李曉鵬2,劉昕1 ,張忠明1,何守貴2,曹磊1,張衛(wèi)兵1
(1.甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院,甘肅 蘭州730000;2. 甘肅金亞科技發(fā)展有限公司,甘肅 蘭州730000)
乳酸菌的組合發(fā)酵條件優(yōu)化
李曉鵬2,劉昕1 ,張忠明1,何守貴2,曹磊1,張衛(wèi)兵1
(1.甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院,甘肅 蘭州730000;2. 甘肅金亞科技發(fā)展有限公司,甘肅 蘭州730000)
以甘南牧區(qū)家庭自制牦牛乳酸奶中分離篩選出的乳酸菌為試驗菌株,將其進行組合發(fā)酵試驗,以期為工業(yè)生產提供理論依據(jù)。采用單因素試驗考察了菌種組合比例、發(fā)酵溫度、加糖量等因素對酸奶品質的影響,結果表明最佳菌株組合為Q2∶G4,該組合的最佳發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度43.0 ℃、接種量4.0 %、菌株Q2∶G4的比例為1∶3。
組合發(fā)酵; 乳酸菌;優(yōu)化
人類對乳酸菌發(fā)酵劑的研究始于19世紀末至20世紀初,Grigoroff在1905年首次對酸奶細菌學的研究,標志著人們利用自然環(huán)境中“天然乳酸菌”時代的結束[1-3]。而Petter和Lolkema在1950年發(fā)現(xiàn)酸乳生產中共同使用S.t和L.b產酸速率明顯加快則是傳統(tǒng)液體發(fā)酵劑應用的開始[4-6]。液體發(fā)酵劑使用方便、價廉,且大小生產廠家均可自行調制的特點,極大擴充了酸奶的生產領域,但在酸奶工業(yè)的進一步集約化、規(guī)模化發(fā)展中,傳統(tǒng)發(fā)酵劑多次活化和擴培的煩瑣工藝越來越不能滿足要求;伴隨著低溫干燥生物技術的發(fā)展,西方乳業(yè)發(fā)達國家已開發(fā)出了用量小、郵寄儲藏方便,能直接投入生產的多功能商品化發(fā)酵劑。
我國在發(fā)酵劑的研究方面比較滯后,目前還沒有一家專業(yè)化發(fā)酵劑生產廠商。但我國的酸奶生產中,有80%以上的酸奶使用的發(fā)酵劑是濃縮型凍干發(fā)酵劑,其中絕大部分是購自國外知名發(fā)酵劑公司,導致發(fā)酵劑市場被國外企業(yè)壟斷,每年花費高達15億元來引進酸奶發(fā)酵劑[7]。因此,對于加強國內自主研發(fā)乳酸菌發(fā)酵劑制備的研究水平和工業(yè)化生產刻不容緩。
本研究是以甘南牧區(qū)家庭自制牦牛乳酸奶中分離篩選出的乳酸菌為試驗菌株,將其進行組合發(fā)酵試驗,以期為工業(yè)生產提供理論依據(jù)。
1.1 材料與設備
1.1.1 菌種
本實驗室自甘南牧區(qū)發(fā)酵乳中分離篩選出的菌株Q2、Q5、G1、G3、G4、G6。
1.12 試劑
胰蛋白胨,酵母粉,酵母膏,瓊脂糖,牛肉膏,蛋白胨,葡萄糖,磷酸氫二鉀(鈉),磷酸二氫鉀(鈉),硫酸氫二鉀(鈉),硫酸二氫鉀(鈉),氯化鈣,氯化鈉,氯化鉀,硫酸鎂,硫酸亞鐵,氯化鈉,硫酸錳,乙醇,雙乙酰,氫氧化鈉,以上試劑均為分析純。脫脂奶粉(黑龍江完達山)為市售。
1.13 培養(yǎng)基
MRS固體培養(yǎng)基、SL培養(yǎng)基、Elliker培養(yǎng)基、脫脂乳固體培養(yǎng)基及脫脂乳液體培養(yǎng)基。
TJA 培養(yǎng)基:番茄汁50mL,酵母膏5g,牛肉膏10g,乳糖20g,葡萄糖2g,磷酸氫二鉀2g,吐溫-801mL,乙酸鈉5g,加蒸餾水至1000mL,調節(jié)pH6.8±0.2,于121℃滅菌15min備用[8]。
APT培養(yǎng)基:胰胨10g,吐溫-80lmL,酵母提取物5g,氯化鈉5g,檸檬酸鈉5g,硫酸鎂0.8g,葡萄糖10g,氯化錳0.14g,磷酸氫二鉀5g,硫酸亞鐵0.04g,加蒸餾水至1000mL,調整pH值為6.7~7.0,121 ℃滅菌15min[8]。
1.14 設備
SW-CJ-2FD超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司),YX-280A高壓滅菌鍋(上海三申醫(yī)療器械有限公司),HG303-4電熱恒溫培養(yǎng)箱(南京實驗儀器廠),XSP-18S顯微鏡(上海蔡康光學儀器有限公司),PB-203電子天平(Mettler-Toledo公司)pHS-25數(shù)顯pH計(上海精密科學儀器廠), KUBOTA3740冷凍離心機(日本KUBOTA久保田公司),YQX-1型厭氧培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠),冷凍干燥機(北京博醫(yī)康醫(yī)療器械廠)。
