郭德民

(哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，黑龍江哈爾濱 150036)

豬瘟疫苗生產(chǎn)中存在的問題及工藝改進(jìn)

郭德民

(哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，黑龍江哈爾濱 150036)

瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)雖然僅有一種血清型，但是其有毒力的強(qiáng)弱之分，如果豬的本身有疾病，則免疫就會失敗而達(dá)不到免疫的效果。本次研究主要通過對豬瘟疫苗生產(chǎn)中的問題進(jìn)行探討，進(jìn)一步的對豬瘟疫苗生產(chǎn)工藝進(jìn)行研究。

豬瘟疫苗；豬瘟病毒；生產(chǎn)工藝

當(dāng)前三種最為常見的豬瘟疫苗是豬瘟乳兔組織活疫苗（組織苗）、豬瘟細(xì)胞活疫苗（細(xì)胞苗）、豬瘟脾淋活疫苗（組織苗）。給健康的豬接種組織苗同細(xì)胞苗的效果相同，如果是緊急接種則組織苗比細(xì)胞苗好，主要原因是在組織苗當(dāng)中的部分組織蛋白，尤其是脾淋苗當(dāng)中的淋巴因子是免疫促進(jìn)劑。必須要注意的就是在超前免疫當(dāng)中不能使用組織苗，因為組織苗對還沒有吃到初乳的豬仔能夠引發(fā)較為嚴(yán)重的免疫應(yīng)激反應(yīng)。

1 豬瘟疫苗生產(chǎn)工藝當(dāng)中存在的問題

1.1 豬瘟病毒培養(yǎng)難

在滴度較低的豬瘟細(xì)胞毒轉(zhuǎn)瓶的生產(chǎn)過程當(dāng)中，病毒的粒子在細(xì)胞當(dāng)中成熟之后就會釋放到營養(yǎng)液當(dāng)中，進(jìn)而致使部分的病毒粒子活性喪失。生產(chǎn)過程當(dāng)中，不容易對打次收獲病毒的方式進(jìn)行控制，總的毒價在多次收獲病毒之后降低；體外進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞當(dāng)中，CSFV保持較低水平的增殖，產(chǎn)生出的子代病毒有較低的滴度。因此進(jìn)而配苗抗原就難達(dá)到均以穩(wěn)定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 豬瘟病毒抗原的檢測方法落后

當(dāng)前進(jìn)行增殖的CSFV包括豬腎細(xì)胞、羊睪丸細(xì)胞還有豬睪丸細(xì)胞，一般性的細(xì)胞培養(yǎng)過程不會發(fā)生細(xì)胞的病變，使用兔體的反應(yīng)量對抗原進(jìn)行間接性的檢測，對抗原進(jìn)行定量較為困難，對目前疫苗的生產(chǎn)質(zhì)量影響嚴(yán)重。

1.3 疫苗的效力標(biāo)準(zhǔn)過低

C柱疫苗免疫在歐洲的藥典當(dāng)中規(guī)定進(jìn)行肌肉注射的劑量是100PD。而在我國進(jìn)行豬瘟苗免疫所規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)劑量是37PD。與國際標(biāo)準(zhǔn)相比，我國的標(biāo)準(zhǔn)劑量過低。

1.4 生產(chǎn)方法較為落后

抗原所存在的生物安全性隱患采用兔的淋巴結(jié)、脾臟以及乳兔的組織來進(jìn)行生產(chǎn)。牛病毒性腹瀉病毒污染嚴(yán)重威脅著牛睪丸細(xì)胞苗；兔源影響兔脾淋苗，有著質(zhì)量不穩(wěn)定問題。疫苗的效力檢驗以及抗原質(zhì)量的控制均使用較為落后的兔體致熱法，檢驗時需要較大量的兔子，質(zhì)量指標(biāo)穩(wěn)定較難。接種之后兔子能發(fā)產(chǎn)生發(fā)熱反應(yīng)與兔子對病毒的敏感性以及外界因素有關(guān)。顯然，如果在接種過程當(dāng)中兔子感染了別的病原，則不能說明發(fā)熱反應(yīng)是因為接種了豬瘟病毒引起的。另外，脾淋苗生產(chǎn)的成本較高，許多廠家是否采用未曾接種的兔子來做脾淋苗值得懷疑。兔子的大小、品種以及健康狀況都會對豬瘟病毒在體內(nèi)的增殖情況產(chǎn)生影響，因此組織苗生產(chǎn)的供體動物嚴(yán)格需要同一品種、統(tǒng)一飼養(yǎng)。

1.5 生產(chǎn)工藝全過程未能達(dá)到GMP標(biāo)準(zhǔn)

雖然豬瘟疫苗抗原的部分下游工藝，包括配制、凍干等都在GMP的環(huán)境當(dāng)中進(jìn)行，但是對兔子進(jìn)行飼養(yǎng)、接種以及解剖工作要在非GMP的環(huán)境當(dāng)中進(jìn)行。并且在進(jìn)行配苗的工序當(dāng)中不需要在連續(xù)性的封閉系統(tǒng)當(dāng)中進(jìn)行，需要進(jìn)行獨立性、分散性的操作，進(jìn)而使得疫苗的抗原完全暴露或者半暴露在外界環(huán)境當(dāng)中，增加了污染的危險性。

