遲曉元，郝翠翠，陳明娜，潘麗娟，陳 娜，王 通， 王 冕，楊 珍，梁成偉*，禹山林*

( 1.山東省花生研究所，山東 青島 266100； 2.青島科技大學(xué)生物系，山東 青島 266042)

?

花生AhFAD2-1基因與油酸/亞油酸比值的關(guān)系

遲曉元1，郝翠翠2，陳明娜1，潘麗娟1，陳 娜1，王 通1， 王 冕1，楊 珍1，梁成偉2*，禹山林1*

( 1.山東省花生研究所，山東 青島 266100； 2.青島科技大學(xué)生物系，山東 青島 266042)

花生AhFAD2-1由位于不同基因組上的兩個(gè)非等位基因AhFAD2-1A和AhFAD2-1B共同編碼，這兩個(gè)基因的突變引起酶結(jié)構(gòu)、酶活性或表達(dá)調(diào)控的變化，共同導(dǎo)致高油酸性狀的產(chǎn)生。本研究通過對(duì)13個(gè)不同花生品種(系)的AhFAD2-1基因進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)分析，查找點(diǎn)突變或插入位點(diǎn)，尋找與高油酸性狀關(guān)聯(lián)的基因位點(diǎn)。結(jié)果表明：E11、花育30、魯花12、豫花15、河北高油的基因型是OL1OL1OL2OL2，其相應(yīng)的O/L值為1.01～1.40；魯花14、花育17、花育19、花育23、E12S的基因型是ol1ol1OL2OL2，其中E12S較特殊O/L值為9.05，其他品種O/L值為1.54～1.97；E16、E18和花育32號(hào)的基因型是ol1ol1ol2ol2，其相應(yīng)O/L值為12.3～41.85。本研究結(jié)果對(duì)于高油酸性狀的分子鑒定以及高油酸花生新品種的培育具有一定的參考價(jià)值。

花生；AhFAD2-1；油酸/亞油酸比值(O/L)；基因突變

花生是我國重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物之一，籽粒含油量約占種子干重的44.27%～53.86%[1-2]。而其儲(chǔ)藏油脂中80%左右為不飽和脂肪酸，飽和脂肪酸僅占20%左右[2]。不飽和脂肪酸主要包括油酸和亞油酸。研究發(fā)現(xiàn)，富含高油酸的花生油對(duì)人體健康有益，長期食用高油酸的油類食品能夠降低心腦血管疾病的發(fā)生率，并且能夠很好地預(yù)防肥胖[3]?；ㄉN子O/L(油酸/亞油酸)比值與花生的品質(zhì)和貯存時(shí)間有直接關(guān)系，高油酸花生能夠長時(shí)間儲(chǔ)藏而不變質(zhì)，并且能夠保持較好的口感和品質(zhì)；亞油酸因其含有不飽和鍵而不穩(wěn)定，亞油酸含量高的花生油易氧化、腐敗，這嚴(yán)重影響了花生油的品質(zhì)和貨架時(shí)間[4- 5]。因此，選育高油酸花生品種已成為研究的熱點(diǎn)之一。

