蒙志平, 黎勇明, 楊　玲, 吳　險, 梁金艷,林麗文, 梁　婷, 黃川英

(廣西壯族自治區(qū)貴港市人民醫(yī)院, 1. 檢驗科; 2. 婦科, 廣西 貴港, 537100)

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HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA檢測在宮頸癌篩查中的應用價值探討

蒙志平1, 黎勇明2, 楊玲1, 吳險1, 梁金艷2,林麗文1, 梁婷2, 黃川英1

(廣西壯族自治區(qū)貴港市人民醫(yī)院, 1. 檢驗科; 2. 婦科, 廣西 貴港, 537100)

摘要:目的探討HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA檢測在宮頸癌篩查中的應用價值。 方法選取宮頸病變篩查的受試者407例為研究對象，均行宮頸薄層液基細胞學(TCT)檢查，并檢測細胞學標本中HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA的表達。215例行陰道鏡宮頸活檢，結(jié)合組織病理診斷結(jié)果進行統(tǒng)計分析。結(jié)果407例細胞病理學診斷結(jié)果：正常范圍(WNL)192例(47.17%)、意義不明的不典型鱗狀上皮細胞(ASCUS)106例(26.04%)、低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)70例(17.20%)和高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)39例(9.58%)。診斷為LSIL和HSIL患者中，HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA檢出率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05); 診斷為ASCUS患者中, HPV DNA檢出率顯著高于HPV E6/E7 mRNA (P<0.01)。215例組織病理學診斷結(jié)果：正常109例，陰性106例，包括CIN Ⅰ級44例、CIN Ⅱ級27例、CIN Ⅲ級32例、宮頸鱗癌3例。對于診斷為CIN Ⅱ級、CIN Ⅲ級/宮頸癌患者，HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA檢測的靈敏度、特異度和陽性預測值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05), 但HPV E6/E7 mRNA檢測的陰性預測值和準確度顯著高于HPV DNA檢測(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論HPV E6/E7 mRNA檢查較HPV DNA檢查能更好地評估HPV感染患者宮頸病變惡化風險，聯(lián)合TCT檢測對提高宮頸癌早期篩查和診斷的準確度具有積極意義。

關(guān)鍵詞:宮頸癌; 宮頸上皮內(nèi)瘤變; 人乳頭瘤狀病毒; HPV DNA; E6/E7基因

宮頸癌是臨床婦科常見惡性腫瘤之一，主要是由宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)逐步發(fā)展為浸潤癌的長期病變過程。流行病學統(tǒng)計顯示，中國宮頸癌發(fā)病率由1989—1990年的3.06/10萬上升至2007—2008年的11.87/10萬[1]，而預防和控制宮頸癌發(fā)病和死亡的關(guān)鍵是有效的早期篩選、診斷和治療[2]。宮頸疾病診斷中，薄層液基細胞學檢查(TCT)使用較為普遍，但因操作等主觀因素易造成漏檢或假陽性出現(xiàn)。另一方面，鑒于高危型人乳頭瘤狀病毒(HR-HPV)和宮頸癌及癌前病變發(fā)生密切相關(guān)[3-4]，HPV DNA檢測能直接反映宮頸宿主細胞感染HPV，聯(lián)合TCT能提高診斷篩選的陽性檢出率、敏感性。但也有學者提出HPV DNA檢測不能反映HPV病毒感染后的活性狀態(tài)[5]。研究[6]顯示，HR-HPV的持續(xù)感染可通過上調(diào)HPV E6/E7腫瘤蛋白表達啟動致癌過程，HPV E6/E7 mRNA表達與病變嚴重程度密切相關(guān)，因此HPV E6/E7 mRNA檢測在宮頸癌初步篩查中是否更具有診斷價值是目前臨床研究的熱點。本研究比較了TCT聯(lián)合HPV DNA、TCT聯(lián)合HPV E6/E7 mRNA在宮頸癌早期診斷中的應用價值，現(xiàn)報告如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2014年10月—2015年10月在貴港市人民醫(yī)院婦科行宮頸病變篩查的受試者407例為研究對象，年齡18～66歲，平均(37.5±9.2)歲；152例患者有明顯臨床癥狀，為陰道分泌物增多、白帶異常、接觸性出血，214例伴有不同程度的宮頸糜爛。排除標準: ① 子宮切除、宮頸手術(shù)或盆腔放射治療史; ② 合并其他系統(tǒng)腫瘤或?qū)m頸上皮內(nèi)病變史(CIN≥2級); ③ 取材前陰道用藥或行陰道沖洗; ④ 妊娠期患者。所有受試者均行TCT、HPV DNA、HR-HPV E6/E7 mRNA檢查和宮頸活體組織病理學檢查。

