譚樹(shù)芬　楊宏英　張　芍　祝英杰

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漿液性和黏液性卵巢囊腺癌患者線粒體結(jié)構(gòu)和緊密連接蛋白表達(dá)的差異比較*

譚樹(shù)芬楊宏英張芍祝英杰

【摘要】目的：探討漿液性卵巢囊腺癌(SC)與黏液性卵巢囊腺癌(MC)細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)及緊密連接(TJ)蛋白o(hù)ccludin/ZO-1表達(dá)異常的差異及可能機(jī)制。方法：臨床確診30例卵巢囊腺癌患者中15例為SC(SC組)，15例為MC(MC組)，另選3例子宮肌瘤患者進(jìn)行對(duì)照(對(duì)照組)。采用電鏡觀察各組線粒體超微結(jié)構(gòu)；采用體視學(xué)方法分析線粒體面數(shù)密度(Nm)、體密度(Vvm)和外膜面密度(Sv)；采用免疫組化方法檢測(cè)各組卵巢上皮細(xì)胞occludin/ZO-1蛋白的陽(yáng)性單位(PU)及其強(qiáng)弱程度(用積分光密度值IOD表示)。結(jié)果：電鏡下，對(duì)照組線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)均未見(jiàn)異常；MC組線粒體體積小、數(shù)量較多，線粒體Nm、Vvm 和Sv較對(duì)照組明顯降低(P<0.05)；SC組線粒體體積大，脊斷裂顯著，線粒體Nm、Vvm和Sv較MC組顯著升高(P<0.01)。免疫組化分析顯示MC組occludin和ZO-1 PU明顯高于對(duì)照組(24.23±4.74 Vs 21.07±5.51、37.07±3.58 Vs 20.46±4.89，P均<0.05)，IOD明顯低于對(duì)照組(72.39±9.86 Vs 92.38±7.17、73.51±6.86 Vs 80.34±7.04，P均<0.05)；SC組occludin和ZO-1 PU明顯低于對(duì)照組(11.50±4.15 Vs 21.07±5.51、16.24±3.61 Vs 20.46 ±4.89，P均 <0.05)，IOD明顯高于對(duì)照組(101.38±6.16 Vs 92.38±7.1、92.78±3.07 Vs 80.34±7.04，P均 <0.01)。結(jié)論：SC及MC兩種卵巢囊腺癌患者線粒體結(jié)構(gòu)和體視學(xué)特征明顯不同，可能與TJ蛋白的occludin/ZO-1表達(dá)異常有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】漿液性卵巢囊腺癌；黏液性卵巢囊腺癌；線粒體超微結(jié)構(gòu)；體視學(xué)；緊密連接蛋白

卵巢癌是女性最常見(jiàn)腫瘤之一，約占卵巢惡性上皮腫瘤的90%。腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特性，是一個(gè)多步驟、多因素參與的復(fù)雜過(guò)程，通常不易被發(fā)現(xiàn)，且預(yù)后差[1,2]。近年研究顯示,緊密連接(Tight Junction,TJ)蛋白是腫瘤細(xì)胞黏附、趨化、侵襲及轉(zhuǎn)移的重要物質(zhì)，主要由跨膜蛋白(occludin)和胞漿附著蛋白(ZO-1)以及細(xì)胞骨架蛋白組成，Zhu等[3]研究認(rèn)為occludin對(duì)維持TJ蛋白功能具有重要作用；我們的前期研究[4]發(fā)現(xiàn)漿液性卵巢囊腺癌(Serous Ovarian Cystadenocarcinomamucinous,SC)和黏液性卵巢囊腺癌(Mucinous Ovarian Cystadenocarcinoma,MC) 細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)改變明顯不同，但這種差異是否與TJ表達(dá)異常有關(guān)尚不明確。本研究通過(guò)體視學(xué)原理分析兩種腫瘤細(xì)胞線粒體三維結(jié)構(gòu)[5]，并采用免疫組化方法檢測(cè)TJ蛋白o(hù)ccludin/ZO-1的表達(dá)變化，比較SC和MC細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)差異及其與occludin/ZO-1表達(dá)異常的可能關(guān)聯(lián)，為兩種卵巢癌的臨床早期診斷尋找新的線索。

