韓秀秀,馬　斌

( 北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700)

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缺血性中風病急性期泛素融合降解蛋白的臨床意義

韓秀秀,馬斌*

( 北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700)

摘要：在腦缺血發(fā)生的急性期，缺血、缺氧的程度越嚴重，神經(jīng)元細胞死亡越多，細胞內(nèi)重要非溶酶體蛋白水解途徑泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)功能受損越嚴重，泛素融合降解蛋白(UFD1)是UPS的重要組成部分，其作為與神經(jīng)細胞凋亡相關的生物學指標則表現(xiàn)的相關性就越強，UFD1可能與缺血性中風病急性期神經(jīng)功能缺損程度及證候程度、證候變化密切相關。在缺血性中風病急性期動態(tài)監(jiān)測血清UFD1變化時同步利用美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)、缺血性中風證候評價量表進行中風病疾病、證候療效動態(tài)評價，探討生物學指標UFD1血清水平與NIHSS評分、證候評分的相關性,即可明確UFD1在中風病急性期中“病證”療效評價中的價值。

關鍵詞：泛素-蛋白酶體系統(tǒng)；泛素融合降解蛋白；缺血性中風

近年來，人們通過對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)選擇性降解的主要途徑泛素化-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)機制的深入研究，發(fā)現(xiàn)其在諸多細胞功能中起著重要作用，如參與細胞凋亡、抗原遞呈、細胞周期以及細胞內(nèi)信號傳導等過程[1]。目前，UPS與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關系逐漸被揭示，已明確UPS參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程,其功能障礙與多種神經(jīng)退行性疾病以及腦卒中等的發(fā)病有關。泛素融合降解蛋白(UFD1)作為UPS中不可或缺的重要組成成分在其作用過程中發(fā)揮重要作用，UFD1血清水平是否與神經(jīng)元細胞死亡的病理過程相關仍是未知。缺血性中風病急性發(fā)作時大量神經(jīng)元細胞死亡，探究UFD1血清水平變化對于能否把其作為缺血性中風急性期的生物學指標關系重大，也是進一步探討UFD1與缺血性中風病急性期不同證候表型間相關性的重要證據(jù)。

1UFD1與UPS的作用

UPS是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)選擇性、特異性降解的ATP依賴性非溶酶體蛋白水解途徑，主要降解不穩(wěn)定蛋白成分[2]，如錯誤折疊的蛋白質(zhì)、不需要的或外來的蛋白成分等，并調(diào)節(jié)細胞的代謝、分化和增殖等生理過程，是細胞內(nèi)的高效“清道夫”。其組成主要包括:泛素、泛素激活酶E1、泛素偶聯(lián)酶E2、泛素連接酶E3、泛素識別因子UFD1、26S蛋白酶體、泛素解離酶[3]等。UFD1作為泛素識別因子,能夠特異性的識別靶向蛋白上泛素的特殊蛋白質(zhì)[4],是一種含有76個氨基酸的多肽。UPS對靶向蛋白質(zhì)的降解過程主要有3個階段：1)蛋白泛素化；2)UFD1介導；3)26s蛋白酶體進行降解并釋放泛素。

1．1底物蛋白泛素化泛素需要通過E1、E2、E3三步酶的級聯(lián)反應與底物蛋白共價結(jié)合，以完成底物蛋白的泛素化修飾。在ATP的作用下，首先泛素活化，進而E1、泛素形成泛素-E1中間體，然后E1將活化的泛素傳遞給E2，最后E3將結(jié)合E2的泛素連接到靶向蛋白上，從而完成底物蛋白泛素化的過程[5]。

1．2UFD1的介導UFD1特異性的識別底物蛋白上的泛素從而將泛素化的底物蛋白送至26S蛋白酶體催化中心。通過對哺乳動物的UFD1蛋白功能分析發(fā)現(xiàn)其N端為連接泛素結(jié)合位點，C端為Npl4蛋白、p97蛋白結(jié)合位點，三者結(jié)合形成p97-UFD1-Npl4三元復合體，這樣能更加穩(wěn)定的固著泛素-單體泛素或聚合泛素，以介導泛素化底物蛋白至26S蛋白體催化中心降解[6]。

