夏帆

（生物無機與藥物湖北省重點實驗室，華中科技大學(xué)，湖北武漢 430074）

基于酪胺信號放大技術(shù)的無液滴數(shù)字化酶聯(lián)免疫反應(yīng)

夏帆*

（生物無機與藥物湖北省重點實驗室，華中科技大學(xué)，湖北武漢 430074）

數(shù)字化酶聯(lián)免疫反應(yīng)，一種單分子計數(shù)技術(shù)，是最靈敏的免疫方法之一。在傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫反應(yīng)中，靶蛋白的檢測限都在pmol/L級別，但是數(shù)字化酶聯(lián)免疫反應(yīng)的檢測限可以達到fmol/L甚至amol/L。這種技術(shù)的關(guān)鍵點在于將每一個酶標(biāo)記的蛋白分子分別包裹到一個液滴中，以此來加大酶濃度，并完成對單分子的檢測。因此這類方法需要用到專門的儀器來制備液滴，使得檢測體系非常龐大或復(fù)雜。最近，日本科學(xué)家Kenji Akama發(fā)展了一種無需液滴的數(shù)字化酶聯(lián)免疫技術(shù)[1]，這一研究成果發(fā)表于近期美國Analytical Chemistry雜志上。

該方法主要利用了催化分子沉積的酪胺信號放大技術(shù)。酪胺鹽在辣根過氧化物酶（HRP）催化雙氧水的反應(yīng)中形成共價鍵結(jié)合位點，然后與周圍的蛋白殘基如色氨酸，組氨酸和酪氨酸殘基結(jié)合，形成大量的生物素殘基。具體來講，第一步：首先把捕捉抗體連接到磁珠上，再和不同濃度的靶蛋白孵育，清洗，并和生物素標(biāo)記的檢測抗體反應(yīng)。最后將清洗過的反應(yīng)產(chǎn)物加入到鏈霉親和素標(biāo)記的HRP溶液中，生成磁珠-檢測蛋白-檢測抗體-HRP的免疫反應(yīng)產(chǎn)物。第二步：免疫反應(yīng)產(chǎn)物和生物素標(biāo)記的酪氨鹽反應(yīng)，并使得生物素標(biāo)記的酪氨鹽沉積在只有HRP標(biāo)記的磁珠上。第三步：將上述生成的磁珠產(chǎn)物和生物素標(biāo)記的BV-421，一種合成的熒光聚合物，混勻反應(yīng)。第四步：利用流式細胞儀檢測。利用此方法，該實驗室可以檢測到139 amol/L的乙型肝炎表面抗原。該方法的特點在于將酶富集在了磁珠表面而不是液滴里，在保障靈敏度的前提下，大大簡化了實驗步驟，擴大了應(yīng)用范圍。

[1]Akama K,Shirai K,Suzuki S.Droplet-Free Digital Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Based on a Tyramide Signal Amplification System[J].Analytical Chemistry,2016,ASAP.

國家自然科學(xué)基金資助項目（國家杰出青年基金21525523）

*通信聯(lián)系人,E-mail:xiafan@hust.edu.cn