吳 雙 楊紅莉 李 浩 孫震曉（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京，100102）

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制何首烏對大鼠肝CYP1A2酶活性及mRNA表達(dá)的抑制作用

吳 雙 楊紅莉 李 浩 孫震曉
（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京，100102）

摘要目的：考察制何首烏水提物對大鼠肝細(xì)胞色素P450酶亞型CYP1A2的酶活性及mRNA表達(dá)的影響。方法：水回流提取得制何首烏水提物，HPLC確定主要成分并測定其含量。大鼠隨機(jī)分為空白對照組、制何首烏水提物組（2 g／kg和20 g／kg），給藥組每天按10 mL／kg量灌胃給予制何首烏水提物，連續(xù)7 d。取肝分離肝微粒體，HPLC測定肝微粒體對CYP1A2酶的底物非那西丁的代謝消除率，考察肝微粒體CYP1A2酶活性；實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測肝組織中CYP1A2基因mRNA的表達(dá)。結(jié)果：與空白對照組相比，制何首烏水提物20 g／kg組大鼠肝CYP1A2酶活性和mRNA的表達(dá)均明顯降低（CYP1A2酶活性，P＜0. 01；CYP1A2的mRNA表達(dá)，P＜0. 05）。結(jié)論：制何首烏水提物20 g／kg對大鼠肝CYP1A2酶活性和mRNA的表達(dá)有明顯抑制作用。

關(guān)鍵詞制何首烏水提物；CYP1A2；大鼠肝微粒體；酶活性；mRNA表達(dá)

Prohibitive Effect of Processed Polygonum Multiflorum on CYP1A2 Activities and mRNA Expressions of Rats

Wu Shuang，Yang Hongli，Li Hao，Sun Zhenxiao
（College of Chinese Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

Abstract Objective：To observe the effects of water extraction of processed Polygonum multiflorum on enzymatic activities and mRNA expressions of CYP1A2 in rats. Methods：The water extraction of processed Polygonum multiflorum was obtained through extraction with water and vacuum drying and the main components were detected by HPLC. Rats were randomly divided into the blank control group and 2 g／kg BW and 20 g／kg BW the water extraction of processed Polygonum multiflorum group. The administration group was continuously given with water extraction of processed Polygonum multiflorum 10 mL／kg a day，and the blank control group was given the same volume distilled water. After successive administration of 7 d，the liver microsomes were prepared from isolated rat liver，and metabolism elimination rates of phenacetin of CYP1A2 enzyme substrate were assayed by HPLC to determine CYP1A2 enzyme activities in rat liver microsomes of each group. Meanwhile，total RNA of rat liver were extracted to determine the mRNA expressions of CYP1A2 in rat liver by qRT-PCR. Results：Compared with those in blank control group，the enzymatic activities and the mRNA expressions of CYP1A2 in 20 g／kg water extraction of processed Polygonum multiflorum treated group were significantly decreased（enzymatic activities of CYP1A2，P＜0. 01；mRNA expressions of CYP1A2，P＜0. 05）. Conclusion：20 g／kg water extraction of processed Polygonum multiflorum has significant inhibitory effect on the enzymatic activities and the mRNA expressions of CYP1A2 in rat's liver microsomes.

Key Words Water extraction of processed Polygonum multiflorum；CYP1A2；Rat liver microsome；Enzymatic activities；mRNA expressions

細(xì)胞色素P450酶（Cytochrome P450，CYP450）是生物界普遍存在的血紅素單加氧酶超家族，參與許多結(jié)構(gòu)各異的外源化合物（藥物、毒物等）以及內(nèi)源性物質(zhì)（甾體、脂肪酸等）的氧化代謝［1］。CYP450通常表現(xiàn)底物特異性和抑制劑敏感性，其活性容易在藥物的作用下受到抑制或激活［2］。已有研究表明，CYP450抑制是有害的藥物間相互作用（Drugdrug Interactions，DDIs）產(chǎn)生的主要原因，占代謝性DDIs的70%［3］。