1．326S蛋白酶體對底物蛋白的降解26S蛋白酶體為ATP依賴型蛋白水解復合體，包含一個圓柱形的20S核心蛋白酶體和兩個V形19S調(diào)節(jié)顆粒[7]。19S調(diào)節(jié)顆粒負責拆開折疊的底物蛋白，釋放泛素，并引導底物蛋白到20S蛋白酶體降解。20S蛋白酶則將底物蛋白降解成氨基酸和短肽并將之輸出，至此完成底物蛋白的降解。

2UFD1、UPS與缺血性中風病急性期的關系

在感染、炎癥、基因突變等多種病理狀態(tài)或高溫、氧化、紫外線暴露等各種環(huán)境刺激時，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)會發(fā)生變性或錯誤折疊，因此需降解的底物蛋白增加，UPS通過及時上調(diào)底物蛋白泛素化進程和蛋白酶體活性來清除損傷蛋白，從而維持細胞代謝和功能平衡[8]；但是持續(xù)或劇烈的應激刺激產(chǎn)生的大量活性氧(ROS)、活性脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物等，或其他病理過程導致ATP供應中斷，均可使敏感依賴ATP的蛋白酶體如26S蛋白酶體失活，引起UPS降解蛋白質(zhì)的功能障礙，從而導致細胞內(nèi)泛素化結(jié)合蛋白的堆積[9]。與此同時,變性及錯誤折疊蛋白在細胞內(nèi)大量聚集與沉淀形成的巨大泛素化聚合物難以被蛋白酶體水解，從而聚集在早幼粒細胞白血病蛋白(PML)核體和中心體附近，產(chǎn)生神經(jīng)毒性影響細胞正常功能，最終導致細胞死亡[10]。研究表明，在氧化應激、炎癥反應或者其他病理條件下，多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括PD、AD[11]、HD[12]、ALS[13]和缺血性腦血管疾病[14-15]等，均觀察到了細胞內(nèi)泛素化蛋白異常堆積的現(xiàn)象。

缺血性腦血管病急性發(fā)病時UPS功能障礙可能與ATP耗竭、氧化應激反應、炎癥反應、信號傳導等有關。由于腦組織能量儲存匱乏，在缺血性腦血管病急性發(fā)病時腦組織的氧在8～12 s耗盡，ATP或磷酸肌酸在2 min內(nèi)耗盡并出現(xiàn)合成障礙，從而影響ATP依賴性蛋白酶體的蛋白降解功能。氧化應激損傷是大腦缺血性損傷的重要原因,產(chǎn)生的大量ROS嚴重影響蛋白酶體功能。此外腦缺血時觸發(fā)的炎癥反應及信號傳導功能均能降低UPS對損傷蛋白的降解，從而泛素化底物蛋白大量堆積致使神經(jīng)元細胞死亡，發(fā)生局灶性神經(jīng)功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死急性期采用蛋白酶體抑制劑PS-519可明顯減輕缺血性腦損傷[16]。目前，研究證實作為UPS的介導因子UFD1在人死后及大腦損傷模型中其腦脊液水平顯著升高，同時發(fā)現(xiàn)腦組織梗死后UFD1的血清水平上升[17]。

3UFD1與缺血性中風病急性期證候演變

中醫(yī)學中疾病病程雖然沒有進行明確的時間點界定，但根據(jù)病情、證候的演變認為不同階段具有不同的病機特點。多項關于中風急性期證候演變的研究表明，中風病急性期的不同時點證候具有一定的規(guī)律，痰證在急性期始終占有重要位置，但風證在3 d后出現(xiàn)頻率逐漸下降，痰證在7 d后逐漸下降，氣虛證長期穩(wěn)定存在甚至在14 d后越來越明顯[18-19]。近來研究發(fā)現(xiàn)，將實驗性腦出血(ICH)大鼠處死后進行蛋白免疫印跡分析，結(jié)果顯示，灶周細胞大量多聚泛素化蛋白堆積，并呈現(xiàn)明顯的時間相關性，在第3天、第7天達到高峰[20]。

中風病急性期的證候演變和實驗性腦出血的小鼠實驗中，灶周細胞堆積的泛素化蛋白同樣呈現(xiàn)了明顯時間相關性，但是在缺血性中風中，灶周細胞堆積的泛素化蛋白及UFD1表達是否具有時間相關性仍是未知，如果UFD1的表達呈現(xiàn)明顯的時間相關性，在缺血性中風病急性期的橫向觀察中，不同證候的人群中UFD1的表達亦可表現(xiàn)出明顯的證候相關性?？梢酝ㄟ^對缺血性中風病急性期人群進行縱向橫向雙重觀察以探尋UFD1與缺血性中風病的關系，這對于UFD1是否可稱為缺血性中風病的證候診斷性指標具有重大意義。