1.2 試驗方法
1.2.1 球菌與桿菌間的組合發(fā)酵
篩選菌株經過活化后,將其中的2株球菌與4株桿菌分別組合,以3%(V/V)的接種量接種于滅菌的牛奶中,41℃發(fā)酵,凝乳后放入冰箱中4℃冷藏24h后,測定其滴定酸度及黏度,并進行感官綜合評價。球菌與桿菌的組合見表5。
1.2.2 復配比例的篩選
菌株Q2、G4活化后,將其發(fā)酵液分別按1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1(V/V)進行復配,以3%(V/V)的接種量接種于含6%(m/m)蔗糖的滅菌牛奶中,41℃培養(yǎng),凝乳后放入冰箱中4℃冷藏24h后,測定其酸度及黏度,并進行感官綜合評價。
1.2.3 發(fā)酵溫度的篩選
菌株Q2、G4活化后,將菌株Q2、Q4的發(fā)酵液按1∶3(V/V)進行復配后,以3%(V/V)的接種量接種于含6%(m/m)蔗糖的滅菌牛奶中,分別置于37、39、41、43、45℃培養(yǎng),凝乳后放入冰箱中4℃冷藏24h后,測定其酸度及黏度,并進行感官綜合評價。
1.2.4 接種量的篩選
菌株Q2、G4活化后,將菌株Q2、Q4的發(fā)酵液按1∶3(V/V)進行復配后,分別以2、3、4、5%(V/V)的接種量接種于含6%(m/m)蔗糖的滅菌牛奶中,置于43℃培養(yǎng),凝乳后放入冰箱中4℃冷藏24h后,測定其酸度及黏度,并進行感官綜合評價。
2.1 球菌與桿菌間的組合發(fā)酵
表1 組合發(fā)酵試驗結果
由表1可見,8個組合所發(fā)酵酸奶的黏度在4.20~10.20 dpa. s之間,與市場上酸奶的黏度3~4dpa.s相比,8個組合所發(fā)酵的酸奶都有很好的黏度,且8個組合所發(fā)酵酸奶的黏度差異顯著(P<0.05)。B3組合的黏度最高,A4組合的黏度最低,8個組合所發(fā)酵酸奶的黏度從強至弱的順序為B3>A2>A3>B4>B2>A1>B1>A4。8個組合所發(fā)酵酸奶的酸度在74~100°T,滿足酸奶奶酸度70~110°T之間的要求,且8個組合所發(fā)酵酸奶的酸度存在差異顯著(P<0.05)。8個組合發(fā)酵酸奶的酸度從高至低的順序為:A3>A2>B3>A1>B4>B2>A4>B1。從感官評價結果來看,8個組合所發(fā)酵酸奶的綜合評價分值在79~88之間,8個組合發(fā)酵酸奶的綜合評價分值存在差異顯著(P<0.05),其中,A3組合發(fā)酵酸奶的綜合評價結果最好,A2組合發(fā)酵酸奶的綜合評價結果最差。綜上所述,篩選出A3組合為最佳組合,即菌株Q2和G4的組合為最佳組合。
2.2 復配比例的篩選
表2 菌種復配比例篩選結果
由表2可見,隨著發(fā)酵劑中菌株復配比例不同,所發(fā)酵酸奶的黏度、滴定酸度及感官評價分值都出現(xiàn)明顯的變化。5種不同發(fā)酵劑所發(fā)酵酸奶的黏度在7.00~9.10dPa.s之間,且存在顯著差異(P<0.05)。復配比例為1∶3(V/V)時所發(fā)酵酸奶的黏度最高,復配比例為1∶1(V/V)時發(fā)酵劑所發(fā)酵酸奶的黏度最低。滴定酸度結果顯示,5種不同發(fā)酵劑所發(fā)酵酸奶的滴定酸度在86.00~96.00 °T之間,且存在顯著的差異(P<0.05)。復配比例為1∶3(V/V)時所發(fā)酵酸奶的酸度最高,復配比例為1∶1(V/V)時所發(fā)酵酸奶的酸度最低,感官評價結果顯示,復配比例為1∶3(V/V)時所發(fā)酵酸奶的感官評價分值最高,與其余4種發(fā)酵劑所發(fā)酵酸奶的感官評價分值相比存在顯著的差異(P<0.05)。綜上所述,最終篩選出最佳復配比例為1∶3,因為在接種比例為1∶3時,所發(fā)酵酸奶的黏度比較高,組織狀態(tài)比較好,乳清析出也比較少,且發(fā)酵酸奶的滋氣味也比較好。
2.3 發(fā)酵溫度的篩選
表3 單因素試驗最佳發(fā)酵溫度篩選結果