1資料與方法

1.1病例和分組

2011-01—2013-12，30例卵巢癌患者在本院行卵巢癌切除術(shù)，年齡30-70歲；診斷符合病理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)免疫組化染色確認(rèn)15例為SC(SC組)，另15例為MC(MC組)；再選3例子宮肌瘤患者作為對(duì)照組。

1.2主要試劑和儀器

occludin/ZO-1一抗(鼠抗人抗體)、二抗(抗鼠/兔聚合物)及DAB顯色劑(DAB-0031)均購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，蘇木素(Hematoxylin)由英國(guó)進(jìn)口分裝。超薄切片機(jī)(Leica RM2135， 德國(guó))； 日立JEM-1011型電子顯微鏡(日本)；HPIA-2000高清晰度病理圖文分析系統(tǒng)(同濟(jì)大學(xué))；顯微攝影系統(tǒng)(Leica DM4000B，德國(guó))；顯微鏡攝影軟件(Leica IM50，德國(guó))；顯微圖像分析系統(tǒng)(Nikon-MiVnt，日本)。

1.3線粒體電鏡觀察及體視學(xué)分析

1.3.1電鏡觀察：取各組卵巢組織塊，3.5%戊二醛固定，磷酸鹽緩沖液沖洗后，丙酮酸逐級(jí)脫水，1%四氧餓酸再固定24h，超薄切片機(jī)半薄切片，檸檬酸鉛醋酸鈾雙染色，電鏡下觀察線粒體形態(tài)、結(jié)構(gòu)。

1.3.2體視學(xué)分析[4,5]：選擇有超微結(jié)構(gòu)改變的卵巢上皮細(xì)胞拍照后，采用體視學(xué)網(wǎng)格測(cè)試系統(tǒng)，以點(diǎn)計(jì)數(shù)法測(cè)量并計(jì)算線粒體體密度(Vvm，%)、線粒體外膜表面積密度(Sv,μm-1)、線粒體面數(shù)密度(Nm，μm-1)。Vvm= ∑Pmi/∑Ppi；Sv= 4/Z·∑Nmi/∑Ppi；Nm=∑Nmi/a∑Ppi。

1.4occludin和ZO-1免疫組化染色

1.4.1操作方法：采用免疫組化MaxVision快捷法進(jìn)行occludin/ZO-1檢測(cè)。操作步驟：常規(guī)固定、包埋卵巢組織樣本，脫蠟、梯度酒精脫水。將脫蠟水化后組織切片置入已沸騰的緩沖液內(nèi)加熱至工作溫度(105℃)和工作壓力(90kPa)，噴汽2 min后沖淋冷卻以修復(fù)組織抗原。3% H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS沖洗3 min ×3次，甩去血清。用PBS(pH 7.4)沖洗3 min ×3次，加50 μl一抗(1∶100稀釋);4℃冰箱孵育過(guò)夜；除去PBS液，加50 μl酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物(二抗)，室溫孵育15 min。PBS沖洗，除去PBS液，加50μl新鮮配制的DAB溶液后鏡下觀察。自來(lái)水沖洗、蘇木素復(fù)染，0.1% HCl分化；自來(lái)水沖洗返藍(lán)。經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。以PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4.2結(jié)果判定：所有石蠟切片由病理科醫(yī)師獨(dú)立評(píng)判后綜合評(píng)定。occludin 和ZO-1陽(yáng)性物為細(xì)胞漿中有棕黃色細(xì)顆粒物，計(jì)算陽(yáng)性單位(PU)：

公式中Gα為待測(cè)結(jié)構(gòu)α的平均灰度，GA為含有α的A區(qū)域的平均灰度，Gmax為檢測(cè)儀器的最大灰度，AAα為α相在A區(qū)域中的面積密度。

在相同電壓及相同亮度條件下，用20倍物鏡攝取各組上述切片圖像傳送至計(jì)算機(jī)顯示屏，采用Nikon-MiVnt顯微圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行免疫組化圖像定量分析，occludin/ZO-1陽(yáng)性表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)弱用平均灰度值(即積分光密度值，IOD)表示。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1各組線粒體超微結(jié)構(gòu)和體視學(xué)變化

