李朝陽，張璞，王海軍，吳瀟雨，卓穎，柴雅琴

（西南大學化學化工學院，發(fā)光與實時分析重點實驗室，重慶 400715）

基于目標鏈雙重信號放大的電致化學發(fā)光生物傳感器的研究

李朝陽，張璞，王海軍，吳瀟雨，卓穎*，柴雅琴*

（西南大學化學化工學院，發(fā)光與實時分析重點實驗室，重慶 400715）

以CdSe/ZnS量子點為發(fā)光物質(zhì)，結合目標物循環(huán)放大和信號轉(zhuǎn)換放大的雙重放大策略，利用電致化學放光技術（ECL），構建了一種新型傳感器用于前列腺癌細胞標志物microRNA-141（miRNA-141）的高靈敏檢測。首先以發(fā)卡型DNA H1為模版DNA，目標物microRNA-141通過堿基互補配對打開發(fā)卡型DNA H1，得到帶有部分裸露的DNA雙鏈，當發(fā)卡型DNA H2存在的情況下，DNA H2與裸露的堿基雜交并將microRNA-141置換下來，從而實現(xiàn)目標物microRNA-141的循環(huán)，并得到大量的模版鏈。在DNA聚合酶的作用下，H1以H2為模版開始聚合，得到堿基互補配對的雙鏈DNA。加入內(nèi)切酶后，雙鏈DNA上的兩個特異性位點被剪切酶剪切，得到大量的Reporter DNA。通過該信號放大策略，實現(xiàn)了由一小部分DNA轉(zhuǎn)換為大量的Reporter DNA。此時將得到的Reporter DNA滴加到修飾有DNA Capture 2的傳感器界面上，通過堿基互補配對，Reporter DNA將修飾有CdSe/ZnS量子點的Capture 1捕獲在電極表面，得到電致化學發(fā)光響應，在優(yōu)化的實驗條件下，線性范圍為50 nmol/L～0.5 pmol/L，檢測限為0.17 pmol/L（S/N=3）。該傳感器對microRNA-141的檢測具有靈敏度高、檢測范圍寬、制作簡便、成本低的優(yōu)點，并且具有良好的選擇性和重現(xiàn)性。

電致化學發(fā)光；目標物循環(huán)策略；microRNA-141

0 引言

前列腺癌在西方國家男性高發(fā)的惡性腫瘤中,其死亡率高居癌癥死亡率的第二位,僅次于肺癌,前列腺癌是目前最主要的危害歐美國家男性健康的腫瘤疾病[1]。近年來，我國前列腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)明顯持續(xù)增長趨勢，2008年中國男性前列腺癌發(fā)病率為11.00/10萬，世界人口標化發(fā)病率為6.73/10萬，年齡組發(fā)病率結果表示，70歲以上中國男性的前列腺癌居男性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率第1位。1998年至2008年中國男性前列腺癌發(fā)病率年均增加比例為12.07%。上海、臺灣和新加坡三個亞洲發(fā)達地區(qū)的腫瘤發(fā)病率資料顯示：近20年時間，三個地區(qū)前列腺癌的發(fā)病率分別增加了3.3倍、8.5倍和4.8倍。目前新加坡和臺灣的前列腺癌發(fā)病率都在15/10萬以上，位列男性常見腫瘤的前6位。前列腺癌正成為嚴重影響我國男性健康的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤[2]。

MicroRNA是一種小的非編碼RNA[3]。在整個發(fā)展過程中,它可以調(diào)節(jié)細胞的早期發(fā)展,參與細胞分化和組織發(fā)展,并控制基因表達的生物功能。其異常表達能導致異常細胞分化、增殖、凋亡,與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關[4]，microRNA的表達水平的測定可以為癌癥的早期診斷提供重要信息[5]。據(jù)研究表明，通過檢測microRNA-141的表達水平可以預測人類身體中前列腺癌細胞的數(shù)量[6-7]，故而該作品采用前列腺癌標志物microRNA-141作為目標物。

