龔　正　龔　亮　呂培勇　張金敏,#　 張彩云　董傳江　羅　明　張　靜

gongzheng119898@163.com

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佛手黃酮對(duì)高脂血癥兔血脂及動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)危險(xiǎn)因子水平的影響*

龔正1龔亮2呂培勇1張金敏1,#張彩云1董傳江1羅明3張靜1

gongzheng119898@163.com

【摘要】目的：觀察佛手黃酮對(duì)高脂血癥兔血脂及動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)危險(xiǎn)因子的作用及機(jī)制。方法：28只新西蘭兔隨機(jī)分為四組：對(duì)照組、模型組、佛手黃酮組和氟伐他汀組，每組各7只。對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，模型組高脂飼料喂養(yǎng)，佛手黃酮組及氟伐他汀組在高脂飼料喂養(yǎng)基礎(chǔ)上，分別給予佛手黃酮100mg/kg/天灌胃及氟伐他汀10mg/kg/天灌胃。10周后采用ELISA等測(cè)量各組血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)水平，采用Western blotting檢測(cè)各組肝組織載脂蛋白E(ApoE)表達(dá)水平。 結(jié)果：與對(duì)照組比較，模型組TC、LDL-C顯著升高(P<0.01)，佛手黃酮組TC、LDL-C、MDA、IL-1β水平較模型組顯著降低(P<0.05)，NO和肝組織AopE蛋白表達(dá)較模型組顯著升高(P<0.05)；效果與氟伐他汀組相當(dāng)(P>0.05)。結(jié)論：佛手黃酮具有調(diào)節(jié)血脂和抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。

【關(guān)鍵詞】佛手黃酮；血脂；動(dòng)脈粥樣硬化；兔

佛手為蕓香科柑橘屬植物佛手的干燥果實(shí)，是我國(guó)道地藥材，從佛手果實(shí)中提取的佛手黃酮是一類具有還原性質(zhì)的黃酮類化合物，可抑制炎癥介質(zhì)的釋放，具有抗炎作用[1]，已廣泛應(yīng)用于治療冠心病、循環(huán)障礙等[2]。但佛手黃酮影響脂質(zhì)代謝、調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程的機(jī)制尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建新西蘭兔高脂血癥模型，檢測(cè)佛手黃酮對(duì)其血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和肝組織載脂蛋白E(ApoE)水平的影響，分析其抗高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)危險(xiǎn)因素的作用和可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組處理

28只雄性健康新西蘭兔 (湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物協(xié)會(huì)提供，合格證號(hào)003004)，購(gòu)自武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體重2.0-2.5kg，在宜昌市中心人民醫(yī)院動(dòng)物室飼養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為四組，對(duì)照組：喂基礎(chǔ)飼料(淀粉類64.44%、脂肪14.3%、蛋白質(zhì)21.06%、丙基硫氧嘧啶0.2%)；模型組：喂高脂飼料(豬油10%、蔗糖20%、雞蛋10%、標(biāo)準(zhǔn)飼料60%)；佛手黃酮組：喂高脂飼料+佛手黃酮(100mg/kg)；氟伐他汀組：喂高脂飼料+氟伐他汀(10mg/kg)。每組均7只。佛手黃酮組、氟伐他汀組均于每日上午10∶00 左右灌胃給藥1次，容量為10ml/kg，對(duì)照組和模型組均于每天相同時(shí)間灌胃等量生理鹽水。連續(xù)10周。各組動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，自由飲水，12h光照。

1.2主要藥物和試劑

佛手粉劑由三峽大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室提供，參照文獻(xiàn)[3]，采用70%乙醇提取法獲取黃酮，并配制成溶液(濃度為10mg/ml)。氟伐他汀膠囊購(gòu)自黑龍江肇東華富藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司(20mg/膠囊，批號(hào)：H10980227)，取出膠囊中氟伐他汀，用超純水溶解后，配制成溶液(濃度為1mg/ml)。TC、TG、LDL-C、HDL-C檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：080211)和NO檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：A013-2)、MDA檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：080521)均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；IL-1β試劑盒(批號(hào)：ab100577)購(gòu)自上海藍(lán)基生物公司；蛋白裂解液、PMSF Western blotting等試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；內(nèi)參GAPDH抗體、ApoE抗體、二抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司。

1.3觀察指標(biāo)和檢測(cè)方法

10周末，各組動(dòng)物禁食12h(不禁水)，采用20%烏拉坦從耳緣靜脈緩慢推注麻醉后，取頸靜脈血10ml，3 000r/min離心15min，分離血清，參照試劑盒說(shuō)明書，采用ELISA檢測(cè)各組血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、NO、MDA和IL-1β濃度之后，采用空氣栓塞法處死各組動(dòng)物，開腹取兔肝組織100mg剪碎后置EP管中，加0.6ml裂解液(裂解液中加入終濃度為100uM的PMSF，勻漿盒提前置入-80℃冰箱5min)，低溫30r/s勻漿3min，取出EP管，靜置10min，再4℃ 12 000g離心15min。參照文獻(xiàn)[4]采用Western blotting檢測(cè)ApoE 蛋白表達(dá)，采用Quantity one軟件分析條帶灰度值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成模及各組血脂水平