4UFD1與中風病病情評估和證候療效評價

目前中風病“病證結(jié)合”的臨床療效評價模式已逐漸被中醫(yī)界廣泛認可，即對中風病進行疾病層面、證候?qū)用妗半p層次”的臨床療效評價。疾病層面：采用目前西醫(yī)較為成熟的療效評價指標，如美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)、日常生活能力量表(ADL)[21]等；證候?qū)用妫憾嗖捎谩叭毖灾酗L病證結(jié)合的診斷標準與療效評價體系研究”(973計劃)的代表性成果“缺血性中風證候要素診斷量表和缺血性中風證候評價量表”[22]。盡管在臨床中上述量表的聯(lián)合使用在一定程度上提高了證候評價的客觀性，但是仍然缺乏客觀可量化、準確性強的生物學指標的輔助評價，因此仍需要篩選證候相關性強、并與疾病病理演變過程密切相關的生物學指標以完善中風病的臨床療效評價指標體系。

目前研究已證實，UFD1在腦梗死發(fā)病3 h內(nèi)血清水平升高，對腦梗死的疾病診斷具有一定價值，但是，伴隨疾病發(fā)展，缺血、缺氧程度的加重，神經(jīng)元細胞死亡增加，UFD1作為與神經(jīng)細胞凋亡相關的生物學指標表現(xiàn)的相關性就越強，但是否UFD1與缺血性中風病急性期神經(jīng)功能缺損程度及證候程度相關仍是未知。因此可在缺血性中風急性期動態(tài)監(jiān)測血清UFD1變化時同步利用上述評價量表進行中風病疾病、證候療效動態(tài)評價，探尋UFD1在中風病急性期中“病證”療效評價中的價值。這將為把UFD1納入中風病臨床療效評價體系中提供重要證據(jù)。

5總結(jié)

由于中醫(yī)臨床療效多是通過干預證候以達到治療疾病或改善癥狀的目的,因此證候療效評價是中醫(yī)臨床療效評價的核心和特色之處。尋找與證候相關的特異性、敏感性生物學指標，評估其在中風病病情程度、證候輕重評價中的價值，是建立包含生物學指標在內(nèi)的中醫(yī)臨床療效評價指標體系的關鍵環(huán)節(jié)。由于UPS功能障礙與神經(jīng)元細胞死亡密切相關,UFD1血清水平在腦組織梗死后升高,因此應積極探索其在缺血性中風病急性期不同證候表型中表達差異和動態(tài)變化，尋找將UFD1作為缺血性中風病急性期證候表型或中風病臨床療效評價性生物學指標的相關證據(jù)，這將對構(gòu)建客觀、準確的中風病中醫(yī)臨床療效評價體系做出貢獻。

參考文獻：

[1]MUKHOPADHYAY D,RIEZMAN H.Proteasome-independent functions of ubiquitin in endocytosis and signaling[J].Science,2007,315(589):201-205.

[2]BJ?RK?Y G,LAMARK T,JOHANSEN T.p62/SQSTM1:a missing Link between protein aggregates and the autophagy machinery[J].Autophagy,2006,2(2):138-139.

[3]PETROSKI M D.The ubiquitin system,disease,and drug discovery[J].BMC Biochemistry,2008,9(Suppl 1):s7.

[4]JOHNSON E S,MA P C,OTA I M,et al.A PROTEOLYTIC PATHWAY THAT RECOGNIZES UBIQUITIN AS A DEGRADATION SIGNAL[J].Journal of Biological Chemistry,1995,270(29):17442-17456.

[5]吳慧娟,張志剛.泛素-蛋白酶體途徑及意義[J].國際病理科學與臨床雜志,2006,26(1):7-10.

[6]YE Y,MEYER H H,RAPOPORT T.Function of the p97-Ufd1-Npl4 complex in retrotranslocation from the ER to the cytosol:dual recognition of nonubiquitinated polypeptide segments and polyu-biquitin chains[J].Cell Biol:,2003,162(1):71-84.

[7]GLICKMAN M H,CIECHANOVER A,RAPPAPORT B.The ubiquitin-proteasome proteo-lytic pathway:destruction for the sake of construction[J].Physiological Reviews,2002,82(2):373-428.

