蔡俁林，周云，龔亮

（1.湖南省益陽市箴言中學(xué)，湖南益陽 413058）

（2.湖南工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，湖南株洲 412000）

納米火焰探針檢測腫瘤耐藥性相關(guān)mRNA

蔡俁林1，周云1，龔亮2*

（1.湖南省益陽市箴言中學(xué)，湖南益陽 413058）

（2.湖南工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，湖南株洲 412000）

信使RNA（mRNA）是由DNA經(jīng)由轉(zhuǎn)錄而來，帶著相應(yīng)的遺傳訊息，為下一步轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)提供所需的訊息。檢測mRNA的表達(dá)，了解其功能在腫瘤研究中具有重要意義。納米火焰探針，作為一種具有良好穩(wěn)定性和特異性的金納米粒子-DNA納米復(fù)合物，能有效對腫瘤mRNA進(jìn)行檢測成像。該文構(gòu)建的納米火焰探針能很好地實(shí)現(xiàn)對耐藥性基因的檢測。

信使RNA；耐藥性基因；納米火焰探針

0 引言

信使RNA（mRNA）是由DNA經(jīng)轉(zhuǎn)錄而來，與DNA序列互補(bǔ)的核糖核苷酸序列。細(xì)胞核的DNA將遺傳信息傳遞給mRNA，經(jīng)由mRNA傳遞到細(xì)胞質(zhì)，再通過細(xì)胞質(zhì)中的各種細(xì)胞器識(shí)別mRNA中的信息，同時(shí)合成蛋白質(zhì)。

癌細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的重要因素之一，耐藥性基因MRP1過度表達(dá)與腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性密切相關(guān)。檢測MRP1 mRNA的表達(dá)量有助于臨床預(yù)測及指導(dǎo)用藥，進(jìn)一步了解并探討腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制[1]。

納米火焰探針是一種金納米粒子-DNA的納米復(fù)合物，文獻(xiàn)報(bào)道此類探針可以有效實(shí)現(xiàn)腫瘤mRNA的檢測成像[2-3]，且具有良好的特異性和穩(wěn)定性。因此，該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用納米火焰探針檢測MRP1 mRNA，為檢測耐藥性相關(guān)mRNA提供一種簡單、快速、準(zhǔn)確的方法。

1 實(shí)驗(yàn)原理

1.1 膠體金溶液的合成

化學(xué)合成的金納米粒子尺寸不一，直徑從幾個(gè)納米到幾百個(gè)納米都可以合成。在典型的合成過程中，金的化合物首先被還原劑還原成金原子，并進(jìn)一步聚集形成金納米粒子，同時(shí)穩(wěn)定劑會(huì)吸附或者化學(xué)結(jié)合到金納米粒子表面。由于穩(wěn)定劑通常是帶電荷的，當(dāng)修飾到納米粒子表面之后，帶電荷的納米粒子會(huì)相互排斥，從而形成穩(wěn)定的膠體。

1.2 膠體金修飾DNA

硫醇、硫醚或二硫醚衍生物中的S原子與Au表面的強(qiáng)烈相互作用遵循軟硬酸堿作用原理，Au-S鍵極易自發(fā)形成并釋放熱量。通過在DNA末端修飾巰基，利用Au-S鍵，可以直接將DNA組裝與金表面。

1.3 對mRNA的檢測

通過將兩條互補(bǔ)配對的DNA鏈組裝在金納米顆粒表面，一條為特異性識(shí)別mRNA的序列，另一條為互補(bǔ)的短鏈DNA并修飾熒光染料，在沒有靶分子存在時(shí)，染料的熒光可以被金納米粒子淬滅，當(dāng)遇到DNA或RNA的靶分子時(shí)，識(shí)別序列與靶分子通過競爭雜交，短鏈DNA被釋放，熒光恢復(fù)。因此可以用于檢測mRNA（圖1）。

2 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

2.1 儀器

三頸燒瓶；油浴鍋；島津UV-2450型紫外分光光度計(jì)；FluoroMax-4熒光分光光度計(jì)。

2.2 試劑

檸檬酸三鈉(＞99．0%);四氯金酸(99．99%); 0．1 mol/L NaCl緩沖溶液(0．01 mol/L Tris-Acetate, pH=7．0);其中氯化鈉為分子生物級純度;所有溶液均采用三次蒸餾的去離子水配制。經(jīng)HPLC純化后的巰基修飾寡核苷酸:（DNA序列）(生工生物工程（上海）股份有限公司)