Δ12脂肪酸去飽和酶(AhFAD2)催化油酸在碳12位上脫氫生成亞油酸，AhFAD2酶活性喪失是產(chǎn)生高O/L比值花生的主要原因之一[6-8]。目前從花生中已經(jīng)分離出多個(gè)FAD2基因，包括4個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的FAD2基因和2個(gè)葉綠體定位的FAD2基因[9-10]。前期研究表明，AhFAD2-1是控制籽粒油酸、亞油酸含量和O/L比值的關(guān)鍵酶。栽培種花生是異源四倍體(2n=4x=40，AABB)，AhFAD2-1由位于不同基因組上的兩個(gè)非等位基因AhFAD2-1A和AhFAD2-1B共同編碼，這兩個(gè)基因的突變引起酶結(jié)構(gòu)、酶活性或表達(dá)調(diào)控的變化，共同導(dǎo)致高油酸性狀的產(chǎn)生[6-7]。Moore和Knauft(1989)將F435與普通花生雜交后，普通花生和高油酸花生F2代的分離比是3∶1或15∶1，因此可以推測(cè)高油酸花生受兩對(duì)隱性基因ol1和ol2控制[11]。禹山林以F435作高油酸親本與12個(gè)美國大花生品種配制雜交組合，并以大花生為輪回親本回交3次，結(jié)果表明，花生高油酸(80%左右)性狀由2對(duì)隱性基因(ol1ol1ol2ol2)控制[12]。Jung等(2000)研究驗(yàn)證了高油酸性狀的ol1位點(diǎn)和ol2位點(diǎn)分別編碼花生的AhFAD2-1A和AhFAD2-1B基因的可能性[6-7]。

目前發(fā)現(xiàn)的花生品種自然變異或誘變高油酸突變體中AhFAD2-1A基因突變位點(diǎn)都相同，而AhFAD2-1B基因突變位點(diǎn)不同[8]。對(duì)于AhFAD2-1A基因，序列的第448 bp位置由堿基A取代原來的堿基G，使天冬酰胺替代天冬氨酸(D150N)。高油酸天然突變體F435的AhFAD2-1B基因在起始密碼子后441與442位置中有一個(gè)堿基A插入，導(dǎo)致移碼突變，使翻譯提前終止[6-7]。高油酸突變體M2-225和C458分別是在AhFAD2-1B基因起始密碼子后997bp和665bp處存在MITE插入，導(dǎo)致基因功能喪失[13]。Wang等[14]利用疊氮化鈉處理花育22號(hào)，獲得了油酸含量顯著提高的突變體。AhFAD2-1B基因編碼區(qū)第281位由C突變?yōu)門，導(dǎo)致所編碼的氨基酸序列在第94位由異亮氨酸變?yōu)樘K氨酸。Fang等[15]用EMS處理魯豐2號(hào)，也獲得了油酸含量顯著提高的突變體。EMS突變體AhFAD2-1B基因編碼區(qū)第313位C突變成T，導(dǎo)致所編碼的第105位組氨酸突變成酪氨酸。酵母表達(dá)證實(shí)，該突變型AhFAD2-1B基因功能已喪失。

本研究通過對(duì)不同花生品種(系)的AhFAD2-1基因進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)分析，查找點(diǎn)突變或插入位點(diǎn)，尋找與高油酸性狀關(guān)聯(lián)的基因位點(diǎn)，為花生高油酸育種提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)于山東省花生研究所萊西花生種植試驗(yàn)基地進(jìn)行。13個(gè)花生品種(系)分別為E18、E16、花育32、E12S、花育19、花育17、花育23、魯花14、花育30、魯花12、E11、豫花15和河北高油，于5月初播種，9月中旬收獲。

1.2 DNA提取及PCR擴(kuò)增

利用TaKaRa公司的Universal Genomic DNA Extraction Kit (Ver.3.0)提取13個(gè)花生品種(系)的葉片基因組DNA。采用基因特異的引物FAD2-1A-F/FAD2-R和FAD2-1B-F/FAD2-R來分別擴(kuò)增AhFAD2-1A和AhFAD2-1B基因。FAD2-1A為5'-GATTACTGATTATTGACTT-3'，F(xiàn)AD2-1B為5'- CAGAACCATTAGCTTTG -3'，F(xiàn)AD2-R為5'-CTCTGACTATGCATCAG-3'。

1.3 PCR產(chǎn)物的克隆和測(cè)序

將擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)后篩選陽性克隆送往測(cè)序公司進(jìn)行序列測(cè)定，即得到了基因的序列。