2 豬瘟活疫苗生產(chǎn)工藝的改進(jìn)方向

2.1 豬瘟疫苗生產(chǎn)抗原定量及效力檢驗方法的改進(jìn)

有的學(xué)者采用進(jìn)行了原核表達(dá)的豬瘟疫苗E2蛋白抗原以及BAIB/c小鼠，通過對CSFV進(jìn)行單克隆進(jìn)而建立AC-ELISA的方法，對豬瘟疫苗的臨床組織樣品、細(xì)胞的培養(yǎng)物以及攻毒致死的豬病料進(jìn)行檢測，研究顯示此類方法重復(fù)性、特異性以及敏感性都較好。此方法可以在較短時間內(nèi)迅速準(zhǔn)確的將大批量的樣品中的CSFV檢測出來，比病毒分離法以及免疫熒光法優(yōu)異，其特點是半自動化、自動顯示結(jié)果，更加適合在研發(fā)機(jī)構(gòu)以及生產(chǎn)機(jī)構(gòu)應(yīng)用。有的學(xué)者進(jìn)行熒光定量PCR（FQ—PCR）檢測時將構(gòu)建的質(zhì)粒做為了標(biāo)準(zhǔn)，此類方法能夠在臨床診斷上應(yīng)用。當(dāng)前，在國內(nèi)外已經(jīng)建立了應(yīng)用于豬瘟病毒抗體以及抗原檢測的ELISA技術(shù)，多數(shù)為抗體檢測技術(shù)，大多數(shù)在疫苗免疫效果評估以及流行病學(xué)黨章應(yīng)用，在疫苗生產(chǎn)抗原的質(zhì)量控制當(dāng)中還未應(yīng)用。在包被抗體以及檢測抗體的建立當(dāng)中使用單克隆抗體作為熒光抗體的方法或者是抗原捕捉ELISA，其特點是特異性高，但是敏感性低；使用多克隆抗體敏感性高，特異性低。有的學(xué)者采用噬菌體肽庫，在組織樣品當(dāng)中的豬瘟病毒抗原的檢測以及診斷當(dāng)中，設(shè)立依賴噬菌體擬位競爭性的ELISA方法。競爭性的ELISA優(yōu)點是高敏感性、高特異性，此類方法在毒素蛋白以及抗原的檢測當(dāng)中已經(jīng)得到應(yīng)用?？乖臏?zhǔn)確定量方法可以讓配苗當(dāng)中的抗原和成品的疫苗有效的抗原量化具有更高的準(zhǔn)確性和科學(xué)性，能夠使得豬瘟疫苗的效力變得均一穩(wěn)定，免疫劑量的準(zhǔn)確可以讓免疫劑量不足的問題得到避免，同時也可以讓因為免疫劑量過大導(dǎo)致免疫抑制的現(xiàn)象得到避免。

2.2 病毒培養(yǎng)方式的改進(jìn)及抗原的濃縮純化

采用傳代細(xì)胞方式對病毒進(jìn)行生產(chǎn)可以讓動物組織以及原代細(xì)胞帶來的安全風(fēng)險降到最低甚至可以得到避免，并且含有病毒的培養(yǎng)液當(dāng)中的病毒含量較高，批次之間的差異較小，穩(wěn)定性較好。采用ST細(xì)胞生物反應(yīng)器微載體生產(chǎn)豬瘟病毒技術(shù)，能夠有效的提高CSFV滴度。此類微載體屬于一種多孔微珠，可以在懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)物當(dāng)中添加，細(xì)胞就可以馬上在微載體上粘附并生長。因為培養(yǎng)基用量的減少以及細(xì)胞培養(yǎng)量的擴(kuò)大，CSFV滴度得到了顯著提高，而且此類微載體通過處理之后可以循環(huán)使用。采用生物反應(yīng)器自動控制參數(shù)，可以讓產(chǎn)品質(zhì)量更加的穩(wěn)定、生產(chǎn)工藝更加的先進(jìn)。當(dāng)前我國關(guān)于豬瘟抗原濃縮純化方面的研究較少，可以采用離心和超濾的方法來進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)抗原的濃縮純化。有的研究對豬瘟病毒抗原進(jìn)行純化采用反向親和層析法，將抗原當(dāng)中殘存的牛睪丸細(xì)胞培養(yǎng)物去除，總的蛋白去除率可以高達(dá)76.9%；采用進(jìn)行純化前以及純化后的抗原對豬瘟免疫血清進(jìn)行檢測，豬瘟免疫血清當(dāng)中的非相關(guān)性抗體反應(yīng)可以通過純化抗原去除，讓豬瘟免疫抗體檢測的特異性得到有效確保。

[1] 朱良全，彭雋，王棟，等.豬瘟疫苗研究進(jìn)展及我國傳統(tǒng)疫苗的研究現(xiàn)狀[J].中國獸藥雜志，2005，39（2）：33-37.