[8]SHANG F,DENG G J,LIU Q,et al.Lys(6)-modified ubiquitin inhibits ubiquitin-dependent protein degradation[J].Journal of Biological Chemistry,2005,280(21):20365-20374.

[9]DUDEK E J,SHANG F,LIU Q,et al.Selectivity of the ubiquitin pathway for oxidatively modified proteins:relevance to protein precipitation diseases[J].FASEB Journal,2005,19(10):1707.

[10]HEGDE A N,UPADHYA S C.Role of ubiquitin-proteasome-mediated proteolysis in nervous system disease[J].Biochimica et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms,2011,1809(2,SI):128-140.

[11]VAN LEEUWEN F W,DEKLEIJN D P,VANDENHURK H H,et al.Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer's and Down patients[J].Science,1998,279(5348):242-247.

[12]DAVIES S W,TURMAINE M,COZENS B A,et al.Formation of neuronal intranuclear inclusions underlies the neurological dysfunction in mice transgenic for the HD mutation[J].Cell,1997,90(3):537-548.

[13]JOHNSTON J A,DALTON M J,GURNEY M E,et al.Formation of high molecular weight complexes of mutant Cu,Zn-superoxide dismutase in a mouse model for familial amyotrophic lateral sclerosis[J].Proceedings of the National Academy of Sciences:2000,97(23):12571-12576.

[14]HU B R,MARTONE M E,JONES Y Z,et al.Protein aggregation after transient cerebral ischemia[J].Journal of Neuroscience,2000,20(9):3191-3199.

[15]HU B-r,JANELIDZE S,GINSBERG M D,et al.Protein aggregation after focal brain ischemia and reperfusion[J].Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism,2001,21(7):865-875.

[16]SALMINEN A,LIU P K,HSU C Y.Alteration of transcription factor binding activities in the ischemic rat brain[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,1995,212(3):939-944.

[17]耿曉娟,張軍平,高穎,等.缺血性中風病急性期證候變化規(guī)律研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2010,25(9):1485-1487.

[18]張華,高穎.缺血性中風證候演變與神經(jīng)功能缺損的相關性研究[J].北京中醫(yī)藥大學學報,2007,30(4):274-278.

[19]靳航.自噬與泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在實驗性腦出血灶周組織損傷中作用的研究[D].長春:吉林大學,2013.

[20]張伯禮,王玉來,高穎,等.中風病急性期綜合治療方案研究與評價——附522例臨床研究報告[J].中國危重病急救醫(yī)學,2005,17(5):259-263.

[21]周莉,高穎,鄒憶懷.綜合治療方案治療缺血性中風急性期41例臨床觀察[J].北京中醫(yī)藥大學學報,2006,29(1):47.

[22]高穎,馬斌,劉強,等.缺血性中風證候要素診斷量表編制及方法學探討[J].中醫(yī)雜志,2011,52(24):2097-2100.

Tbquitin Fusion degradation protein in acute ischemic stroke

HAN Xiuxiu,MA Bin*

(Dongzhimen Hospital of Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100700,China)

Abstract：During the period of acute cerrebral ischemia,the more serious the degree of hypoxia-ischemia,the more neuronal cells would die and the more impaired of ubiquitin-proteasome system (UPS).Ubquitin fusion degradation protein(UFD1)-an important component of UPS-is a biomarker related to cell death,so UFD1 maybe correlated to the degree of nerve function defect and TCM syndromes in acute ischemic stroke.Thereby,we monitor serum UFD1 dynamicly at the same time evaluate effect of stroke disease,syndrome with “National Institute of Health Stroke Scale(NIHSS)” and “Ischemic Stroke TCM Syndrome Factor Diagnostic Scale(ISTSFDS)”.Analyzing the relation between UFD1 and NIHSS scores,TCM syndrome scores and we could clear the value of UFD1 in efficacy evaluation of acute ischemic stroke.

Keywords：UPS;UFD1;ischemical stroke

(收稿日期:2015-04-11)

文章編號：2095-6258(2016)01-0165-04

中圖分類號：R255.2

文獻標志碼：A

*通信作者：馬斌，碩士研究生導師，電話-(010)84013148,電子信箱-mabin0352@126.com

作者簡介：韓秀秀(1989-)，女，碩士研究生，主要從事中醫(yī)內(nèi)科腦病學研究。

基金項目：國家自然科學基金項目(81173230)。

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.01.058

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