1.4 脂肪酸甲酯的制備

將待測(cè)的花生種子研磨成粉末，準(zhǔn)確稱取10～15mg花生種子粉末倒入大EP管，加入體積比為1∶1的苯、石油醚1～2mL靜置5～10min。向大EP管中繼續(xù)加入2mL濃度為0.5mol/L的甲醇鈉試劑，室溫放置10min；加入事先配制好的飽和氯化鈉溶液2mL，離心或放置20min以上至出現(xiàn)上清，吸取上層液體60μL加入上樣瓶，并用600～700μL石油醚稀釋后進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)。

1.5 氣相色譜分析

使用Agllent Technologies 6890N氣相色譜儀，色譜柱為FFAP，檢測(cè)器為氫火焰離子化檢測(cè)器，分流比20∶1。進(jìn)樣口溫度250℃，柱溫150～230℃程序升溫，升溫速率為20℃/min，檢測(cè)器溫度250℃，自動(dòng)打火5min后可進(jìn)樣。尾吹氣為高純氮?dú)?，流?0mL/min，氫氣流量45mL/min，空氣流量450mL/min，進(jìn)樣量1μL。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用面積歸一法計(jì)算各種脂肪酸的相對(duì)含量(%)。脂肪酸相對(duì)含量計(jì)算公式：

相對(duì)含量(%)=Ai/∑Ai×100

每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，其中Ai為第i種脂肪酸組分的峰面積，∑Ai為各種脂肪酸組分的總面積。依次進(jìn)行計(jì)算并記錄，利用Microsoft Office Excel 2010作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1AhFAD2-1基因SNP檢測(cè)和序列比較

利用FAD2-1A-F/FAD2-R特異性PCR引物擴(kuò)增AhFAD2-1A基因片段，預(yù)期擴(kuò)增片段大小1228 bp。利用 FAD2-1B-F/FAD2-R特異性PCR引物擴(kuò)增AhFAD2-1B基因片段，預(yù)期擴(kuò)增片段大小1220 bp。通過瓊脂糖凝膠電泳，選擇目標(biāo)片段切膠純化，然后通過克隆測(cè)序?qū)?3個(gè)材料的AhFAD2-1A和AhFAD2-1B基因片段進(jìn)行了序列比對(duì)和分析，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)SNP位點(diǎn)。 第一個(gè)SNP是AhFAD2-1A基因起始密碼子后448 bp的G/A替換(GAC/AAC)，導(dǎo)致編碼蛋白的氨基酸從天門冬氨酸替換為天門冬酰胺(D/N)。第二個(gè)SNP是AhFAD2-1B基因起始密碼子后441bp與442bp之間有一個(gè)堿基A插入，導(dǎo)致移碼突變，使翻譯提前終止。

2.2 花生脂肪酸組分的測(cè)定結(jié)果

所測(cè)13個(gè)品種(系)油酸含量占總脂肪酸含量的38.2%～83.7%，油酸含量為E18>E16>花育32>E12S>花育19>花育23>魯花14>花育17>花育30>豫花15>E11>魯花12>河北高油。亞油酸含量占總脂肪酸含量的2.0%～37.8%，亞油酸含量由高到低的排列次序大致與油酸含量相反。魯花14、花育23、花育17、花育19、E12S、花育32、E16、E18這些品種籽粒的O/L值均大于1.5，在1.57～41.85之間。其余品種的O/L比值均小于1.5，在1.01～1.4之間。

2.3AhFAD2-1基因與籽粒O/L比值之間的關(guān)系

花生高油酸的產(chǎn)生受ol1和ol2兩個(gè)隱性非等位同源基因的共同調(diào)控。具有活性的AhFAD2-1A和AhFAD2-1B分別是由OL1和OL2編碼的。ol1是AhFAD2-1A的一個(gè)隱性突變等位基因，能導(dǎo)致其編碼的酶功能降低或喪失活性；ol2是AhFAD2-1B的隱性突變等位基因，它的改變導(dǎo)致AhFAD2-1B不能編碼正常有活性的蛋白。花生高油酸的基因型是ol1ol1ol2ol2；而普通油酸的顯性純合基因型是OL1OL1OL2OL2[16]。