1.2方法

1.2.1樣本采集：采用專用宮頸刷置入宮頸內(nèi)鱗柱狀上皮交界處順時針旋轉(zhuǎn)3～5圈。取出專用刷后置于含有專用細胞保存液的試管中，刷洗8～10次后將細胞洗脫后封管，-20 ℃保存?zhèn)錂z。

1.2.2TCT檢測：采用膜式液基超薄細胞學和離心沉淀技術(shù)，宮頸脫落細胞經(jīng)固定、染色后，由檢驗科醫(yī)師依據(jù)國際癌癥協(xié)會推薦的Bethesda系統(tǒng)(TBS)進行細胞病理學診斷，分為正常范圍(WNL)、意義不明的不典型鱗狀上皮細胞(ASCUS)、低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)，高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)、鱗狀細胞癌(SCC)和意義不明的不典型腺體上皮細胞(AGCUS)。

1.2.3HPV DNA檢測：采用凱普公司點雜交的采樣工具包從宮頸管采集標本，檢測21種HPV亞型，包括世衛(wèi)組織(WHO)關(guān)于宮頸癌篩查必須具備的13種高危型HPV DNA(16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68)，5種低危型6, 11, 41, 42, 44以及3種常見亞型53, 66和CP8304。

1.2.4HPV E6/E7 mRNA檢測：用專用宮頸刷于宮頸外口及頸管內(nèi)旋轉(zhuǎn)5圈，折斷刷柄，置于專用保存液瓶中待用，根據(jù)科蒂亞(新鄉(xiāng))試劑盒檢測要求經(jīng)過信號放大、加入標記熒光物質(zhì)的底物后，在配套冷光儀光度計上檢測。檢測結(jié)果為拷貝數(shù)，經(jīng)公司計算軟件自動判斷結(jié)果。

1.2.5組織病理學檢查：對于ASCUS或更高級別的異常細胞學結(jié)果，陰道鏡下取宮頸活體組織，送病理檢查，病理診斷結(jié)果依據(jù)TBS分類系統(tǒng)分為未見上皮內(nèi)病變或惡性病變(NILM)、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變CIN(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)和宮頸癌。

1.3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0 軟件，計數(shù)資料以百分率(%)表示，采用χ2檢驗，以病理學檢查結(jié)果為金標準，計算不同檢驗方法對CIN Ⅱ、CIN Ⅲ的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1細胞病理學、HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA病理學檢查結(jié)果

407例患者均行TCT檢查，其中HPV DNA檢測陽性197例(48.40%)，HPV E6/E7 mRNA檢查陽性127例(31.20%)。細胞病理學診斷結(jié)果：WNL 192例(47.17%), ASCUS 106例(26.04%)，LSIL 70例(17.20%)，HSIL 39例(9.58%)。細胞學檢查標本中215例行陰道鏡宮頸活檢，組織病理學診斷正常109例，陽性106例，包括CIN Ⅰ級44例、CIN Ⅱ級27例、CIN Ⅲ級32例、宮頸鱗癌3例。

2.2不同細胞病理學分級HPV DNA、HPVE6/E7 mRNA檢出情況

不同細胞病理學分級下HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢出率比較見表1。診斷為ASCUS患者中, HPV DNA檢出率高于HPV E6/E7 mRNA, 差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01); 診斷為LSIL和HSIL 患者中，HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA檢出率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3不同組織病理學分級HPV DNA、HPVE6/E7 mRNA檢出情況

不同組織病理學分級HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢出率比較見表2。將3例宮頸癌患者納入CIN Ⅲ級合并計算，CIN Ⅱ級和CIN Ⅲ級/宮頸癌患者中，HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢出率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；CIN Ⅰ級患者中，HPV DNA檢出率顯著高于HPV E6/E7 mRNA，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA檢測對不同組織病理學診斷價值

以215例行陰道鏡宮頸活檢的患者為研究對象。對于診斷為正常的患者，2種方法靈敏度、特異度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05), HPV E6/E7 mRNA陽性預測值和準確度顯著低于HPV DNA檢測(P<0.05或P<0.01), 但陰性預測值顯著高于HPV DNA檢測(P<0.05); CIN Ⅰ級患者中，2種方法靈敏度、特異度和準確度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05), HPV E6/E7 mRNA陽性預測值顯著低于HPV DNA檢測(P<0.05)，陰性預測值顯著高于HPV DNA檢測(P<0.01); CIN Ⅱ級中，2種方法靈敏度、特異度和陽性預測值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05), HPV E6/E7 mRNA檢測的陰性預測值和準確度顯著高于HPV DNA檢測(P<0.05或P<0.01); CIN Ⅲ級/宮頸癌患者中，2種方法靈敏度、特異度和陽性預測值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05), HPV E6/E7 mRNA檢測的陰性預測值和準確度顯著高于HPV DNA檢測(P<0.05或P<0.01)。見表3。