在人P450s超家族中CYP1～3是參與藥物代謝的主要家族，參與70%～80%的臨床藥物的生物轉(zhuǎn)化，P450s的表達(dá)有種屬特異性［4］。CYP1A2主要在肝中表達(dá)，約占肝CYP450總量的13%，參與約8%的藥物I相代謝反應(yīng)，在許多臨床藥物的代謝中起著重要作用［5］。由于人和大鼠的CYP1A2具有較高的同源性：基因同源性高達(dá)80%［6］，同源氨基酸達(dá)70%［7］，故動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以外推到人，藥物對其活性及表達(dá)的研究有助于了解藥物的相互作用或?qū)λ幬锟赡艿亩拘缘茸龀鲱A(yù)測。

中藥何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb.的干燥塊根，制何首烏則為其炮制加工后的產(chǎn)品，功在補(bǔ)肝腎，益精血，烏須發(fā)，強(qiáng)筋骨，化濁降脂［8］。臨床上制何首烏常與其他藥物配伍使用。本研究以制何首烏水提物為研究對象，考察其對大鼠肝CYP1A2的酶活性和mRNA表達(dá)的影響，有助于預(yù)測制何首烏與臨床其他藥物之間可能存在的DDIs，從而指導(dǎo)其臨床合理用藥，避免不良反應(yīng)的產(chǎn)生，降低潛在的風(fēng)險(xiǎn)。

1　材料與方法

1. 1 藥物 非那西丁（CYP1A2底物）、NADP＋、D-葡萄糖-6-磷酸二鈉、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶均購自北京拜耳迪生物技術(shù)有限公司；2，3，5，4'-二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（批號：140317）、大黃素（批號：140422）、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷（批號140822）、大黃素甲醚（批號：140211）標(biāo)準(zhǔn)品均購自四川維克奇生物技術(shù)有限公司；內(nèi)標(biāo)五味子醇甲（批號：110857201010）購自中國食品藥品檢定研究院；

1. 2 試劑及儀器 考馬斯亮藍(lán)G-250購自Sigma公司；無核酶水購自QIAGEN公司；總RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司；SYBR?Select Master Mix購自ABI公司；PrimeScriptTM第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物工程有限公司；乙腈和甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)所用制何首烏（批號：701001039）購自北京同仁堂飲片有限責(zé)任公司，由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院張貴君教授鑒定為正品。Waters高效液相色譜儀（1525型二元高壓梯度泵系統(tǒng)，2487型二級管陣列檢測器，1500型柱溫控制系統(tǒng)），Waters SymmetryShieldTMC18柱（4. 6 mm×150 mm，5. 0 μm）；Agilent1100高效液相色譜儀，迪馬（鉆石）C18柱（4. 6 mm×250 mm，5. 0 μm）；F8型超細(xì)勻漿機(jī)（德國FLUKO公司）；CU-420電熱恒溫水浴箱（上海一恒科學(xué)儀器公司）；熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；超低溫冰箱（美國REVCO公司）；低溫高速臺(tái)式離心機(jī)（美國Kendro公司）。

2　方法

2. 1 制何首烏水提物制備及其主要成分含測 準(zhǔn)確稱取400 g制何首烏，稍粉碎后回流提取。第1次加10倍量蒸餾水，回流提取2 h，紗布過濾留濾液；第2次加8倍量蒸餾水，回流提取1. 5 h，過濾留濾液。合并兩次所得水提液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至少量，轉(zhuǎn)移后水浴蒸干，減壓干燥得制何首烏水提物（Water Extract of Processed Polygonum multiflorum，PWE）粉末。分別取制何首烏水提物與2，3，5，4'-二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（THSG）、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷（PMEG）、大黃素、大黃素甲醚標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，甲醇溶解，0. 45 μm微孔濾器過濾制成儲(chǔ)備液。參考文獻(xiàn)［9-10］，HPLC方法學(xué)考察后測定制何首烏水提物圖譜（圖1），與標(biāo)準(zhǔn)品比對知1、2、3、4分別為THSG、PMEG、大黃素與大黃素甲醚。根據(jù)測得制何首烏水提物高效液相圖譜峰高選擇THSG、PEMG、大黃素進(jìn)行含量測定，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線（峰面積Y，質(zhì)量x）用外標(biāo)一點(diǎn)法測其主要成分的含量。結(jié)果如表1所示，在相應(yīng)范圍內(nèi)，峰面積Y與質(zhì)量x線性良好。