結(jié)合各個(gè)品種AhFAD2-1A和AhFAD2-1B基因突變的情況(附表)可以確定，E11、花育30、魯花12、豫花15、河北高油的基因型是OL1OL1OL2OL2，因?yàn)樵谶@幾個(gè)花生品種中AhFAD2-1A和AhFAD2-1B皆不存在基因突變；魯花14、花育17、花育19、花育23、E12S的基因型是ol1ol1OL2OL2，因?yàn)樵谶@些品種中，AhFAD2-1A突變成為它的等位基因ol1，而AhFAD2-1B沒有發(fā)生基因突變；E16、E18和花育32號(hào)的基因型是ol1ol1ol2ol2，因?yàn)樵谶@2品種中AhFAD2-1A和AhFAD2-1B都發(fā)生基因突變。研究發(fā)現(xiàn)，AhFAD2-1A基因存在G448A點(diǎn)突變和AhFAD2-1B基因存在442A點(diǎn)插入的花生品種籽粒的O/L比值提高較大，高達(dá)41.85；AhFAD2-1A基因存在G448A點(diǎn)突變的花生品種籽粒的O/L比值相對(duì)提高。但品系E12S只有AhFAD2-1A基因存在突變，O/L比值卻較高(9.05)，是否有其他基因表達(dá)不同導(dǎo)致了O/L值的差異，還需進(jìn)一步的研究。

3 討 論

花生高油酸性狀由兩對(duì)隱性基因ol1和ol2共同調(diào)控，種子高油酸(油酸含量高于70%)性狀的產(chǎn)生是由AhFAD2-1A和AhFAD2-1B基因共同突變導(dǎo)致的[17-21]。雷永等(2010)研究發(fā)現(xiàn)，花生ahFAD2A突變型基因ahFAD2A-m主要分布在密枝亞種(普通型和龍生型變種)材料中，而野生型基因ahFAD2A-wt主要分布在疏枝亞種(珍珠豆型和多粒型變種)材料中。核心種質(zhì)中密枝亞種材料種子的油酸含量顯著高于疏枝亞種，與其普遍攜帶突變型基因ahFAD2A-m密切相關(guān)[20]。周麗俠等(2011)研究表明在13個(gè)花生品種中，AhFAD2基因皆存在AhFAD2A、AhFAD2B和假基因三類轉(zhuǎn)錄本，它們的表達(dá)調(diào)控方式及編碼蛋白的活性決定了花生籽粒油酸含量和O/L比值。AhFAD2A基因的若干位置存在多態(tài)性，其中在448位由G-A的點(diǎn)突變與花生籽粒的O/L比值提高相關(guān)聯(lián)；與AhFAD2A基因相比，AhFAD2B基因相對(duì)保守，且其活性對(duì)O/L比值的影響更大[2]。黃冰艷等(2012)也發(fā)現(xiàn)AhFAD2A基因G-A突變與種子油酸含量和油亞比高度正相關(guān)[22]。王允等(2015)研究發(fā)現(xiàn)AhFAD2基因型與O/L值的高低有著直接的關(guān)聯(lián)，但與花生含油量之間的相關(guān)性不顯著，也表明等位基因單一突變效果不如雙突變對(duì)不同花生基因型的O/L值影響大[23]，這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相符。

