(Flavobacteriumclumnare)后的應(yīng)答研究，結(jié)果顯示免疫后第三周在前腎和脾臟中表達量顯著上調(diào)[25]；以及在牙鲆中免疫副溶血弧菌DNA疫苗后IgD的表達變化情況[34]。然而在人體和小鼠中發(fā)現(xiàn)，當幼稚B細胞受到免疫原刺激后，mIgD表達會發(fā)生快速下調(diào)；相似的現(xiàn)象出現(xiàn)在注射免疫滅活鰻弧菌后，大菱鲆前腎組織中mIgD的表達量出現(xiàn)了快速顯著的下調(diào)[26]；另外，通過對虹鱒魚的B細胞表面的mIgD豐度的研究發(fā)現(xiàn)其存在高低差異分布[27]。因此可以推測魚類IgD在免疫信號傳導(dǎo)及體液免疫防御中可能起重要作用，但詳細的作用機制還有待進一步研究。

腹腔注射免疫鰻弧菌疫苗后，TLR5M基因沒有顯著變化，該結(jié)果與之前的研究具有相似性和差異性。利用鰻弧菌及其鞭毛刺激虹鱒細胞系后發(fā)現(xiàn)，TLR5M表達變化不顯著[12]；利用愛德華氏菌疫苗免疫牙鲆后3和5 d取樣檢測，發(fā)現(xiàn)TLR5M除在腸中大幅上調(diào)外，在其余5種組織中變化不顯著[28]。結(jié)合之前的相關(guān)報道，推斷TLR5M在消化道的細菌識別中發(fā)揮重要作用而在其他器官作用不顯著，且TLR5M與TLR5S識別鞭毛的成分有可能不同，導(dǎo)致其表達出現(xiàn)差異。本研究中，TLR5M在脾臟、頭腎和鰓中均無顯著表達，因而較為清晰的分子機制有待進一步研究。

通過對13個基因在免疫鰻弧菌滅活疫苗后的表達趨勢及表達量變化進行比較發(fā)現(xiàn)，TLR2、IL-6和NF-κB 3個基因的表達量變化尤其明顯，通過查閱大量文獻發(fā)現(xiàn)這3個基因在在非特異性及特異性免疫應(yīng)答中都發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，其中TLR2、NF-κB是TLR受體信號通路中的關(guān)鍵因子，TLR2可識別合成的三酰脂肽Pam3CSK4和來自革蘭氏陽性細菌的脂肽，啟動信號級聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活宿主免疫和前炎性基因的表達，引發(fā)針對所識別病原的免疫反應(yīng)[29]；NF-κB具有激活如編碼細胞因子、趨化因子、急性期蛋白、抗菌肽等基因轉(zhuǎn)錄的能力，是魚類免疫中的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子；白介素家族中的IL-6是一種多效的細胞因子，它能夠有效促進B細胞的增殖分化和T細胞的成熟[30]。在本實驗中除TLR5M基因無明顯表達變化外，其他各基因達到高峰時表達量是對照組的2～30倍，其中TLR2和NF-κB分別在脾臟中24 h處及IL-6在頭腎中12 h處達到最大值，是對照組的30倍左右，是所有基因中的表達量最高值，由該結(jié)果推測可以將這3種基因作為鰻弧菌全菌滅活疫苗注射免疫效果評價的主要檢測指標。

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責任編輯朱寶象

Expression Analysis of Thirteen Immune Related Genes of Flounder(Paralichthysolivaceus) Vaccinated with Formalin-InactivatedVibrioanguillarum

XUE Jie, SONG Xiao-Qing, XING Jing, ZHAN Wen-Bin

(Laboratory of Pathology and Immunology of Aquatic Animals, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Abstract:Vaccination is an effective method of controlling bacterial diseases of fish. At present, researchers have paid more attention to the variation of immune related gene expression to evaluate the immune effect of vaccine, then to the changes of antibody level of serum and mucus, enzyme activity, number of lymphocytes, respiratory burst, and complement activity among others. For studying the influence of vaccine immune ways on the expression of immune related genes, Paralichthys olivaceus was intraperi toneally injected with inactivated Vibrio anguillarum vaccine in this study. The spleen, head kidney and gill were taken at 0, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96 h and 7, 14 d after immunization, respectively, and then total mRNA was extracted and reversely transcribed into cDNA. The expression of 13 immune related genes including the toll-like receptor (TLR) 2, TLR5M, myeloid differentiation factor 88 (MyD88), nuclear transcription factor (NF)-κB, interleukin-6 (IL-6), Interferon (IFN)γ, chemokines, C-type lysozyme, heat shock protein (HSP)70, major histocompatibility complex class II (MHC II), T cell surface receptor CD4 and immunoglobulin D (mIgD) genes was analyzed with quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) using 18sRNA as internal reference. The results showed that, the expression of all the tested gene except for TLR5M and mIgD was up-regulated significantly. The expression of TLR2, MyD88, NF-κB, MHC II, CD4, IL-6, IFNγ, CXC, C3, C-Lyz and HSP70 genes maximized between 12 h and 72 h, 2～30 folds higher than that of control. The expression of mIgD gene was down-regulated but not significantly different from that of control, peaked between 8 h and 12 h with the maximum 0.2～0.02 fold higher than that of control. The expression of TLR5M gene was similar in all three tissues. Our findings indicated that, the abundance of TLR2, MyD88, NF-κB, MHC II, CD4, IL-6, IFNγ, C3, and HSP70 gene transcripts in spleen and head kidney was higher than that of these genes in gills. In addition, the highest expression reached earlier in spleen than in gill. After being injected with formalin-inactivated V. anguillarum, the expression of TLR2、NF-κB、IL-6 gene was higher and maximized earlier in spleen and head kidney than other genes. Such difference may serve as the key candidate indices of vaccine efficiency.

Key words:Paralichthys olivaceus; Vibrio anguillarum; inactivated vaccine; injection; immune related gene

DOI：10.16441/j.cnki.hdxb.20150022

中圖法分類號：S917

文獻標志碼：A

文章編號：1672-5174(2016)02-042-12

作者簡介：薛潔(1989-)， 女， 碩士生， 研究方向為水產(chǎn)動物病害與免疫。E-mail: joycexuejie@126.com??通訊作者：E-mail: xingjing@ouc.edu.cn

收稿日期：2015-01-28；

修訂日期：2015-04-24

基金項目：?國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(2012CB114406)；國家科技支撐計劃(2012BAD17B02)；國家自然科學(xué)基金項目(31172429;31302216);泰山學(xué)者工程專項經(jīng)費項目資助

引用格式：薛潔， 宋曉青， 邢婧， 等. 牙鲆注射免疫鰻弧菌滅活疫苗后13種免疫相關(guān)基因表達的變化[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)， 2016, 46(2)： 42-53.

Supported by The National Basic Research Program of China (2012CB114406)；The National Key Technology Support Program(2012BAD17B02)；The National Natural Science Fund(31172429；31302216)；The Taishan Scholar Program of Shandong Province