表1　各主要成分標(biāo)準(zhǔn)曲線及含量測定

圖1　制何首烏水提物HPLC色譜圖

2. 2 動(dòng)物及分組 雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200± 10）g（動(dòng)物合格證號：SCXK 2011-0012），購自維通利華。隨機(jī)分為3組，每組5只。空白對照組、PWE 2和20 g／kg（相當(dāng)人臨床用藥量的10和100倍）。灌胃給予，空白組給予生理鹽水。給藥1次／d，連續(xù)給藥7 d。

2. 3 HPLC檢測大鼠肝微粒體CYP1A2酶活性

2. 3. 1 大鼠肝微粒體的制備 參考文獻(xiàn)［11］，制何首烏灌胃實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠禁食12 h，麻醉處死，將肝臟用冰生理鹽水沖洗干凈后取出剪碎，加入3倍量勻漿液勻漿（冰上操作）。將勻漿6 500 r／min離心15 min（4℃），取上清液再次離心。所得上清在4℃，以1 200 r／min離心60 min，棄上清液得到粉紅色沉淀，重懸緩沖液重懸即制得大鼠肝微粒體（可分裝后于-80℃凍存）。取少量Bradford法測定蛋白含量。2. 3. 2 HPLC方法學(xué)驗(yàn)證 參考文獻(xiàn)［12］，HPLC條件為：流動(dòng)相：A：磷酸氫二銨緩沖鹽（pH 3. 6），B：乙腈；梯度洗脫：B液含量32%保持4 min，由32%線性增長至55%（4～25 min），再由55%降至32%（25 ～35 min）；檢測波長：230 nm；流速：1 mL／min；柱溫：40℃。精密量取不同濃度非那西丁溶液于EP管中，氮吹，加（NH4）2HPO4復(fù)溶，離心取上清進(jìn)行HPLC分析。各濃度設(shè)立3組平行，建立工作曲線，并計(jì)算非那西丁和內(nèi)標(biāo)物的峰面積比（Y）對非那西丁的濃度（X）的回歸方程。選擇低、中、高3個(gè)濃度的非那西丁，與空白對照組大鼠肝微粒體制成質(zhì)量控制樣品。每個(gè)濃度取3份樣品，按前述方法連續(xù)測定5 d，考察其精密度和準(zhǔn)確度。根據(jù)峰面積比與底物濃度，求得方程為Y＝0. 122 3X-0. 007 9（r＝0. 999 9），表明非那西丁在0. 687 5～22. 00 μg／mL濃度范圍內(nèi)線性良好。測得3種濃度下回收率為96. 57%～100. 6%，RSD為0. 79%～3. 14%，精密度為1. 53%～5. 68%，大鼠肝微粒體內(nèi)源性雜質(zhì)對樣品的測定沒有影響，穩(wěn)定性和日內(nèi)精密度符合實(shí)驗(yàn)要求（RSD≤10%），HPLC方法可行，高效。

2. 3. 3 CYP1A2酶活性的測定［13］孵育體系（反應(yīng)總體積200 μL）：非那西丁（25 μmol／L），大鼠肝微粒體蛋白（2 g／L），磷酸緩沖溶液（0. 1 mol／L，PH 7. 4）。37℃水浴中振蕩3 min，加入NADPH發(fā)生體系：NADP＋（2 mmol／L），D-葡萄糖葡萄糖-6-磷酸二鈉（40 mmol／L）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（4 UI／L）、MgCl2（40 mmol／L），37℃反應(yīng)30 min。取出，立即加入冰乙腈終止反應(yīng)，加入10 μL內(nèi)標(biāo)五味子醇甲（0. 06 g／L），1 200 r／min離心20 min（4℃）。吸取上清液，氮吹，加200 μL（NH4）2HPO4復(fù)溶，9 400 r／min離心15 min，取上清液進(jìn)行HPLC分析（進(jìn)樣量30 μL）。按下列公式計(jì)算底物代謝清除百分率：

2. 4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR考察大鼠肝CYP1A2 mRNA表達(dá)

2. 4. 1 肝組織總RNA的提取 用Trizol試劑盒提取各組大鼠肝組織總RNA，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