該研究以構建一種對microRNA-141具有低檢出限、高靈敏度的傳感器作為主要突破點。在技術方面，以電致化學發(fā)光（ECL）作為主要技術，其中CdSe/ZnS量子點作為電致化學發(fā)光信號。通過合理的設計，得到microRNA-141濃度與對應ECL信號的定量關系。為進一步提高傳感器的靈敏度和可控性，作品引入國際研究熱點的核酸放大技術，把實驗的檢測數(shù)量級降低至皮摩爾水平，通過引入由microRNA-141誘導引發(fā)的目標物循環(huán)，以及由少量DNA得到大量Reporter DNA的信號轉(zhuǎn)換技術，達到了可控地放大電致化學發(fā)光信號的目的，實現(xiàn)對microRNA-141的高靈敏檢測。

1 實驗部分

1.1 實驗試劑

PBS緩沖液（pH7.4）；Nt.BbvCI剪切酶（北京博邁斯科技發(fā)展有限公司）；Bst 2.0 DNA聚合酶（北京博邁斯科技發(fā)展有限公司）；氨基水溶性量子點-625（武漢珈源量子點技術開發(fā)有限責任公司）；三(2-羧乙基)膦（TCEP）、乙二胺四乙酸（EDTA）、NaBH4、冰醋酸、NaCl（成都市新都區(qū)木蘭鎮(zhèn)工業(yè)開發(fā)區(qū)）；MgCl2、檸檬酸三鈉（重慶川東化工（集團）有限公司）；1%HAuCl4·4H2O(天津市倍思樂色譜技術開發(fā)中心)；巰基已烷（HT）(百靈威科技有限公司）；DNA鏈H1、H2、Capture 1 DNA、Capture 2 DNA（生工生物工程（上海）股份有限公司）

1.2 實驗儀器

MPI-E型ECL分析系統(tǒng)多功能化學發(fā)光檢測儀（西安瑞邁分析儀器有限公司）；CHI660D型電化學工作站（上海辰華儀器有限公司）；WH-986靜音攪拌器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；UV-2450紫外分光光度計（日本島津儀器有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 Reporter DNA的制備

2 μmol/L H1，H2各100 μL于PCR儀中95℃恒溫5 min后，將其置于65℃水中隨水冷卻至室溫，使H1,H2舒展為發(fā)夾型結構，取20 μL H1，20 μL H2加于200 μL PCR管中，同時加入一定濃度的20 μL microRNA-141混勻后于PCR儀中，在15℃下反應3 h，加入3.2 U/mL Bst聚合酶20 μL混勻后，于65℃反應60 min,而后加入20 μL 0.2 U/mL剪切酶在55℃下反應1 h，得到Reporter DNA溶液，（圖1）冷卻至室溫后移至-20℃冰箱保存待用。

1.3.2 發(fā)光信號物質(zhì)的制備

取0.0077 g EDC和0.0012 g NHS溶于1 mL重蒸餾水中，加入200 μL 2 μmol/L Capture 1，在室溫下攪拌15 min，然后加入200 μL 2 μmol/L CdSe/ZnS量子點持續(xù)攪拌2 h后，蒸餾水進行兩次離心洗滌后，稀釋到200 μL，保存到4℃冰箱中避光待用。

圖1 ECL傳感器構建示意圖Fig.1The operating principle of ECL sensing system

1.3.3 電極傳感界面的制備

將玻碳電極依次用0.3 μm和0.05 μm的氧化鋁漿料拋光，隨后在無水乙醇、去離子水中進行超聲清洗，在裸電極檢測達到要求后進行修飾。首先將玻碳電極置于1%的氯金酸溶液中，于-0.2 V恒電位下電化學沉積30 s，再滴加10 μL 1 μmol/L Capture 2溶液，于室溫下孵育12 h，隨后滴加10 μL HT溶液孵育50 min以封閉多余的結合位點，防止非特異性吸附。滴加10 μL Report DNA液和10 μL發(fā)光信號物溶液，室溫下在電極表面避光孵育2 h后，即得到ECL傳感器界面。