參照文獻(xiàn)所行高脂血癥造模，模型兔TC 水平高于正常值(1-2mmol/L) 3 倍且TG和LDL-C較對(duì)照組升高(P<0.05)，即造模成功[2](表1)。四組兔血清TC和LDL-C水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為86.85和13 725.68，P均<0.01)，四組血清TG和HDL-C水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值為0.63、1.41，P>0.05)。模型組血清TC和LDL-C較對(duì)照組顯著升高(t值分別為29.83和19.44，P均<0.01)。佛手黃酮組血清TC較模型組顯著下降(t值為5.11，P<0.01)，LDL-C與模型組無(wú)顯著性差異(t值為1.35，P>0.05)。氟伐他汀組血清TC亦較模型組顯著下降(t值為5.55，P<0.01)，LDL-C與模型組無(wú)明顯差異(t值為1.39，P>0.05)。氟伐他汀組TC和LDL-C血清水平與佛手黃酮組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為0.44、0.04，P>0.05)。見表1。

2.2各組血清NO、MDA和IL-1β水平

四組兔血清NO、MDA及IL-1β水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為1 083.55、12 450.10和38.66，P均<0.01)。模型組血清NO較對(duì)照組顯著降低(t值為5.59，P<0.01)，MDA及IL-1β較對(duì)照組顯著升高(t值分別為40.48和4.07，P均<0.01)。佛手黃酮組血清NO較模型組顯著升高(t值為10.86，P<0.01)、MDA及IL-1β水平較模型組顯著下降(t值分別為12.67、4.06，P均<0.01)。氟伐他汀組血清NO水平也較模型組升高(t值為10.73，P<0.01)，MDA及IL-1β也較模型組顯著下降(t值分別為12.34、4.05，P均<0.01)。佛手黃酮組與氟伐他汀組3指標(biāo)血清水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為0.28、0.33、0.01，P>0.05)。見表2。

表1　各組血清血脂水平比較均=7)

注: 與對(duì)照組比較,1)P<0.01,與模型組比較,2)P<0.01

表2　各組血清NO、MDA及IL-1β水平比較均=7)

注: 與對(duì)照組比較,1)P<0.01, 與模型組比較,2)P<0.01

2.3各組肝組織ApoE蛋白水平

四組兔肝組織ApoE蛋白表達(dá)水平(相對(duì)表達(dá)量)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值176.40，P<0.01)。模型組肝臟ApoE蛋白表達(dá)(2.10±0.30)較對(duì)照組(1.00±0.20)顯著升高(t值為1.90，P<0.05)；佛手黃酮組(5.80±0.70)較模型組顯著升高(t值為3.70，P<0.01)；氟伐他汀組(6.30±0.70)亦較模型組顯著升高(t值為4.20，P<0.01)；佛手黃酮組與氟伐他汀組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值為0.50，P>0.05)。見圖1。

3討論

佛手的化學(xué)成分主要是酮類、萜烯類、倍半萜烯類等生理活性物質(zhì)。佛手調(diào)節(jié)血脂的成分主要為黃酮類及苷類。藥理學(xué)證實(shí)，佛手具有保護(hù)高脂血癥所致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、鎮(zhèn)痛、抗凝或促凝 (與濃度有關(guān))、促進(jìn)血液循環(huán)、雙向調(diào)控免疫力等作用。黃酮類物質(zhì)可降低腸道吸收膽固醇的速率，增加飼喂高脂食物家兔糞便的膽固醇含量， 降低實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化家兔血清膽固醇水平[5]。另有報(bào)道[5, 6]，佛手中的不飽和脂肪酸、槲皮素均可降低血脂，防治動(dòng)脈粥樣硬化；6-十一烷醇有降低三酰甘油的作用；β-谷甾醇葡苷可作用于動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)的多種病理環(huán)節(jié)。本研究證實(shí)佛手中的主要化學(xué)成分黃酮可降低高脂血癥兔血清TC、LDL-C水平。

注: 與對(duì)照組比較, *P<0.05; 與模型組比較,#P<0.01

黃酮類物質(zhì)可通過(guò)抗氧化作用保護(hù)血管，發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。植物黃酮如淫羊藿總黃酮[7]及動(dòng)物黃酮如蜂膠黃酮[8]均有抗肝脂質(zhì)過(guò)氧化、增強(qiáng)SOD活性、減少氧自由基生成、降低MDA含量、顯著降低脂質(zhì)化參數(shù)、預(yù)防和治療高脂血癥等作用。

MDA作為脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，其大量蓄積可誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化[6]，本研究結(jié)果顯示，佛手黃酮可降低MDA水平，發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化效應(yīng)。