3討論

宮頸癌發(fā)病率僅次于乳腺癌，是中國女性常見惡性腫瘤之一。研究[7]報道，HR-HPV持續(xù)感染是宮頸癌及其癌前病變發(fā)生發(fā)展的必要條件，因此檢測HPV DNA的持續(xù)感染能有助于宮頸癌及其癌前病變的早期診斷和治療。但多數(shù)患者HPV感染呈一過性，而呈HPV持續(xù)感染患者宮頸上皮細胞發(fā)生惡化前通常經(jīng)歷5～10年的癌前病變階段，因此HPV DNA檢測對宮頸疾病惡化風險預測效果可能不理想[8]。另一方面，HPV基因組包括兩類編碼基因區(qū)，即7個早期區(qū)(E1、E2、E4、E5、E6、E7和E8)基因和2個晚期區(qū)(L1和L2)基因，其中由E6/E7基因編碼的致癌蛋白是導致宮頸上皮癌變的重要因子。HPV DNA整合于宿主染色體脆弱區(qū)，破壞編碼特異性DNA束縛蛋白的E2區(qū)，引起E6和E7兩種癌基因的過表達，通過抑制抑癌基因功能、激活端粒酶活性等機制，最終導致細胞周期失控、永生化成為癌細胞[9]。研究[10]提示，宮頸組織中HPV E6/E7 mRNA 表現(xiàn)出癌基因活性，對于持續(xù)HPV感染患者，HPV E6/E7 mRNA異常表達往往預示著細胞惡化風險增高。本研究觀察到，TCT檢查診斷為ASCUS患者中，HPV DNA檢出率高于HPV E6/E7 mRNA(P<0.01), 但在診斷為 LSIL和HSIL 患者中，HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA檢出率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05), 與相關(guān)文獻報道基本一致[11-12]。

Rijkaart等[13]指出，HPV E6/E7 mRNA表達隨著宮頸病變級別升高呈增加趨勢。本研究中，不同組織病理學分級患者診斷效率的比較結(jié)果顯示，CIN Ⅱ級、CIN Ⅲ級/宮頸癌患者中，HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA檢測的靈敏度、特異度和陽性預測值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但HPV E6/E7 mRNA檢測的陰性預測值和準確度顯著高于HPV DNA檢測(P<0.05或P<0.01)，提示HPV E6/E7 mRNA更適用于評估宮頸疾病惡化風險。

與HPV DNA比較, *P<0.05, **P<0.01

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Application value of HPV DNA and HPV E6/E7 mRNA assay in screening of cervical cancer

MENG Zhiping1, LI Yongming2, YANG Ling1, WU Xian1, LIANG jinyan2,LIN Liwen1, LIANG Ting2, HUANG Chuanying1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory; 2.DepartmentofGynecology,GuigangPeople′sHospital,Guigang,Guangxi, 537100)

KEYWORDS:cervical cancer; cervical intraepithelial neoplasias; human papillomavirus; HPV DNA; HPV E6/E7 mRNA

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the application value of HPV DNA and HPV E6/E7 mRNA assay in screening of cervical cancer. MethodsA total of 407 cases received Thinprep Cytology Test (TCT), HPV DNA and HPV E6/E7 mRNA assay. The cervical biopsy by colposcopy was performed in 215 cases and the data according to cytological and pathological results were statistically analyzed. ResultsThere were 192, 106, 70 and 39 cases diagnosed as normal limits (WNL), atypical squamous cells of undetermined significance (ASCUS), lower-grade squamous intraepithelial lesions (LSIL)and higher-grade squamous intraepithelial lesions (HSIL) according to cytological results respectively. There was no significant difference in positive rate of HPV DNA and HPV E6/E7 mRNA in those patients with cytological results of LSIL and HSIL (P>0.05). The positive rate was higher in HPV DNA than that of HPV E6/E7 mRNA in ASCUS patients (P<0.05). Out of 215 cases, 106 cases were confirmed with positive pathological results, including 44 cases of CIN Ⅰ, 27 cases of CIN Ⅱ, 32 cases of CIN Ⅲ and 3 cases of cervical cancer. There was no significant difference in sensitivity, specificity, positive predict value between HPV DNA and HPV E6/E7 mRNA assay in diagnosis of CIN Ⅱ and CIN Ⅲ/cervical cancer(P>0.05), but HPV E6/E7 mRNA assay had a higher negative predictive value and accuracy compared with the HPV DNA assay (P<0.05 orP<0.01). ConclusionHPV E6/E7 mRNA assay shows advantage in predicting risk of deterioration of cervical lesions. The combination of TCT and HPV E6/E7 mRNA assay is more valuable in screening of cervical cancer.

收稿日期:2015-12-16

中圖分類號:R 737.33

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2016)11-076-04

DOI:10.7619/jcmp.201611022