2. 4. 2 RNA的質(zhì)量檢測 分別吸取5 μL各組大鼠肝總RNA樣品與1 μL 6×上樣緩沖液（Loading Buffer）充分混勻，在制備的1%瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣，使RNA由負(fù)極向正極電泳（180 V，10 min）。結(jié)束后，在紫外透射檢測儀上觀察電泳結(jié)果并拍照。取4 μL RNA與196 μL無核酶水混勻，加入微量比色杯中，紫外分光光度計(jì)測RNA吸收值。如圖2，提取的總RNA中28 s亮度為18 s兩倍，說明完整性好；A260／A280值在1. 8～2. 0之間，A260／A230值大于2. 0，說明所得總RNA純度較高，酶抑制物殘留少，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

圖2　各組大鼠肝臟總RNA瓊脂糖凝膠電泳

2. 4. 3 引物特異性驗(yàn)證 Rat-CYP1A2與β-肌動(dòng)蛋白（內(nèi)參）引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成，引物序列見表2。內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白與目的基因的溶解曲線由MiniOptinTMReal-Time PCR System軟件自帶的溶解曲線程序測得，其中橫坐標(biāo)表示溫度，縱坐標(biāo)則表示對應(yīng)的熒光強(qiáng)度，波峰的個(gè)數(shù)代表擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。圖3為CYP1A2基因的cDNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定的溶解曲線，可知在80～90℃呈現(xiàn)單一特異性峰，說明引物特異性好，即實(shí)時(shí)熒光定量PCR中所測熒光均為擴(kuò)增目的基因cDNA得到的DNA雙鏈發(fā)出。

表2　PCR引物序列

圖3　大鼠CYP1A2（目的基因）和β-actin（內(nèi)參基因）實(shí)時(shí)熒光定量PCR的溶解曲線

2. 4. 4 CYP1A2 mRNA表達(dá)量測定 以1. 5. 1記述方法提取的大鼠肝組織總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成第1條互補(bǔ)脫氧核糖核酸鏈（cDNA）。然后通過特異性引物PCR擴(kuò)增CYP1A2基因和內(nèi)參管家基因β-actin，PCR反應(yīng)體系包含：2 μL cDNA，10 μL Power SYBR?Green PCR Master Mix和上、下游引物各0. 54 μL。無核酶水補(bǔ)足至總體積20 μL。反應(yīng)程序均設(shè)定為：預(yù)變性95℃，10 min；變性95℃，15 s；退火延伸60℃，1 min。循環(huán)40次。用PCR儀自帶軟件進(jìn)行熒光定量分析，得出Ct值，結(jié)果用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的表達(dá)量。

3　結(jié)果

3. 1 制何首烏水提物對大鼠肝微粒體CYP1A2酶活性的影響 如表3所示，對比空白對照組與各給藥組的大鼠肝微粒體對底物非那西丁代謝消除百分率，可知人臨床用藥100倍劑量（20 g／kg）的制何首烏水提物能顯著抑制大鼠肝CYP1A2酶的活性（P＜0. 01）。

表3　制何首烏水提取物對大鼠肝微粒體CYP1A2 mRNA表達(dá)的影響（±s，n＝5）

表3　制何首烏水提取物對大鼠肝微粒體CYP1A2 mRNA表達(dá)的影響（±s，n＝5）

注：與空白對照組相比，*P＜0. 05，**P＜0. 01。

組別　　代謝清除率／%空白對照19. 8±2. 0 PWE（2 g／kg）　17. 0±2. 8 PWE（20 g／kg）　13. 2±1. 6**

3. 2 制何首烏水提物對大鼠肝微粒體CYP1A2 mRNA表達(dá)的影響 如表4所示，對比給藥組與空白對照組的大鼠肝CYP1A2 mRNA，制何首烏水提物20 g／kg組大鼠肝CYP1A2 mRNA的表達(dá)受到明顯抑制（P＜0. 05）。

表4　制何首烏水提取物對大鼠肝微粒體CYP1A2 mRNA表達(dá)的影響（±s，n＝5）

表4　制何首烏水提取物對大鼠肝微粒體CYP1A2 mRNA表達(dá)的影響（±s，n＝5）

組別　CYP1A2 mRNA相對表達(dá)量（2-ΔΔCt）空白對照1. 00±0. 01 PWE（2 g／kg）　0. 78±0. 04 PWE（20 g／kg）　0. 70±0. 02*