NO與內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激相關(guān)，NO合酶失調(diào)可引起NO代謝紊亂，誘發(fā)血管損傷及心臟疾病[10]。持續(xù)性血漿低濃度NO可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂[7]。有研究證實(shí)，麻醉犬靜脈注射葛根黃酮，可抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性，降低血管阻力，減輕心臟負(fù)荷量，增加腦血流量[12]。此外，黃酮可改善大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)，降低血液黏度，促進(jìn)血液循環(huán)[13]。黃酮類化合物可降低血管內(nèi)皮細(xì)胞羥脯酸的代謝，減少血管內(nèi)壁的膠原或膠原纖維含量，防止血小板黏附、凝集，阻止血栓形成，進(jìn)而防治動(dòng)脈粥樣硬化[7]。本研究發(fā)現(xiàn)佛手黃酮可升高高脂血癥兔血清中NO濃度，提示佛手黃酮可保護(hù)血管內(nèi)皮，促進(jìn)血管舒張功能的恢復(fù)，進(jìn)而拮抗動(dòng)脈粥樣硬化的內(nèi)皮損傷。

IL-1β是一種促炎因子，主要由巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞分泌。Denes等[8]發(fā)現(xiàn)，ApoE基因敲除合并IL-1β受體缺失小鼠，血清IL-1β濃度的升高，加速了動(dòng)脈粥樣硬化形成，使用IL-1β抗體后，動(dòng)脈炎癥減輕。本研究表明，佛手黃酮可降低模型兔炎癥性因子IL-1β水平，進(jìn)而抑制血管損傷，阻斷或延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。

ApoE主要由肝臟的實(shí)質(zhì)細(xì)胞合成，可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝過(guò)程，維持膽固醇代謝平衡[9]。ApoE基因敲除小鼠可出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化加速現(xiàn)象[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，灌服佛手黃酮后，兔肝臟ApoE蛋白表達(dá)升高，提示佛手黃酮可促進(jìn)肝臟合成ApoE蛋白，降低血脂，進(jìn)而抑制動(dòng)脈粥樣硬化。

綜上， 佛手黃酮可降低高脂血癥模型兔血脂水平，并調(diào)節(jié)高脂血癥環(huán)境下多種細(xì)胞因子及蛋白的表達(dá)，具有良好的血管保護(hù)作用，可能是動(dòng)脈粥樣硬化臨床治療的一種新選擇。

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龔正(1978-)，男，漢族，博士，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)楦哐{(diào)節(jié)

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The Effect of Total Flavonoids from Bergamot on Blood Lipid and Atherosclerosis Related Risk Fators in Hyperlipidemia Rabbits

GONG Zheng1, GONG Liang2, LV Pei-yong1, ZHANG Jin-ming1，#, ZHANG Cai-yun1, DONG Chuan-jiang1, LUO Ming3, ZHANG Jing1

1Yichang Center People's Hospital, Yichang 443003;2Department of Clinical Laboratory, Yicheng People's Hospital, Yicheng 441400；3Guangxi Yulin Traditional Chinese Medicine Hospital, Yulin 537000, China;#Corresponding author

【Abstract】Objective: To explore the effect and mechanism of total flavonoids from bergamot on hyperlipidemia and atherosclerosis in rabbits.Method: 28 rabbits were randomly divided into four groups: control group, model group, total flavonoids from bergamot group and fluvastatin group, every group was 7cases. Rabbits in control group were fed with nomal food, the other three groups were fed with high-fat food, and rabbits in the total flavonoids from bergamot and fluvastatin group were intragastricaly administrated with corresponding drug at dose of 100mg/kg and 10mg/kg daily, respectively. After 10 weeks, serum TC, TG, LDL-C, HDL-C, NO, MDA and IL-1β were deteaed, as well as aopE in liver was tested by Western blotting.Results: Compared with the control group, the levels of TC and LDL-C in model group were significantly increased (P<0.05). Compared with the model group, the levels of TC, LDL-C、MDA and IL-1β in total flavonoids from bergamot group were significantly decreased (P<0.05), while the NO and the expression of AopE protein in liver tissue were significantly increased (P<0.05), the effect of this group was comparable with the fluvastatin group (P>0.05).Conclusion: Total flavonoids from bergamot can inhibit hyperlipidemia and atherosclerosis.

【Key words】Total flavonoids from bergamot; Blood lipid; Atherosclerosis; Rabbit

作者簡(jiǎn)介：本文第一

[中圖分類號(hào)]R543.5R282

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1005-1740(2016)01-0014-04

*[基金項(xiàng)目]湖北省衛(wèi)計(jì)委科研基金(WJ2015MB173)；宜昌市醫(yī)療衛(wèi)生科研基金(A14301-05) ； 宜昌市中心人民醫(yī)院科研發(fā)展基金(KFJ2013009)

本文2015-06-26收到，2015-12-21修回