蕎麥蛋白肽研究進展及展望

郭 洪，李云龍

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，山西太原 030031）

蕎麥蛋白肽研究進展及展望

郭 洪，*李云龍

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，山西太原 030031）

蕎麥是一種集營養(yǎng)與保健為一體的糧食作物，營養(yǎng)豐富、蛋白質(zhì)含量較高，是優(yōu)良的蕎麥蛋白肽來源。通過綜述國內(nèi)外近年來對蕎麥活性肽的制備、分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和生物活性的研究，展望了蕎麥活性肽的應(yīng)用前景，以期為蕎麥活性肽的研發(fā)和利用提供參考。

蕎麥；蛋白肽；生物活性

蕎麥在世界范圍內(nèi)廣泛種植，特別是中國、俄羅斯及歐洲等地的冷涼高原和山區(qū)，甜蕎和苦蕎是常見的品種，其功能成分包括蛋白質(zhì)、黃酮類、D-手性肌醇等。其中，蕎麥蛋白質(zhì)中氨基酸種類全面、配比得當，尤其富含賴氨酸、精氨酸等必需氨基酸成分，營養(yǎng)價值與雞蛋、牛奶等相當，具有多種生理保健活性。研究表明，蕎麥蛋白對多種慢性病有治療功效，特別是高血壓、高血脂、高血糖和肥胖等。蕎麥蛋白肽具有比蕎麥蛋白更好的理化性質(zhì)，如對熱穩(wěn)定、無免疫原性，可由腸道直接吸收，且速度快、吸收率高。通過降解制備的蕎麥多肽具有抗氧化活性、抗衰老和抗疲勞、調(diào)節(jié)血脂和血糖、抑制脂肪蓄積、抑制膽結(jié)石以及抗腫瘤等生物學(xué)功效。深入研究蕎麥蛋白水解特性及其水解物中小分子肽的功能活性，對于開發(fā)新的具有特殊生物活性的小分子活性肽產(chǎn)品、有效利用蕎麥蛋白資源、擴大蕎麥蛋白的應(yīng)用領(lǐng)域均具有重要作用。

1 蕎麥蛋白活性肽制備方法

生物活性肽是蛋白質(zhì)經(jīng)過特征酶降解后產(chǎn)生的具有顯著生物學(xué)活性的數(shù)個氨基酸組成的肽類混合物，具有多種人體代謝和生理調(diào)節(jié)功能[1]。生物活性肽的制備方法和途徑主要有3種[2-5]：①從自然界的生物體中提取天然活性肽類；②采用合成的方法制備生物活性肽；③通過蛋白酶水解獲得活性肽。生物體內(nèi)的生物活性肽含量低，直接提取成本很高，殘存的溶劑具有毒性；化學(xué)合成試劑價格高，常用于合成附加值高、中等長度的醫(yī)藥用肽[6]；蛋白酶水解法條件溫和，且沒有有毒化學(xué)品的殘留，在實踐中得到了廣泛的應(yīng)用。

早在1993年，日本學(xué)者利用一系列蛋白酶水解蕎麥蛋白質(zhì)，得到一種結(jié)構(gòu)與響尾蛇毒素十分相似的三肽，可顯著抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的活性，而使血壓下降[7]。目前，對酶解的系統(tǒng)性研究還很欠缺。崔霞等人[8]研究了2種蛋白酶（中性蛋白酶、堿性蛋白酶）水解苦蕎麥蛋白制備生物活性肽，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶的水解效果較好，并最終確定了堿性蛋白酶水解苦蕎蛋白的最佳工藝條件。李紅敏等人[9]利用木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶分別水解苦蕎蛋白復(fù)合物，對各種酶的水解條件進行了優(yōu)化，并比較了酶解液的抗氧化性，研究發(fā)現(xiàn)制備蕎麥多肽的適宜酶為堿性蛋白酶，而復(fù)合蛋白酶水解得到的水解產(chǎn)物抗氧化性最強。豐凡[10]利用木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶分別水解蕎麥制備蕎麥多肽，并且得到了最佳工藝條件。田斌等人[11]采用中性蛋白酶對蕎麥蛋白進行水解，得出最佳酶解條件為加酶量5 000 U/g，底物質(zhì)量濃度40 g/mL，溫度50℃，pH值7.5，酶解時間2 h。Tang C H等人[12]將蕎麥蛋白進行酶解處理后，研究了其水解產(chǎn)物的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)蕎麥多肽有極強的抗氧化活性，能有效抑制亞油酸過氧化。王興等人[13]通過體外模擬部分胃腸道消化過程，結(jié)果顯示經(jīng)模擬消化10 h產(chǎn)生的多肽抗氧化活性強，經(jīng)電泳分離顯示抗氧化活性最強的多肽分子量是900 Da。

