朱曉敏

(朝陽市獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，遼寧朝陽 122000)

物種鑒別方法研究進(jìn)展

朱曉敏

(朝陽市獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，遼寧朝陽 122000)

在動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫事業(yè)、法醫(yī)物證鑒定、物種系統(tǒng)發(fā)育、疾病診斷等研究中，不明來源的生物檢材的種屬鑒定是一個(gè)重要的鑒定環(huán)節(jié)，傳統(tǒng)的物種鑒別方法依賴于形態(tài)學(xué)方法、解剖學(xué)方法及化學(xué)分析法，但由于環(huán)境因素的影響以及生物發(fā)育不同階段的差異，這些方法顯示出了局限性，為了克服這些缺點(diǎn)，許多基于基因分型的分子鑒別手段相繼問世，本文對(duì)近年來應(yīng)用于物種鑒別的形態(tài)學(xué)方法、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法、高效液相色譜法、近紅外光譜法(NIRS)等研究方法作以綜述。

物種鑒別；形態(tài)學(xué)；免疫學(xué)；分子生物學(xué)；高效液相；近紅外光譜

目前，物種鑒別是我國重點(diǎn)研究的專項(xiàng)之一，物種范圍廣泛，從微觀細(xì)菌到宏觀的自然界，保護(hù)物種資源，不破壞生態(tài)環(huán)境，是研究的主要目的，但隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，自然受到了巨大的破壞，物種在進(jìn)化過程中也發(fā)生了巨大的、驚人的變化，研究物種鑒別的方法，在疾病診斷、物種分類學(xué)、流行病學(xué)、醫(yī)療及社會(huì)經(jīng)濟(jì)領(lǐng)域都將發(fā)揮重要作用。

傳統(tǒng)的物種鑒別方法依賴于形態(tài)學(xué)方法、解剖學(xué)方法及化學(xué)分析法，但由于環(huán)境因素的影響以及個(gè)體發(fā)育不同階段的差異，這些方法顯示出了局限性，為了克服這些缺點(diǎn)，許多基于基因分型的分子鑒別手段相繼問世，本文對(duì)近年來應(yīng)用于物種鑒別的研究方法作以綜述。

1 形態(tài)學(xué)方法

形態(tài)學(xué)方法最早用于種屬鑒定，如根據(jù)紅細(xì)胞有無細(xì)胞核，可以區(qū)分人類與鳥類。應(yīng)用較多的是根據(jù)人類與其他動(dòng)物的毛發(fā)、骨骼在大體形態(tài)和顯微鏡下結(jié)構(gòu)差異，達(dá)到種屬鑒定的目的。

對(duì)于飼料中動(dòng)物源性成分的鑒別，運(yùn)用顯微鏡法可對(duì)備檢樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)和形態(tài)學(xué)觀察，低倍鏡下沉淀物的結(jié)構(gòu)和顏色是鑒別肉骨粉來源的第一信號(hào)，如哺乳動(dòng)物的骨碎片呈白色或淡黃色，而禽類的顏色發(fā)暗且尖銳，高倍鏡下哺乳動(dòng)物骨碎片橢圓，禽類的骨碎片尖銳等。運(yùn)用顯微鏡法鑒別物種，具有樣品制備量少，設(shè)備便宜、簡單易行等優(yōu)點(diǎn)，但此方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，對(duì)技術(shù)人員的要求高，結(jié)果與實(shí)驗(yàn)員的經(jīng)驗(yàn)相關(guān)性很大。

目前，計(jì)算機(jī)在運(yùn)算速度和存儲(chǔ)容量方面迅猛發(fā)展，使其在物種鑒別與鑒定方面發(fā)揮作用成為可能。國外自20世紀(jì)50年代起就開始運(yùn)用計(jì)算機(jī)技術(shù)進(jìn)行昆蟲模式識(shí)別方面的探索，Yu等（Yu D.S.，1992）使用半自動(dòng)的圖像分析技術(shù)對(duì)姬蜂翅脈進(jìn)行了測量，并成功區(qū)分5個(gè)種，成功率達(dá)到了100%.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)沈佐銳教授指導(dǎo)IPMist實(shí)驗(yàn)室利用計(jì)算機(jī)模式識(shí)別手段進(jìn)行昆蟲種類鑒定，利用數(shù)字圖像技術(shù)對(duì)昆蟲圖像分割進(jìn)行了較全面的研究，利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)昆蟲進(jìn)行自動(dòng)鑒別在昆蟲形態(tài)自動(dòng)測量與種類自動(dòng)鑒定方面取得了一系列進(jìn)展。