本研究通過對(duì)不同花生品種(系)的AhFAD2-1基因進(jìn)行了測(cè)序和比對(duì)分析，確定了花生不同品種(系)的基因型。發(fā)現(xiàn)，E11、花育30、魯花12、豫花15、河北高油的基因型是OL1OL1OL2OL2，其相應(yīng)的O/L值為1.01～1.40；魯花14、花育17、花育19、花育23、E12S的基因型是ol1ol1OL2OL2，其中E12S較特殊，O/L值為9.05，其他品種O/L值為1.54～1.97；E16、E18和花育32號(hào)的基因型是ol1ol1ol2ol2，其相應(yīng)O/L值為12.3～41.85。本實(shí)驗(yàn)中品系E12S只存在AhFAD2-1A基因突變，但是O/L比值卻較高(9.05)，是否有其他基因表達(dá)不同導(dǎo)致了O/L值的差異，還需進(jìn)一步的研究。本研究為開展高油酸雜交育種提供了理論指導(dǎo)和技術(shù)支持。

[1] 萬書波.花生品質(zhì)學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社，2005.

[2] 周麗俠，唐桂英，陳高，等.花生AhFAD2基因的多態(tài)性及其與籽粒油酸/亞油酸比值間的相關(guān)性[J].作物學(xué)報(bào)，2011，37(3):415-423.

[3] 林平，姜玉梅，陳瑛.幾種油料作物中脂肪酸組成的研究及探討[J].江西科學(xué)，2000，18(2):116-119.

[4] Braddock J C,Sims C A,O'Keefe S F.Flavor and oxidative stability of roasted high oleic acid peanuts [J].Journal of Food Science,2006,60(3):489-493.

[5] O'Keefe S F,Wiley V A,Knauft D A.Comparison of oxidative stability of high-and normal-oleic peanut oils[J].Journal of Oil & Fat Industries,1993,70(5):489-492.

[6] Jung S,Swift D,Sengoku E,et al.The high oleate trait in the cultivated peanut (ArachishypogaeaL.).I.Isolation and characterization of two genes encoding microsomal oleoyl-PC desaturases [J].Mol Gen Genet,2000a,263:796-805.

[7] Jung S,Powell G,Moore K,et al.The high oleate trait in the cultivated peanut (ArachishypogaeaL.).II.Molecular basis and genetics of the trait [J].Mol Gen Genet,2000b,263:806-811.

[8] Bruner A C,Jung S,Abbott A G,et al.The naturally occurring high oleate oil character in some peanut varieties results from reduced oleoyl-PC desaturase activity from mutation of aspartate [J].Crop Science,2001,41(2):522-526.

[9] Chi X Y,Yang Q L,Pan L J,et al.Isolation and characterization of fatty acid desaturase genes from peanut (ArachishypogaeaL.) [J].Plant Cell Rep,2011,30:1393-1404.

[10] Wang Y,Zhang X G,Zhao Y L,et al.Insights into the novel members of theFAD2 gene family involved in high-oleate fluxes in peanut [J].Genome,2015,58:1-9.

[11] Moore K M,Knauft D A.The inheritance of high oleic acid in peanut [J].J Hered,1989,80:252-253.

[12] 禹山林，Isleib T G.美國大花生脂肪酸的遺傳分析[J].中國油料作物學(xué)報(bào),2000,22(1):34-37.

[13] Patel M,Jung S,Moore K,et al.High-oleate peanut mutants result from a MITE insertion into theFAD2 gene [J].Theor Appl Genet,2004,108:1492-1502.

[14] Wang C T,Tang Y Y,Wang X Z,et al.Sodium azide mutagenesis resulted in a peanut plant with elevated oleate content [J].Electronic journal of biotechnology,2011,14(2):1-7.

[15] Fang C Q,Wang C T,Wang P W,et al.Identification of a novel mutation inFAD2Bfrom a peanut EMS mutant with elevated oleate content [J].Journal of oleo science,2012,61(3):143-148.

[16] Chen Z,Wang M L,Barkley N A,et al.A simple allele-specific PCR assay for detectingFAD2 alleles in both A and B genomes of the cultivated peanut for High-Oleate trait selection [J].Plant Molecular Biology Reporter,2010,28(3):542-548.