2 蕎麥蛋白肽分離純化及鑒定方法

2.1 超濾法

超濾是一種有效的物理分離方法，能夠?qū)⑷芤簝艋?、分離或者濃縮，對于生物活性大分子、蛋白質(zhì)、DNA、高分子化合物等具有很強的分離能力，其高效、節(jié)能的優(yōu)點已被廣大生產(chǎn)者所認同。其常用的操作模式是將將底物通過使用不同截留分子質(zhì)量的超濾膜進行產(chǎn)物分級，并研究分離產(chǎn)物的功能性。

在超濾技術(shù)分級分離的過程中發(fā)現(xiàn)，由于溶質(zhì)在膜面析出，造成膜的不可逆污染以及濃差極化過大，最終使蛋白質(zhì)損失，成為制約超濾技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵因素，采用攪拌和旋轉(zhuǎn)膜相結(jié)合的模式可有效緩解上述現(xiàn)象。此外，溶液的pH值也會影響滲透通量（Permeate flux），研究發(fā)現(xiàn)在pH值為7時可獲得最大的滲透通量，等電點時滲透通量最低。

2.2 柱層析

柱層析是最近幾十年來發(fā)展很快的高效分析分離技術(shù)?？梢愿鶕?jù)各種層析技術(shù)的原理，選用一種或幾種方法進行蕎麥肽的純化。用于蕎麥肽分離凝膠層析的型號主要有SephadexG-15，SephadexG-25，Bio-Gel P2。邢健等人[14]采用超高壓液相色譜（UPLC），通過線性梯度洗脫，從眾多組分中分離出單一的短肽成分。Christa K等人[15]采用柱前衍生反相高效液相色譜（RP-HPLC）對多酶復(fù)合水解后蕎麥蛋白肽進行分離分析，確定了一系列具有顯著清除DPPH自由基能力的氨基酸序列片段。

2.3 鑒定方法

多肽的分析檢測主要是通過色譜分離技術(shù)（如柱層析、HPLC分離純化、毛細管電色譜）和毛細管電泳技術(shù)將多肽分離純化后進行檢測研究，檢測手段包括柱前衍生反相高效液相色譜（RP-HPLC）、毛細管電泳質(zhì)譜（CE-MS）分析等。近年來，隨著分析儀器技術(shù)的進步，快原子轟擊質(zhì)譜（FAB-MS）、電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）、基質(zhì)輔助的激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）等都已經(jīng)應(yīng)用于蛋白質(zhì)多肽的檢測中。Ma Y等人[16]采用堿抽提和等電點沉淀法提取蕎麥蛋白后，用反相高效液相色譜（RP-HPLC）分離純化得到單一多肽，并用質(zhì)譜串聯(lián)（MS-MS）進行了定性分析。

3 蕎麥蛋白肽生物活性

3.1 抑菌作用

國外學(xué)者已經(jīng)從蕎麥中獲得了有抑菌作用的活性肽。蕎麥抑菌肽存在于蕎麥的種子、麩皮和皮殼中，具有廣譜抑菌效應(yīng)。Thomma B P等人[17]的研究表明，植物抑菌肽大多具有45～54個氨基酸殘基且由4個二硫鍵連接。Fujimura M等人[18]從蕎麥中分離到2種抑菌肽，命名為Fa-AMP1和Fa-AMP2，均由4個二硫鍵連接的40個氨基酸殘基構(gòu)成。植物抑菌肽在二級結(jié)構(gòu)上由3段反平行的β折疊和1個α螺旋組成，這與人體防御素、昆蟲防御素相似。結(jié)構(gòu)的相似性決定生理功能相似。抑菌肽通過將α螺旋插入微生物細胞膜，造成膜表面滲漏缺陷而殺死病原菌[17]。Fujimura M等人[18]的研究結(jié)果顯示，F(xiàn)a-AMP1和Fa-AMP2對革蘭氏陽性菌-密西根棒形桿菌（Clavibacter michiganesis）和萎蔫短小桿菌（Curtobacterium flaccumfaciens），革蘭氏陰性菌-軟腐?。‥rwinia cartovora）、放射形土壤桿菌（Agrobacterium radiobacter） 和毛根土壤桿菌（Agrobacterium rhizogenes） 以及真菌-尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum） 和白地霉菌（Gotrichum candidum） 都表現(xiàn)出抑制其增殖生長和廣譜抗菌的特性。