2.1.1超微結(jié)構(gòu)： 電鏡觀察，對(duì)照組線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無(wú)異常(圖1A)。SC組線粒體腫脹、體積明顯增大、緊擠于細(xì)胞內(nèi)，呈典型巨線粒體，脊斷裂明顯(圖1B)。MC組線粒體改變以增生為主，體積較小、數(shù)量增多(圖1C)。

2.1.2體視學(xué)變化：三組Nm、Vvm 、Sv差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MC組線粒體Nm、Vvm和Sv較對(duì)照組明顯降低(P<0.05，P<0.01)，SC組線粒體Nm、Vvm和Sv較MC組明顯升高P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1　各組線粒體Nm、Vvm及Sv比較

注：與對(duì)照組比較，1)P<0.05,2)P<0.01；與MC組比較，3)P<0.05,4)P<0.01

2.2各組occludin/ZO-1蛋白表達(dá)的PU和IOD

對(duì)照組卵巢上皮細(xì)胞occludin/ZO-1呈陽(yáng)性表達(dá)，胞漿內(nèi)有較多棕黃色顆粒物(圖2A、圖2D)。SC組呈弱表達(dá)，癌細(xì)胞胞漿內(nèi)僅見(jiàn)少量棕黃色顆粒物(圖2B和圖2E)，MC組呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，胞漿內(nèi)棕黃色顆粒物明顯。定量分析表明MC組occludin/ZO-1 PU明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，IOD明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；SC組occludin/ZO-1 PU較MC組明顯降低(P<0.01)，IOD較MC組明顯升高(P<0.01)。見(jiàn)圖 2、表2。

表2　各組卵巢上皮細(xì)胞occludin/ZO-1蛋白表達(dá)PU及IOD的比較

注：與對(duì)照組比較，1)P<0.05；與MC組比較，2)P<0.01

[本文圖1、圖2見(jiàn)封3]

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)，SC組細(xì)胞呈巨型線粒體改變及脊斷裂，與國(guó)外學(xué)者關(guān)于細(xì)胞脹亡(oncosis)的觀點(diǎn)相吻合[6]。細(xì)胞脹亡作為一種有別于凋亡的細(xì)胞死亡方式，在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用[7]。業(yè)已證明，細(xì)胞壞死時(shí)胞膜的不可逆代謝、功能和結(jié)構(gòu)損傷和完整性消失，造成膜通透性嚴(yán)重缺陷及膜上離子泵功能衰竭引起的細(xì)胞水腫及線粒體腫脹，可能是導(dǎo)致SC細(xì)胞線粒體Nm、Vvm及Sv明顯增加的原因所在[8]；本文SC患者不僅表現(xiàn)為上述體視學(xué)參數(shù)的顯著增加(高于對(duì)照組和MC組)，且伴有明顯脊斷裂，提示線粒體腫脹與嵴破壞可能是卵巢癌后期改變的標(biāo)志。MC細(xì)胞線粒體由于體積較小，因而Nm、Vvm和Sv較對(duì)照組降低，其數(shù)量較多可能與MC患者機(jī)體代謝增強(qiáng)，組織耗氧增加有關(guān)[4]。

資料顯示，TJ的occludin與相鄰細(xì)胞通過(guò)外環(huán)以拉鏈形式相互結(jié)合而產(chǎn)生細(xì)胞旁封閉作用，N端對(duì)TJ裝配和屏障功能保持起重要作用，C端則與ZO-1直接相連，共同調(diào)節(jié)TJ的結(jié)構(gòu)變化[9]，不僅是TJ的關(guān)鍵組成部分，還控制與上皮瘤形成相關(guān)的表型變化[10]；ZO-1既是TJ的裝配平臺(tái)，也是occludin與細(xì)胞內(nèi)骨架連接及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要結(jié)構(gòu)[9,10]。有研究將致癌基因Raf-1 轉(zhuǎn)染至Pa-4細(xì)胞，導(dǎo)致了TJ功能完全喪失，并引起細(xì)胞生長(zhǎng)及調(diào)控異常以及occludin表達(dá)下調(diào)和ZO-1分布模式改變[10]。當(dāng)細(xì)胞癌變時(shí)，TJ異?？蓪?dǎo)致細(xì)胞極性改變，使細(xì)胞之間發(fā)生黏附、增殖與分化[11]。本研究中，TJ蛋白o(hù)ccludin和ZO-1在MC組表達(dá)增強(qiáng)(高于對(duì)照組)，而在SC組表達(dá)明顯降低，可能反映SC細(xì)胞極性破壞，膜通透性增強(qiáng)，也因此提示TJ蛋白可能作為調(diào)節(jié)因子而抑制腫瘤生長(zhǎng)，如Poff 等[12]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染occludin基因進(jìn)入腫瘤細(xì)胞,可影響腫瘤細(xì)胞表型,尤其是增加轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡因素的敏感性；抑制occludin也可能作用于TJ，直接或間接參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化,接收和傳授PKC和Rho蛋白質(zhì)等分子信號(hào),共同抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。