[17] López Y,Nadaf H L,Smith O D,et al.Isolation and characterization of the Δ12fatty acid desaturase in peanut (ArachishypogaeaL.) and search for polymorphisms for the high oleate trait in Spanish market-type lines[J].Theor Appl Genet,2000,101:1131-1138.

[18] Chu Y,Ramos L,Holbrook C C,et al.Frequency of a loss-of-function mutation in oleoyl-PC desaturase (ahFAD2A) in the mini-core of the U.S.peanut germplasm collection[J].Crop Sci,2007,47:2372-2378.

[19] Yu S L,Pan L J,Yang Q L,et al.Comparison of the Δ12fatty acid desaturase gene between high-oleic and normal-oleic peanut genotypes[J].J Genet Genomics,2008,35:1-7.

[20] 雷永，姜慧芳，文奇根，等.ahFAD2A等位基因在中國花生小核心種質(zhì)中的分布及其與種子油酸含量的相關(guān)性分析[J].作物學(xué)報(bào)，2010，36(11)：1864-1869.

[21] 雷永.花生高油酸的分子遺傳機(jī)制及其高效遺傳改良體系構(gòu)建[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2010:1-93.

[22] 黃冰艷，張新友，苗利娟，等.花生ahFAD2A等位基因表達(dá)變異與種子油酸積累關(guān)系[J].作物學(xué)報(bào)，2012(10):1752-1759.

[23] 王允，張幸果，李賀敏，等.花生AhFAD2的基因型與O/L值的相關(guān)性分析[J].分子植物育種，2015(6):1318-1322.

Correlation betweenAhFAD2-1 and Oleic Acid/Linoleic Acid Ratio in Different Peanut Varieties

CHI Xiao-yuan1,HAO Cui-cui2,CHEN Ming-na1,PAN Li-juan1,CHEN Na1, WANG Tong1,WANG Mian1,YANG Zhen1,LIANG Cheng-wei2*,YU Shan-lin1*

(1.ShandongPeanutResearchInstitute,Qingdao266100,China;2.BiologyDepartment,QingdaoUniversityofScience&Technology,Qingdao266042,China)

A high oleic/linoleic acid ratio (O/L) in peanut (ArachishypogaeaL.) seeds is controlled primarily by two non-allelic genes,AhFAD2-1AandAhFAD2-1B(ol1andol2).13 peanut varieties (lines) were selected to detect the genotype ofAhFAD2-1A/AhFAD2-1Bgene to improve the peanut-breeding efficiency.The results showed that the genotypes of E11,Huayu30,Luhua12,Yuhua15 and Hebeigaoyou areOL1OL1OL2OL2,and the corresponding O/L value is between 1.01～1.40.The genotypes of Luhua14,Huayu17,Huayu19,Huayu23 and E12S are ol1ol1OL2OL2,and the corresponding O/L value is between 1.54～1.97,except for E12S (9.05).E16,E18 and Huayu32 are ol1ol1ol2ol2,and the corresponding O/L value is between 12.3～41.85.This study provides the fundamental information for molecular identification and new variety breeding of high oleic acid peanut.

peanut;AhFAD2-1; oleic/linoleic acid (O/L) ratio; gene mutation

10.14001/j.issn.1002-4093.2016.04.004

2016-09-05

2014年國家“萬人計(jì)劃”青年拔尖人才；國家花生產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-14)；山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2014YL011； ZR2014YL012)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31000728)；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科研基金項(xiàng)目(2016YQN14)；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年英才培養(yǎng)計(jì)劃

遲曉元(1979-)，女，山東龍口人，山東省花生研究所副研究員，博士，主要從事花生油脂和脂肪酸代謝研究。

*通訊作者：梁成偉(1979-)，副教授，從事植物生物技術(shù)、分子生物學(xué)及生物信息學(xué)研究。E-mail:liangchw117@126.com

S565.2; Q754

A

禹山林(1956-)，研究員，主要從事花生遺傳育種研究。E-mail:yshanlin1956@163.com