3.2 胰蛋白酶抑制作用

蕎麥蛋白的氨基酸種類全面、配比得當，具有很高的營養(yǎng)價值，然而由于蛋白酶抑制因子、單寧和膳食纖維等抗營養(yǎng)因子的存在，降低了其在胃腸道中的利用率。Kiyohara T等人[19]的研究指出，蕎麥胰蛋白酶抑制劑分為2類，即穩(wěn)定性抑制菌和暫時性抑制菌。前者由51～67個氨基酸殘基構(gòu)成，在N-末端存在亮氨酸殘基；而后者由85～99個氨基酸殘基構(gòu)成，在N-末端存在絲氨酸殘基。Oparin P B等人[20]的研究說明，胰蛋白酶抑制劑分子內(nèi)存在的二硫鍵對于其功能是必不可少的。胰蛋白酶抑制劑在經(jīng)過離子交換色譜后分為陽離子和陰離子，均表現(xiàn)出對胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的抑制效應(yīng)，這也解釋了蕎麥食品在胃腸道中消化率較低的原因。除了抗營養(yǎng)效應(yīng)外，蕎麥蛋白抑制劑還表現(xiàn)出對艾滋病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶和癌細胞的抑制效應(yīng)。

3.3 抗腫瘤作用

研究表明，蕎麥中含有的胰蛋白酶抑制劑通過降低組織器官周邊的蛋白酶活性達到抑制癌變細胞擴散，從而實現(xiàn)抗腫瘤效果。Park S S等人[21]的研究認為，BWI-1和BWI-2a能夠抑制人類T細胞型白血病細胞群的活性，并且能夠激活細胞程序性死亡的DNA序列使得腫瘤細胞凋亡。通過MTT比色法和流式細胞儀法分析，重組蕎麥蛋白抑制劑能夠抑制IM-9細胞、HL-60細胞以及HeLa細胞的增殖；進一步的研究表明，這一過程是通過線粒體凋亡路徑實現(xiàn)的，并且在此過程中與胰蛋白酶抑制劑的構(gòu)象變化有關(guān)。Guo X等人[22]從蕎麥水溶蛋白分離到1個名為TBWSP31的多肽，相對分子質(zhì)量為57 000 Da。研究發(fā)現(xiàn)，TBWSP31通過上調(diào)細胞凋亡基因Fas和下調(diào)細胞凋亡基因BLC-2，引起人乳腺癌細胞株Bcap37G0/G1細胞周期阻滯，實現(xiàn)抑制腫瘤增殖的效果，同時該調(diào)控過程存在時間效應(yīng)和劑量效應(yīng)。另外的研究表明，與膳食纖維類似，蕎麥蛋白的生理活性與其低消化性有關(guān)。通過喂食模型鼠蕎麥蛋白降低血清雌二醇的含量，從而延緩乳腺癌病程；還有研究表明，喂食蕎麥蛋白能夠抑制結(jié)腸癌模型鼠中C-myc蛋白和C-fos蛋白的表達，同時抑制癌細胞的增殖[23]。

3.4 對高膽固醇和肥胖的抑制作用

Kayashita J等人[24]的研究證明，蕎麥蛋白提取物能夠降低模型鼠中的血漿膽固醇水平，這可能與蕎麥蛋白中獨特的氨基酸配比有關(guān)，與其他蛋白質(zhì)相比，蕎麥蛋白的賴氨酸與精氨酸比例較低。周小理等人[25]采用硫酸銨鹽析法、葡聚糖凝膠-瓊脂糖快速離子交換層析法制備了苦蕎水溶性蛋白，研究其對膽酸鹽的吸附作用。結(jié)果顯示，對膽酸鹽、脫氧膽酸鹽的吸附率都超過了90%，由此證實了苦蕎水溶性蛋白的降血脂功能。蕎麥蛋白可消化性較低，當未降解的蕎麥蛋白進入胃腸道時，膽汁酸與其結(jié)合形成中性固醇隨糞便排出，這一過程刺激了由膽固醇到膽汁酸的合成，從而降低了膽固醇的濃度；其機理可能與蕎麥蛋白能夠降低膽固醇吸收蛋白和?；D(zhuǎn)移酶的活性有關(guān)。與酪蛋白和大豆蛋白相比，蕎麥蛋白對于降低血液膽固醇、低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白的效率更高。通過降低肝脂肪合成酶的活性進而降低甘油三酯的濃度，從而達到減肥降體重的目的。