圖1 納米火焰探針檢測腫瘤耐藥性相關(guān)mRNAFig．1Schematic illustration of multidrug resistance associated mRNA detection using nano-flares

納米金標(biāo)記長鏈:5’-SH-AAAAA TGC TGT TCG TGC CCC CGC CG-FAM－3’

納米金標(biāo)記短鏈DNA:5’-GCA CGA ACA GCAT–Cy3-3’

MDR1 mRNA：5'-CGG CGG GGG CAC GAA CAG CA-3'

3 實(shí)驗(yàn)步驟

3.1 金納米顆粒的合成

金溶膠由HAuCl4經(jīng)檸檬酸三鈉溶液還原而成[4-5]。具體步驟如下。將合成過程中所有玻璃器皿用王水浸泡3 h,再用超純水涮洗3遍,放入70℃烘箱烘干備用。取2．2×10-2mol/L氯金酸與25 mL超純水至三頸燒瓶中100℃油浴加熱至沸騰,加入0．8 mL 2．5×10-2mol/L檸檬酸三鈉溶液,反應(yīng)30 min后自然冷卻至室溫,掃描紫外可見光譜表征后置于4℃冰箱保存。

3.2 金顆粒表面修飾DNA

將巰基修飾的環(huán)狀寡核苷酸序列用100 mmol/L TCEP活化，使DNA末端巰基形成的分子間二硫鍵切斷，然后與金納米粒進(jìn)行連接反應(yīng),二者加入的量為100∶1(摩爾比)。避光反應(yīng)12 h后,將200 μL 2 mol/L NaCl分多次加入上述溶液內(nèi)進(jìn)行鹽老化。最后通過13000 r/min,10 min離心作用收集沉淀,沉淀復(fù)溶后得到穩(wěn)定的DNA修飾的金納米顆粒溶液。用紫外分光光度計(jì)對其進(jìn)行表征。

3.3 計(jì)算金納米顆粒表面標(biāo)記DNA的數(shù)量

因?yàn)榧{米金具有熒光猝滅的效果，因此可以通過熒光的變化來計(jì)算金納米顆粒表面標(biāo)記的DNA的數(shù)量。為了計(jì)算金納米顆粒上標(biāo)記DNA的數(shù)量，首先將未與金納米顆粒孵育的兩條DNA鏈根據(jù)不同的濃度進(jìn)行熒光測定，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)，收集DNA與金納米顆粒反應(yīng)離心后的上清液，測定其熒光強(qiáng)度，通過計(jì)算上清液的熒光值與未與金顆粒反應(yīng)對應(yīng)DNA的熒光值之間的差值，計(jì)算出每個(gè)納米金表面修飾DNA的數(shù)量。

3.4 檢測熒光恢復(fù)測定MRP1 mRNA濃度

當(dāng)溶液中的MRP1 mRNA與納米金上標(biāo)記的長鏈雜交后，釋放出一端標(biāo)記熒光團(tuán)的短鏈DNA，該游離短鏈DNA的熒光得以恢復(fù)?；诖死碚摶A(chǔ)，通過熒光分光光度計(jì)定量測定雜交后的熒光信號強(qiáng)度值。

實(shí)驗(yàn)在緩沖溶液DPBS中進(jìn)行。首先將標(biāo)記長鏈的納米金與標(biāo)記熒光團(tuán)的短鏈DNA在75℃下雜交反應(yīng)10 min，待溫度緩慢降至室溫后，離心除去未雜交的短鏈。隨后加入不同濃度的MRP1 mRNA，室溫下反應(yīng)1 h后，測定溶液的熒光光譜。

4 結(jié)果與討論

如圖2所示，黑色的線為未標(biāo)記DNA的金納米顆粒，其在518 nm處有其紫外的特征吸收峰，并且根據(jù)吸收峰的峰值可以計(jì)算出金納米顆粒的濃度。紅色的線為標(biāo)記DNA的金納米顆粒，在522 nm處有其紫外的特征吸收峰，相對于未標(biāo)記DNA的顆粒，有4 nm左右的紅移，并且在260 nm處有個(gè)DNA的特征吸收峰，表明DNA已經(jīng)成功修飾在金納米顆粒表面。