2 結果與討論

2.1 循環(huán)伏安法表征

循環(huán)伏安法（CV）作為一種敏感的電化學技術，適用于研究電極表面發(fā)生復雜反應時電極界面的電化學行為的變化情況，被廣泛用于電極界面修飾層的表征。從（圖2）中可以看出，與裸電極（曲線a）相比金納米粒子修飾過的玻碳電極氧化還原峰電流升高(曲線b)，這是因為金納米粒子可以促進電子傳遞。當Capture 2 DNA組裝到電極上時，由于DNA不導電而阻礙電子轉(zhuǎn)移，導致氧化還原電流值降低（曲線c）。當非電活性的HT用來封閉非特異性位點后，氧化還原電流值進一步降低（曲線d）。在電極上滴加Reporter DNA、Capture 1信號物質(zhì)溶液后，由于發(fā)生了堿基互補配對反應，電極表面電子轉(zhuǎn)移被阻礙，氧化還原電流降低（曲線e）。

圖2 電極制備過程的循環(huán)伏安表征圖Fig.2CVs of the stepwise modifed electrodes performed in 0.1 mol/L PBS(pH7.4)containing 5.0 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-with the scan range of-0.2 to 0.6 V(100 mV/s).(a)bare GCE,(b)GCE/AuNPs,(c)GCE/AuNPs/Capture 2,(d) GCE/AuNPs/Capture 2/HT,(e)GCE/AuNPs/Capture 2 /HT/Capture 1 compound and Reporter DNA

2.2 MicroRNA生物傳感器的響應性能

在最優(yōu)條件下，將傳感器用于不同濃度的microRNA-141檢測，探究ECL強度與microRNA-141濃度的關系（圖3)。在一定范圍內(nèi)，隨著microRNA-141濃度的增加，ECL峰值逐漸增高，峰型良好，且ECL強度與microRNA-141濃度的半對數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關系（圖3）。其線性范圍為50 nmol/L～0.5 pmol/L，線性回歸方程為I=10392.63+3028.02 lg c,相關系數(shù)r2為0.9962，檢出限為0.17 pmol/L(S/N=3)。

2.3 MicroRNA生物傳感器的選擇性

為了考察microRNA生物傳感器的特異性，選取microRNA-21干擾物質(zhì)進行測定（圖4）。在核酸放大技術的應用時，分別以(A)blank，(B) microRNA-21，(C)microRNA-141，(D)microRNA-21+microRNA-141替換引發(fā)物microRNA-141，在相同條件下測得ECL信號。實驗結果表明，microRNA-21對ECL信號的影響可忽略不計，即構建的傳感器對microRNA-141的檢測具有良好的特異性。

圖3 生物傳感器的矯正曲線Fig.3Calibration curve for the various concentrations of microRNA-141

圖4 MicroRNA生物傳感器的特異性Fig.4The specificity of the proposed ECL biosensor：(A) Blank,(B)MicroRNA-21(50 nmol/L),(C)MicroRNA-141 (1 nmol/L),(D)MmicroRNA-141(1 nmol/L)+MicroRNA-21 (50 nmol/L)

2.4 MicroRNA生物傳感器的穩(wěn)定性

在最優(yōu)條件下，將已制備好的傳感器連續(xù)掃描14圈(圖5)，得到的ECL信號的相對標準偏差（RSD）為1.05%，表明傳感器的穩(wěn)定性良好，能保證測量的精確度，有望用于實際樣品的檢測。

2.5 MicroRNA生物傳感器的重現(xiàn)性

在同一批電極中，取三根電極構建相同的傳感器并測量其ECL信號，對比信號值得到批內(nèi)重現(xiàn)性。再取同一根電極，連續(xù)三天構建相同的傳感器，并測定其ECL信號，對比信號值得到批間重現(xiàn)性。實驗結果得到批內(nèi)、批間的相對標準偏差（RSD）均小于5%，說明構建的傳感器重現(xiàn)性良好。

圖5 MicroRNA生物傳感器的穩(wěn)定性Fig.5The stability of the biosensor with ECL intensitytime curve in the optimal conditions under consecutive cyclic potential scans for 14 circles