3.5 降血壓作用

腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）在血壓調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著十分重要的作用，通過將血管緊張素轉(zhuǎn)化酶-I轉(zhuǎn)化為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶-II的方式來升高血壓。Guang C等人[26]的研究表明，來源于蕎麥的短肽能夠抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶-I的活性，這些短肽大多數(shù)由2～5個氨基酸殘基組成。Li C H等人[27]從蕎麥蛋白水解液中分離出了降血壓肽；Koyama M等人從蕎麥芽中分離并純化得到降血壓肽；隨后的動物試驗顯示，其在原發(fā)性高血壓大鼠降血壓方面有顯著作用。Cheung H S等人的研究認為，短肽羧基端的脯氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸殘基與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶-I的活性中心結(jié)合，能夠產(chǎn)生明顯的降血壓作用，來源于蕎麥降血壓肽類的羧基端，均含有上述氨基酸殘基。

3.6 降血糖作用

流行病學(xué)顯示，食用蕎麥食品能夠起到降“三高”（高血壓、高血糖、高血脂）的效果。蕎麥中降血糖的成分主要是D-手性肌醇、黃酮類以及蕎麥蛋白，以蘆丁為代表的黃酮類物質(zhì)能夠清除人體的活性氧，而活性氧可能會引起糖尿病以及誘發(fā)對胰島細胞的損傷。試驗證實，通過增加抗氧化酶的活性和清除活性氧等途徑，攝入體內(nèi)的蕎麥蛋白能夠用于治療糖尿病。崔霞等人[8]采用堿性蛋白酶提取到相對分子質(zhì)量在100～1 000 U的低分子量活性肽，動物試驗表明其能夠有效抑制體外脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的發(fā)生，對四氧嘧啶所致糖尿病起到降低血糖的作用。Ma Y等人的研究表明，相對于將蕎麥蛋白與胃蛋白酶和胰蛋白酶混合酶解的產(chǎn)物而言，2～5個氨基酸殘基組成的短肽具有更強的抗氧化活性。因此，有可能將這些短肽制成藥品用于脂代謝異常和糖尿病的臨床治療。

4 展望

蕎麥在全世界廣泛種植，蛋白中氨基酸種類全面、配比得當，其所含的活性肽功能營養(yǎng)因子受到人們的廣泛關(guān)注。當前，國內(nèi)外對蕎麥蛋白活性肽的制備、純化、結(jié)構(gòu)鑒定和生物活性等方面研究取得了很大進展，在降血壓、抗氧化、抑菌、抗腫瘤等方面也發(fā)現(xiàn)了生物活性。同時，進行橫向比較發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)外對蕎麥肽的研究成果遠不及對大豆肽、花生肽等植物蛋白來源的活性肽研究。蕎麥活性肽的研究主要局限在其酶解工藝上，大部分研究成果只是獲得了具有一定生物活性的水解混合物，對其活性肽的進一步分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、生物活性與肽結(jié)構(gòu)的構(gòu)效關(guān)系研究較少，亟待進一步的深入拓展。此外，生物活性肽研究領(lǐng)域中的一些新技術(shù)和方法，如多酶偶聯(lián)控制技術(shù)、定量構(gòu)效關(guān)系建模方法（QSAR）等，亦可作為未來研究開展工作的新領(lǐng)域。

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Research Progress and Prospect on Bioactive Peptides in Buckwheat

GUO Hong，*LI Yunlong
（Institude of Agricultural Products，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan，Shanxi 030031，China）

Buckwheat is the important crops with effect of nutrition and health.It isnutrient-rich，and there are much proteins which is a good source of buckwheat peptides.This paper reviews the preparation，purification，structure and biological activity of buckwheat bioactive peptides and discussed its further research development，aims to provide the references for the related research.

buckwheat；protein peptides；bioactivity

S517

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.12.039

1671-9646（2016）12b-0040-04

2016-11-24

山西省農(nóng)科院科技攻關(guān)課題（YGG1410）。

郭 洪（1982— ），男，碩士，助理研究員，研究方向為特色農(nóng)產(chǎn)品加工。*

李云龍（1979— ），男，碩士，副研究員，研究方向為特色農(nóng)產(chǎn)品加工。