王曉明，夏爽，李文芳,2，陳浩浩,2，潘桂湘

(1天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，天津300193；2天津國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院)

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高通量活性篩選技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用

王曉明1，夏爽1，李文芳1,2，陳浩浩1,2，潘桂湘1

(1天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，天津300193；2天津國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院)

高通量篩選(HTS)技術(shù)是以藥物和靶點(diǎn)之間的相互作用為檢測(cè)指標(biāo)，高通量地篩選與特定靶點(diǎn)具有親和力樣品的技術(shù)。與傳統(tǒng)方法相比，HTS具有快速、高效、靈敏、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，近年來(lái)在中藥研發(fā)領(lǐng)域得到較好的應(yīng)用，有效推動(dòng)了中藥現(xiàn)代化的進(jìn)程。HTS包含初篩、復(fù)篩、深入篩選、確證篩選四個(gè)過(guò)程。其模型類別包括分子水平模型、細(xì)胞水平模型和動(dòng)物水平模型。HTS常用的技術(shù)包括報(bào)告基因系統(tǒng)、熒光影像技術(shù)、熒光標(biāo)記檢測(cè)、離子流檢測(cè)和微量化技術(shù)。

高通量篩選；中藥研究；篩選過(guò)程；篩選模型；篩選技術(shù)

高通量篩選(HTS)技術(shù)出現(xiàn)于上世紀(jì)80年代。與傳統(tǒng)方法相比，HTS具有快速、高效、靈敏、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，近年來(lái)在中藥研發(fā)領(lǐng)域得到較好的應(yīng)用，對(duì)加速中藥現(xiàn)代化進(jìn)程具有積極的意義。本文從篩選過(guò)程、模型類別、篩選技術(shù)三方面對(duì)HTS進(jìn)行綜述。

1　HTS過(guò)程

藥物的治療作用大多由藥物與機(jī)體內(nèi)生物大分子特定位點(diǎn)(靶點(diǎn))相結(jié)合而產(chǎn)生。HTS技術(shù)是以藥物和靶點(diǎn)之間的相互作用為檢測(cè)指標(biāo)，高通量地篩選與特定靶點(diǎn)具有親和力樣品的技術(shù)。HTS包含初篩、復(fù)篩、深入篩選、確證篩選四個(gè)過(guò)程[1]。初篩是在細(xì)胞或分子水平模型上，初步篩選對(duì)特定靶點(diǎn)有作用的樣品。復(fù)篩是采用與初篩一樣的模型，將初篩有活性的化合物稀釋成一系列的濃度，明確化合物對(duì)該靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)、作用強(qiáng)度及量效關(guān)系。深入篩選是采用與初篩不同但相關(guān)的細(xì)胞或分子水平模型，結(jié)合組織、器官或整體動(dòng)物模型，證明活性化合物的藥理作用。深入篩選得到的化合物，可作為先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，以得到活性更高、缺點(diǎn)更少的活性物質(zhì)。確證篩選是對(duì)深入篩選獲得的先導(dǎo)化合物或經(jīng)結(jié)構(gòu)優(yōu)化的化合物，進(jìn)行深入的藥理作用、一般毒理及體內(nèi)過(guò)程等研究。對(duì)符合藥物屬性的化合物，可將其確定為候選藥物，啟動(dòng)藥物開(kāi)發(fā)研究程序，進(jìn)行臨床前研究。

2　HTS模型類別

2.1分子水平模型分子水平模型有酶、離子通道、受體、基因等類型。其優(yōu)點(diǎn)是藥物作用靶標(biāo)明確，可直接獲得與藥物作用機(jī)制相關(guān)的信息；不足之處是只能對(duì)特定靶點(diǎn)的單指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，提供的藥物與靶點(diǎn)相互作用的信息有限，難以綜合評(píng)價(jià)藥物的生物活性。