根據(jù)測定不同濃度的DNA樣品的熒光值（圖3A），并將其濃度與熒光之間的關(guān)系進(jìn)行線性擬合，得到了線性方程：y=56359+634405x（圖3B），其中x代表濃度，y為熒光強(qiáng)度。通過測定上清液中DNA的熒光值可以得到上清液中DNA的濃度，根據(jù)加入的DNA濃度之間的差值以及金納米顆粒的濃度，就可以計(jì)算出每個(gè)顆粒上標(biāo)記的DNA的數(shù)量。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)計(jì)算，每個(gè)金納米顆粒上標(biāo)記了約70條DNA。

圖3 （A）不同濃度的DNA以及上清液樣品的熒光值測定；（B）DNA濃度與其對應(yīng)熒光值的校正曲線Fig.3(A)Fluorescence spectra of different concentration DNA and supernatant(brown);(B)Calibration curve of fluorescence value and corresponding DNA concentration

圖2 金納米顆粒與修飾了DNA的金納米顆粒的紫外表征圖Fig.2UV absorbance spectrum of gold nanoparticle and DNA modified gold nanoparticle

在緩沖溶液中對不同濃度的MRP1 mRNA進(jìn)行了測定，如圖4A為在加入不同濃度的MRP1 mRNA得到的熒光發(fā)射光譜。由圖可以看出，隨著加入的MRP1 mRNA濃度增加，熒光強(qiáng)度也隨之升高。圖4B為探針的校正曲線，其動(dòng)力學(xué)響應(yīng)范圍為200 nmol/L～2 μmol/L，檢測下限為70 nmol/L。

5 結(jié)論

該文成功將DNA修飾在金納米顆粒上，成功構(gòu)建了納米火焰探針，并且利用熒光的方法實(shí)現(xiàn)了對癌細(xì)胞內(nèi)耐藥性基因MRP1 mRMA的檢測。通過對各方面的分析，都表明在金納米顆粒表面修飾上了足夠多的DNA序列。而且修飾后的納米火焰探針能夠很好地實(shí)現(xiàn)對一定范圍內(nèi)的耐藥性基因MRP1 mRNA的線性響應(yīng)。因此該方法具有癌癥相關(guān)基因的mRNA檢測具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

[1]Leslie E M,Deeley R G,Cole S P C.Multidrug resistance proteins:role of P-glycoprotein,MRP1,MRP2,and BCRP(ABCG2)in tissue defense[J].Toxicology and applied pharmacology,2005,204(3):216-237.

[2]Zheng D,Seferos D S,Giljohann D A,et al.Aptamer nano-flares for molecular detection in living cells[J]. Nano letters,2009,9(9):3258-3261.

[3]Seferos D S,Giljohann D A,Hill H D,et al.Nano-flares: probes for transfection and mRNA detection in living cells[J].Journal of the American Chemical Society, 2007,129(50):15477-15479.

[4]Frens G.Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions[J].Nature,1973,241(105):20-22.

[5]Schmitt J,M?chtle P,Eck D,et al.Preparation and optical properties of colloidal gold monolayers[J].Langmuir, 1999,15(9):3256-3266.

Nano-flares for detection of multidrug resistance associated mRNA

Cai Yu-lin1,Zhou Yun1,Gong Liang2*
（1.Yiyang Zhenyan School,Yiyang 413058,China）（2.College of Life Sciences and Chemistry,Hunan University of Technology,Zhuzhou 412000,China）

Messenger RNA(mRNA)is a large family of RNA molecules that convey genetic information from DNA to the ribosome.Detection of mRNA expression and investigation of their function have great impact on cancer research.Nano-flares,a novel gold nanoparticle-DNA complex exhibits great stability and specificity in detection and imaging cancer related mRNA.In this paper,we utilize nano-flares to detect mRNA associated with multidrug resistance.

mRNA;multidrug resistance gene;nano-flares

生化分析與生物傳感；國家自然科學(xué)基金（21325520）

*通信聯(lián)系人,E-mail:gl569940808@126.com