2 免疫學(xué)方法

血清學(xué)方法是種屬鑒定的經(jīng)典方法，根據(jù)不同物種蛋白間理化性質(zhì)差異，通過檢測檢樣中是否有種屬特異性蛋白質(zhì)來達(dá)到種屬鑒定的目的，包括：沉淀反應(yīng)，凝集反應(yīng)，酶免疫分析，等電聚焦，高效液相色譜技術(shù)及纖維蛋白溶解實(shí)驗(yàn)等其中環(huán)狀沉淀反應(yīng)方法簡便，是目前常規(guī)檢驗(yàn)方法之一。

3 分子生物學(xué)方法

無論是法醫(yī)現(xiàn)場檢材還是食品藥品監(jiān)督和海關(guān)打擊走私的生物檢材，種屬鑒定的對(duì)象很多是微量甚至是混合性檢材，因此常需采用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行種屬鑒定。用于物種鑒別的分子生物學(xué)方法主要包括限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA（RAPD）、PCR特異性鑒定等。

4 高效液相色譜法

許多病原菌其致病性差異很大，但這些細(xì)菌其他特性及遺傳基因都非常相似，變性高效液相色譜法（DHPLC）技術(shù)通過利用通用PCR引物擴(kuò)增細(xì)菌的165核糖體RNA基因中的高度變異序列的片段，將這些來自不同種類或菌株的具有細(xì)微差異的DNA序列的細(xì)菌的擴(kuò)增產(chǎn)物與參考菌株的擴(kuò)增產(chǎn)物混合后進(jìn)行DHPLC檢測，根據(jù)所產(chǎn)生的獨(dú)特的色譜峰圖，可以作為細(xì)菌種類的分子指紋，從而可以從菌株水平鑒別病原菌。劉朝暉等運(yùn)用變性高效液相色譜（DHPLC）技術(shù)對(duì)從肺炎克雷伯氏菌臨床分離株產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBL）的TEM型質(zhì)粒PCR擴(kuò)增的編碼序列進(jìn)行分析，48.6%的樣本表現(xiàn)為異常洗脫峰，經(jīng)測序、NCBI網(wǎng)站比對(duì)及文獻(xiàn)檢索，確定了一種TEM型質(zhì)粒的新基因亞型TEM-116，為國內(nèi)首次報(bào)道。

5 近紅外光譜法（NlRS）

在植物藥的種類鑒定方面，紅外光譜已有廣泛應(yīng)用，具有制樣簡單，實(shí)驗(yàn)快速，譜圖特征顯著和重現(xiàn)性較好等特點(diǎn)。萬定榮等對(duì)10種卷柏屬藥用植物樣品的紅外光譜比較研究證實(shí)，利用光譜圖中的整體峰形及吸收峰的數(shù)目、位置（Cm-1），強(qiáng)度與峰強(qiáng)比率等特征，尤其是指紋區(qū)（1250-400 cm-1）的上述特征，可對(duì)各個(gè)種進(jìn)行有效的輔助鑒別，還可用于藥用植物或植物藥材不同產(chǎn)地、生境樣品的鑒別分析，比較近緣種間的親緣程度。

目前NIRS已在肉類食品鑒別中開始應(yīng)用，可以定量分析食品真?zhèn)?，但僅有少數(shù)的研究報(bào)道利用NIRS肉類品種的鑒別，研究主要集中在區(qū)分牛肉、雞肉、羔羊肉和牛肉的混合，以及對(duì)于牛肉、豬肉和雞肉間的區(qū)分。NIRS主要利用樣品的光學(xué)特性，利用反射，能見度或纖維光學(xué)特性區(qū)分肌肉的種類，是一種快速、有效預(yù)測不同動(dòng)物品種肉類組分的方法。

綜上所述，運(yùn)用各種技術(shù)手段進(jìn)行物種的鑒別與鑒定，在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐和打擊走私動(dòng)物的活動(dòng)中將發(fā)揮重要作用，同時(shí)，建立有效的物種鑒別方法，為防止瘋牛病、禽流感等重大疫病的發(fā)生與傳播具有非常重要的意義，通過物種鑒別揭示動(dòng)植物自然居群、品種中遺傳結(jié)構(gòu)的基因流動(dòng)與演變等系統(tǒng)發(fā)育與親緣關(guān)系的真實(shí)本質(zhì)，對(duì)于保護(hù)地方動(dòng)植物物種資源，鑒別珍稀動(dòng)植物物種，珍稀動(dòng)植物資源的開發(fā)與利用，促進(jìn)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展等也將發(fā)揮重要作用。

[1] 李帥英，吳增志，李保會(huì).物種多樣性研究進(jìn)展[J].河北林果研究，2002，17（1）：72-79.