2.1.1酶篩選模型酶篩選模型是根據(jù)酶的作用特點(diǎn)，以酶的反應(yīng)底物、反應(yīng)產(chǎn)物作為檢測(cè)指標(biāo)，評(píng)價(jià)藥物對(duì)酶活性的影響。周思多等[2]根據(jù)碘化硫代乙酰膽堿在膽堿酯酶的作用下分解生成硫代膽堿，后者進(jìn)一步與顯色劑DTNB迅速作用生成405 nm有光吸收黃色物質(zhì)的原理，建立了基于酶標(biāo)儀的乙酰膽堿酯酶抑制劑篩選模型，考察了48種中藥的不同溶劑提取物對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制活性，發(fā)現(xiàn)提取物濃度對(duì)乙酰膽堿酯酶抑制活性有一定影響，提取物終濃度為76.92 mg/L時(shí)，黃柏80%乙醇提取物、元胡80%乙醇提取物和丹參乙酸乙酯提取物的AChE抑制活性較高。凌笑梅等[3]以凝血酶為靶點(diǎn)，建立了基于毛細(xì)管電泳法的凝血酶抑制劑篩選模型，研究黃蜀葵、兩色金雞菊和肉從蓉的提取物與凝血酶之間的作用，從11個(gè)中藥單體中快速篩選出6個(gè)能與凝血酶相互作用的化合物。

2.1.2離子通道篩選模型離子通道是一類通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)離子水平來(lái)發(fā)揮信息作用的大分子膜蛋白。離子通道篩選模型選用表達(dá)特定膜通道的細(xì)胞模型，以尋找新型膜通道拮抗劑或激活劑[4]。曹明等[5]采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，探討甘松揮發(fā)油抗心律失常的離子通道作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)甘松揮發(fā)油可濃度依賴性地抑制大鼠心肌細(xì)胞膜L型鈣通道電流。金伶伶[6]采用含囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)因子(CFTR)和一種對(duì)碘高度敏感的綠色熒光蛋白突變體EYFP-H148Q的表達(dá)質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染至Fischer大鼠甲狀腺上皮細(xì)胞中，建立CFTR氯離子通道熒光成像篩選模型，通過(guò)測(cè)定碘離子通過(guò)氯離子通道內(nèi)流對(duì)細(xì)胞內(nèi)EYFP的熒光淬滅動(dòng)力學(xué)，以此來(lái)篩選自建中藥樣品庫(kù)中能顯著促進(jìn)CFTR氯離子通道開(kāi)放的激活劑，成功從16種中藥中發(fā)現(xiàn)了能夠糾正ΔF508-CFTR細(xì)胞質(zhì)膜定位障礙的活性成分，經(jīng)熒光細(xì)胞測(cè)定模型和Ussing Chamber電生理測(cè)定方法，首次確定了木蘭脂素對(duì)CFTR氯離子通道具有激活作用。

2.1.3受體篩選模型受體是位于細(xì)胞膜表面或細(xì)胞內(nèi)具有特異識(shí)別和結(jié)合功能的蛋白組分[7]，受體的異常變化會(huì)導(dǎo)致某些疾病的發(fā)生。以異常受體作為藥物篩選新靶點(diǎn)，可為治療疾病提供新的線索。萬(wàn)娟等[8]以對(duì)第二信使變化敏感的響應(yīng)元件和熒光素酶報(bào)告基因，構(gòu)建報(bào)告基因質(zhì)粒，然后將報(bào)告基因和受體基因共轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞，建立了高通量的人胰高血糖素受體拮抗劑篩選模型，對(duì)300多種中藥提取物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)有多個(gè)提取物對(duì)胰高血糖素受體具有拮抗劑活性。唐建華等[9]將低密度脂蛋白受體/熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞中，建立了靶向LDL受體轉(zhuǎn)錄活性報(bào)告基因篩選模型，對(duì)500余種中藥提取物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)決明子、澤瀉、穿龍薯蕷等提取物具有陽(yáng)性結(jié)果。閻雨等[10]將重組質(zhì)粒pHABHis-IL6R轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，建立一種白介素6受體小分子拮抗劑HTS模型，對(duì)2 700個(gè)中藥粗提物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)13個(gè)粗提物抑制率>50%。