4　討論

本研究發(fā)現(xiàn)，20 g／kg制何首烏水提物（約臨床用藥100倍劑量）能顯著抑制大鼠肝微粒體CYP1A2酶活性及CYP1A2 mRNA的表達(dá)，提示PWE可以在基因轉(zhuǎn)錄水平上下調(diào)CYP1A2的表達(dá)，從而影響其酶活性，這與課題組前期何首烏水提物10 g／kg（相當(dāng)于人臨床用藥量的100倍）灌胃大鼠可以抑制大鼠肝CYP1A2酶活性及CYP1A2 mRNA的表達(dá)的研究結(jié)果一致［14］。

CYP1A2不僅是人肝P450s主要成員之一，該酶在人群中表達(dá)也具有遺傳多態(tài)性，可產(chǎn)生2種藥物代謝差異表型：慢代謝型、快代謝型。CYP1A2除了參與代謝包括非那西丁、咖啡因、華法林等藥物之外，還涉及代謝活化前致癌物和毒素的過程［15］。這些藥物中有些治療窗較窄（如華法林2. 0～3. 0 ng／mL），極易達(dá)到中毒劑量。Nishimura［16］等研究表明，P450s抑制是臨床治療藥物的DDIs主要的成因之一，藥物對CYP450s抑制使其血藥濃度升高，如果藥物治療窗較窄，可能致使協(xié)同藥物產(chǎn)生毒性。因此，當(dāng)CYP1A2抑制劑與經(jīng)其代謝的藥物聯(lián)用時(shí)，CYP1A2被抑制，尤其是慢代謝者，對被代謝藥物的代謝減慢，清除率降低，將會(huì)使得藥物在體內(nèi)蓄積，從而產(chǎn)生DDIs，引發(fā)一系列嚴(yán)重的不良反應(yīng)或毒副作用。

制何首烏因其烏發(fā)補(bǔ)益之功效，在臨床上得到廣泛使用。近年來，有文獻(xiàn)報(bào)道制何首烏可導(dǎo)致不良反應(yīng)，特別是存在肝毒性，造成肝損傷［17］。對于制何首烏的肝毒性研究也在不斷深入［18-19］，但對于其產(chǎn)生毒性的機(jī)制還有待進(jìn)一步明確。探究制首烏導(dǎo)致肝毒性的機(jī)制，有助于防范制何首烏引起的不良反應(yīng)。制何首烏抑制CYP1A2酶活性與mRNA的表達(dá)，因此臨床上需注意制何首烏與藥物聯(lián)用時(shí)可能產(chǎn)生的不良后果。研究制首烏與肝臟藥物代謝酶CYP1A2的相互作用，不僅為臨床安全用藥提供依據(jù)，也為揭示制何首烏相關(guān)肝毒性提供思路。最近臨床研究表明，何首烏相關(guān)的肝損傷患者的CYP1A2的遺傳多態(tài)性表現(xiàn)與正常對照組人群的不同，表現(xiàn)CYP1A2*1C比例顯著升高，意味著何首烏引起肝損傷患者的CYP1A2酶活性降低［20］。由此推測，制何首烏相關(guān)的肝毒性可能與人群中CYP1A2遺傳多態(tài)性及制何首烏雙重作用下的CYP1A2酶活性急劇下降，造成制何首烏中某些肝毒性成分在肝臟中積聚有關(guān)，相關(guān)結(jié)論需要進(jìn)一步臨床及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。另外，制何首烏中何種成分可以抑制CYP1A2酶活性，以及制何首烏導(dǎo)致肝毒性的分子作用機(jī)制，都還有待進(jìn)一步的研究。

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（2015 -06 -19收稿 責(zé)任編輯：張文婷）

中圖分類號：R285. 5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

doi：10. 3969／j. issn. 1673 -7202. 2016. 03. 028

通信作者：孫震曉（1967. 01—），女，博士，教授，研究方向：主要從事中藥分子藥理及毒理學(xué)研究，Tel：（010）84738646，E-mail：sunzxcn＠hotmail. com

作者簡介：吳雙（1992. 08—），女，北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院碩士研究生；楊紅莉（1987. 04—），女，北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院碩士研究生，為共同第一作者

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號：81473418）