綜上，SC和MC線粒體超微結(jié)構(gòu)與體視學(xué)分析結(jié)果存在差異，TJ蛋白的occludin/ZO-1表達(dá)也各不相同，初步認(rèn)為巨線粒體改變的SC細(xì)胞TJ表達(dá)下調(diào)，而線粒體數(shù)量增多的MC細(xì)胞TJ表達(dá)較強(qiáng)，提示SC與MC兩種不同類型卵巢癌的病理改變可能與不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)，但其臨床生物學(xué)意義尚需進(jìn)一步探索。

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譚樹(shù)芬(1973-)，女，基諾族，學(xué)士，副教授，主要從事婦科腫瘤學(xué)研究

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Different of Mitochondrial Construction and Expression Abnormity of Tight Junction Protein in the Serous and Mucinous Ovarian Cystadenocarcinoma

TAN Shu-fen ,YANG Hong-ying, ZHANG Shao, ZHU Yin-jie

Department of Obstetrics and Gynecology,The 3rd Affiliated Hospital, Kunming Medical University,Kunming 650018, China

【Abstract】Objective: To investigate the mechanisms and the abnormal differences of mitochondrial construction and the tight junction (TJ) protein occludin/ZO-1 expression in serous ovarian cystadenocarcinoma (SC) and mucinous ovarian cystadenocarcinoma (MC).Method: 30 patients with ovarian cystadenocarcinoma in 15 cases for SC group (SC group), 15 cases of MC (MC), an alternate 3 cases of myoma of uterus controls (control group). The mitochondrial ultrastructure were observed by electron microscope.The number density of mitochondria (Nm), volume density (Vvm) and the outer membrane surface density (Sv) were detected by the stereology analytical method. The ovarian epithelial cell protein positive unit(PU)of occludin/ZO-1 and its power degree (expressed in integral density, IOD) of each group were detected by immunohistochemical method.Results: Under electron microscopy, there were no abnormal mitochondria and endoplasmic reticulum in the control group.Mitochondria of MC group was small in size, quantity was more,the mitochondria Nm, Vvm and Sv significantly lower than the control group (P< 0.05);SC group, mitochondrial volume, spinal fracture significantly, mitochondria Nm, Vvm and Sv MC group significantly increased (P<0.01).Immunohistochemical analysis showed that positive rate of occludin and ZO-1 in MC group was obviously higher than that of control group(24.23±4.74PU Vs 21.07±5.51PU，37.07±3.58PU Vs 20.46 ±4.89PU，P<0.05)，IOD significantly lower than the control group (72.39±9.86 Vs 92.38±7.17，73.51±6.86 Vs 80.34±7.04，P<0.05).Occludin and ZO - 1 in SC group were significantly lower than the control group(11.50±4.15PU Vs 21.07±5.51PU，16.24±3.61PU Vs 20.46 ±4.89PU，P<0.05),IOD was significantly higher than the control group(101.38±6.16 Vs 92.38±7.1，92.78±3.07 Vs 80.34±7.04，P<0.01).Conclusion: The mitochondria stereology characteristics of patients with SC and MC are obviously different,may be related to express abnormalities of occludin/ZO-1 with TJ proteins.

【Key words】Serous ovarian cystadenocarcinoma；Mucinous ovarian cystadenocarcinoma; Mitochondria ultrastructure;Stereology; Tight junctionprotein

作者簡(jiǎn)介：本文第一

[中圖分類號(hào)]R730.231

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1005-1740(2016)01-0010-04

*[基金項(xiàng)目]云南省教育廳科研基金(2010Y184)

[作者單位]昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦瘤科，昆明 650018

本文2015-10-12收到，2016-01-06修回