2.2細(xì)胞水平模型細(xì)胞水平模型是在活細(xì)胞條件下研究藥物對(duì)生命體功能的影響，能夠比較準(zhǔn)確地了解藥物的生物學(xué)特性，尤其適用于功能蛋白難以分離、生化分析不能實(shí)現(xiàn)的復(fù)雜靶標(biāo)或多個(gè)靶標(biāo)的研究，可通過(guò)一次試驗(yàn)獲得多個(gè)參數(shù)的高內(nèi)涵信息，還可以得到部分藥物的不良反應(yīng)信息[11]。李璇等[12]采用與多元醇通路激活和糖尿病微血管病變密切相關(guān)的視網(wǎng)膜周細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞，建立了一種適用于中藥醛糖還原酶抑制劑高通量細(xì)胞篩選模型，采用酶促微量反應(yīng)熒光法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)山梨醇含量，可有效避免中藥粗提物或黃酮類提取物對(duì)反應(yīng)體系的干擾。曹婧等[13]將H3R基因質(zhì)粒與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞內(nèi)，建立了一種基于報(bào)告基因的組胺H3受體(H3R)激活劑的高通量細(xì)胞篩選模型，對(duì)20種中藥300個(gè)組分進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)2個(gè)對(duì)H3R有活性的中藥組分。范益軍等[14]將胰升血糖素樣肽-1(GLP-1)受體質(zhì)粒和報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中，建立了一種GLP-1受體激動(dòng)劑的高通量細(xì)胞篩選模型，對(duì)200種中藥的醇提物庫(kù)進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)5種中藥有直接激活GLP-1受體的活性。

2.3動(dòng)物水平模型動(dòng)物水平模型適用于機(jī)制還不明確、缺少有效篩選靶點(diǎn)的疾病(尤其是功能缺失性遺傳病)，或者影響整體器官而非個(gè)別細(xì)胞的疾病，或者器官與細(xì)胞在生理上的聯(lián)系不能在體外構(gòu)建，但對(duì)疾病進(jìn)展至關(guān)重要的情況[15]。Moy等[16]以線蟲為模型動(dòng)物，采用384孔板自動(dòng)顯微成像分析，對(duì)37 200個(gè)化合物及中藥提取物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)未曾報(bào)道的28個(gè)化合物及中藥提取物能夠提高糞腸球菌感染后線蟲生存率，具有潛在抗菌活性。秦帥[17]利用分子克隆、顯微注射、活體攝像等方法，建立由綠色熒光蛋白標(biāo)記巨噬細(xì)胞和巨噬細(xì)胞遷移、聚集的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Zlyz-EGFP)模型，對(duì)296種中藥乙醇提取物的抗炎活性進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)2、3、28、35號(hào)中藥可以顯著抑制Zlyz-EGFP斑馬魚巨噬細(xì)胞向急性損傷部位遷移、聚集。

3　篩選技術(shù)

3.1報(bào)告基因系統(tǒng)報(bào)告基因是指一組編碼易被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因，將其與目的基因融合后，可通過(guò)熒光、比色或發(fā)光的方法檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)來(lái)間接報(bào)告目的基因的表達(dá)調(diào)控。目前應(yīng)用較多的報(bào)告基因有β-半乳糖苷酶、熒光素酶、分泌型堿性磷酸酶及熒光蛋白家族等。韋忠紅等[18]構(gòu)建了pGL3-TNF-α3′UTR熒光素酶報(bào)告基因載體，并與pSVRenilla質(zhì)粒組成雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，共轉(zhuǎn)染至RAW264.7單核巨噬細(xì)胞，用脂多糖誘導(dǎo)后HTS對(duì)TNF-α轉(zhuǎn)錄后調(diào)控有影響的丹參酮類成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隱丹參酮可以對(duì)TNF-α的轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行抑制調(diào)控。

3.2高內(nèi)涵篩選技術(shù)高內(nèi)涵篩選技術(shù)應(yīng)用高分辨率的熒光數(shù)碼影像系統(tǒng)，在細(xì)胞水平上實(shí)現(xiàn)檢測(cè)指標(biāo)的多元化和功能化。在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整的前提下，盡可能同時(shí)檢測(cè)樣品對(duì)細(xì)胞、形態(tài)、生長(zhǎng)、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多環(huán)節(jié)的影響，從單一實(shí)驗(yàn)中獲得大量信息，確定被篩選樣品的生物活性及潛在毒性。其特點(diǎn)是多指標(biāo)、多靶點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)，涉及的靶點(diǎn)包括細(xì)胞膜受體、細(xì)胞器及胞內(nèi)成分等，非常適用于中藥多組分、多靶點(diǎn)的研究。