3 結論

綜上所述，該研究將分子生物學和納米材料技術結合，運用了目標鏈循環(huán)放大和信號轉(zhuǎn)換放大的雙重放大策略實現(xiàn)前列腺癌細胞內(nèi)microRNA-141的高靈敏檢測。該作品成功實現(xiàn)了microRNA-141在前列腺癌細胞內(nèi)的檢測、有望用于前列腺癌的早期診斷及治療。具有靈敏度高、檢測范圍寬、制作簡便、成本低，并且具有良好的選擇性和重現(xiàn)性。

[1]Gupta S,Srivastava M,Ahmad N,et al.Over-expression of cyclooxygenase-2 in human prostate adenocarcinoma. [J].The Prostate,2000,42(1):73-78.

[2]Xu B,Feng N,Li P,et al.A functional polymorphism in Pre‐miR‐146a gene is associated with prostate cancer risk and mature miR-146a expression in vivo[J].The Prostate,2010,70(5):467-472.

[3]Guo Y,Yao W,Xie Y,et al.Logic gates based on G-quadruplexes:principles and sensor applications[J]. Mikrochimica Acta,2015,183(1):21-34.

[4]Zhang P,Wu X,Chai Y,et al.An electrochemiluminescent microRNAbiosensorbasedonhybridizationchain reaction coupled with hemin as the signal enhancer[J]. Analyst,2014,139(11):2748-2753.

[5]Chen A,Ma S,Zhuo Y,et al.In Situ ElectrochemicalGeneration of Electrochemiluminescent Silver Naonoclusters on Target-Cycling Synchronized Rolling Circle Amplification Platform for MicroRNA Detection[J]. Analytical Chemistry,2016,88(6):3203-3210.

[6]Yang C,Dou B,Shi K,et al.Multiplexed and amplified electronic sensor for the detection of microRNAs from cancer cells[J].AnalyticalChemistry,2014,86(23): 11913-11918.

[7]Zhou W,Li D,Chai Y,et al.RNA responsive and catalytic self-assembly of DNA nanostructures for highly sensitive fluorescence detection of microRNA from cancer cells[J].Chemical Communications,2015,51(92): 16494-16497.

A novel electrochemiluminescence biosensor based on the dual signal amplification

Li Zhao-yang,Zhang Pu,Wang Hai-jun,Wu Xiao-yu,Zhuo Ying*,Chai Ya-qin*
(College of Chemistry and Chemical Engineering,Southwest University,Chongqing 400715,China)

A novel electrochemiluminescence(ECL)biosensor was constructed for the highly-sensitive detection of biomarker of prostate cancer microRNA-141 combined with the target recycling amplification and signal conversion amplification.First,microRNA-141 opened the hairpin DNA H1 by complementary base-pairing and the double stranded DNA with some exposed bases were obtained.In the presence of hairpin DNA H2,the above doubles tranded DNA would hybridized with DNA H2 to replace the microRNA and realize the recycling of target microRNA, achiving a lot of template strands.With the aid of DNA polymerase,H2 began to polymerize with H1 as the template, obtaining hybridized double stranded DNA.After the addition of nicking endonuclease Nt.BbvCI,the two specific cleavage site of DNA was nicked and the amount of Reporter DNA could be achived.With the signal conversion strategy,a small number of DNA could be successfully change into a large number of Reporter DNA.Then,the obtained Reporter DNA was incubated on the electrode surface which immobilized with DNA Capture 2 in advance to capture the CdSe/ZnS quantum dots labeled DNA Capture 1 through the complementary base-pairing.With the dual amplification strategy,the proposed biosensor realized high sensitive detection of the microRNA-141 in prostate cancer cell.The linearity range was 50 nmol/L～0.5 pmol/L with a detection limit down to 0.17 pmol/L(S/N=3). This work possess several advantages,such as simpler operation,higher sensitivity and controllable reaction,etc.

electrochemiluminescence；the doubled signal amplification strategy；microRNA-141

國家自然科學面上基金項目（21575116,21675129,21675130）；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金資助（XDJK2015A002）

*通信聯(lián)系人,E-mail:yingzhuo@swu.edu.cn;yqchai@swu.edu.cn.Tel.:Fax:023-68253172