高內(nèi)涵的生物學(xué)應(yīng)用包括細(xì)胞周期、細(xì)胞毒性、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移、受體內(nèi)化、G蛋白偶聯(lián)受體調(diào)節(jié)劑、活性物質(zhì)釋放(活性氧、胞內(nèi)鈣離子、一氧化氮)等。在細(xì)胞毒性方面，目前已建立一種能夠直接反映細(xì)胞數(shù)目、核形態(tài)學(xué)變化及線粒體聚集等多個(gè)指標(biāo)的高內(nèi)涵模型[19]。它利用三重?zé)晒鈽?biāo)記法，用Hoechst3334(EX350/EM461)標(biāo)記細(xì)胞核呈藍(lán)色，用MitoTracker(EX556/EM573)標(biāo)記細(xì)胞質(zhì)中的線粒體呈紅色，用微管免疫印跡熒光反應(yīng)二抗標(biāo)記AlexaFluor488(EX494/EM519)呈綠色，經(jīng)高內(nèi)涵成像系統(tǒng)分析(藍(lán)色熒光變化與細(xì)胞數(shù)目、核形態(tài)相關(guān)；紅色熒光變化與線粒體聚集相關(guān))，對(duì)樣品造成細(xì)胞毒性的作用機(jī)理進(jìn)行判斷。閆秀川等[20]利用人正常肝細(xì)胞株HL-7702，以TNF-α誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡為篩選模型，建立基于細(xì)胞核和線粒體損傷的高內(nèi)涵篩選方法，對(duì)丹參的抗肝損傷與抗肝纖維化的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)丹酚酸A、丹酚酸B有良好的抗肝細(xì)胞凋亡作用。

3.3熒光標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)熒光猝滅檢測(cè)、熒光偏振檢測(cè)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測(cè)和均相時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測(cè)等熒光檢測(cè)技術(shù)在HTS中有廣泛的應(yīng)用。其原理是被篩選的藥物與熒光標(biāo)記靶標(biāo)相互作用，會(huì)導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的改變，從而可以推測(cè)藥物與靶標(biāo)的相互作用信息[21]。熒光檢測(cè)技術(shù)適用范圍從酶抑制劑篩選，拓展到以離子通道、受體、細(xì)胞為靶點(diǎn)的高通量藥物篩選[22]。由于僅有少數(shù)化合物可以產(chǎn)生熒光，對(duì)于那些缺乏熒光活性的篩選系統(tǒng)，常將篩選系統(tǒng)內(nèi)的分子與熒光活性分子鍵合標(biāo)記，以此作探針來(lái)反映樣品的作用情況[23]。

中藥成分具有復(fù)雜性、多效性、雙向調(diào)節(jié)性等特點(diǎn)，在作用方式上具有多環(huán)節(jié)、多途徑、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。HTS技術(shù)用于研究中藥單體，可根據(jù)獲得的結(jié)果直接評(píng)價(jià)化合物的生物活性；用于研究中藥提取物，可根據(jù)篩選結(jié)果跟蹤提取分離，確定活性組分或活性化合物，減少化合物分離提純的復(fù)雜操作；用于研究中藥復(fù)方，可根據(jù)篩選結(jié)果對(duì)復(fù)方的配伍、比例、活性部位等進(jìn)行篩選，確定最佳復(fù)方組成及組方原理，提高中藥復(fù)方的療效。HTS技術(shù)可充分發(fā)揮中藥多成分同時(shí)檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，顯著降低篩選成本、樣品需要量、工作強(qiáng)度，提高中藥樣品的利用度。

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國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81173523、81303182)；國(guó)家重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目(2012ZX09101202)；國(guó)家973計(jì)劃項(xiàng)目(2012CB723504)。

潘桂湘(E-mail: guixiangp@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.22.040

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1002-266X(2016)22-0105-03

2015-10-07)