由表3可見,隨著發(fā)酵溫度的變化,所發(fā)酵酸奶的黏度、滴定酸度及感官評價分值都出現(xiàn)較大的變化。著發(fā)酵溫度的逐步升高,5個溫度下所發(fā)酵酸奶的黏度也呈現(xiàn)遞增的趨勢。5個溫度下所發(fā)酵酸奶的黏度在12~15dPa.s,說明5個溫度下所發(fā)酵酸奶都具有很好的黏度。37℃下發(fā)酵的酸奶黏度最高,45℃下發(fā)酵的酸奶黏度最低,且不同溫度下所發(fā)酵的酸奶黏度存在顯著性差異(P<0.05),因為發(fā)酵溫度高時菌株發(fā)酵產酸比較快,酪蛋白凝結過快造成乳清析出,所以黏度就比較低。隨著發(fā)酵溫度的逐步升高,5個溫度下所發(fā)酵酸奶的酸度也呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。5個溫度下所發(fā)酵酸奶的酸度在85~100°T之間,在酸奶產品要求的70~110°T之內。43℃下所發(fā)酵酸奶的酸度最高,37℃下所發(fā)酵酸奶的酸度最低,且5個溫度下所發(fā)酵酸奶的酸度存在顯著性差異(P<0.05),因為所篩選菌株均為高溫發(fā)酵菌株,在低溫狀態(tài)下代謝比較慢,產酸能力也比較弱。隨著發(fā)酵溫度的逐步升高,5個溫度下所發(fā)酵酸奶的感官評價分值也呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。43℃下所發(fā)酵酸奶的感官評價分值最高,37℃下所發(fā)酵酸奶的感官評價分值最低,且5個溫度下所發(fā)酵酸奶的感官評價分值存在顯著性差異(P<0.05),因為發(fā)酵溫度過高,菌株發(fā)酵酸奶的組織狀態(tài)比較差;發(fā)酵溫度過低,菌株產酸速率比較低,發(fā)酵酸奶的滋氣味比較差。綜上所述,篩選出43℃為最佳發(fā)酵溫度。
2.4 接種量的篩選
表4 單因素試驗最佳接種量試驗結果
由表4可見,不同的接種量對發(fā)酵酸奶的黏度、酸度及感官評價分值均有較大的影響。黏度測定結果顯示,4個接種量時所發(fā)酵酸奶的黏度都在9~11dPa.s之間,與市場現(xiàn)有酸奶的黏度相比偏高。2%接種量時所發(fā)酵酸奶的黏度最高,4%接種量時所發(fā)酵酸奶的黏度最低,4個接種量時所發(fā)酵酸奶的黏度存在顯著性差異(P<0.05),因為接種比例大,菌體發(fā)酵過程中菌體數(shù)增長比較快,產生的乳酸比較多,產酸過快容易造成乳清析出。酸度測定結果顯示,4個接種量時所發(fā)酵酸奶的酸度在90~100°T之間,在酸奶產品要求的70~110°T之內。4%接種量時所發(fā)酵酸奶的酸度最高,2%接種量時所發(fā)酵酸奶的酸度最低,4個接種量時所發(fā)酵酸奶的酸度存在顯著性差異(P<0.05)。感官評價結果顯示,4% 接種量時所發(fā)酵酸奶的感官評價分值最高,2%接種量對應發(fā)酵酸奶的感官評價分值最低,4個接種量時所發(fā)酵酸奶的酸度存在顯著性差異(P<0.05)。綜上所述,在接種量為4%時,菌株發(fā)酵酸奶的感官狀態(tài)最好,因此,篩選出最佳接種量為4%。
通過組合發(fā)酵試驗篩選出菌株Q2∶G4為最佳組合,該組合的最佳發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度43.0℃、接種量4.0%、菌株Q2∶G4的比例為1∶3時,所發(fā)酵酸奶的組織狀態(tài)好,感官評價值最高,為94.90分。
[1] 甘伯中,杜寧娟,李帆,等.甘南牧區(qū)酸奶中乳酸菌的分離與發(fā)酵性能研究[J].食品科學,2009,30(3):204-208.
[2] 伊利端.幾種泡菜的安全性研究與優(yōu)良乳酸菌的分離、鑒定[D]. 北京:中國農業(yè)大學碩士學位論文,2005.
[3] 孫福春.甘肅甘孜地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌分離、篩選、鑒定的研究[D]. 哈爾濱:東北農業(yè)大學碩士學位論文,2007.
[4] El.Shafei, Ibrahim, Tawfrk. Beneficial uses of locally isolated lactic acid [J].Egyptian Journal of Dairy Science.2002,30(1):15-25.
[5] 張?zhí)m威,鄂志強,萬海峰,等.乳酸菌增菌培養(yǎng)基篩選及干燥保護劑的選擇[J].中國乳品工業(yè),2000,28(2):7-9.
[6] 李霞.保加利亞乳桿菌超濃縮培養(yǎng)及生物學變化規(guī)律[D].哈爾濱:東北農業(yè)大學碩士學位論文.2006
[7] 奚震,劉然,力守朋,等.直投式乳酸菌發(fā)酵劑的制備團[J].食品研究與開發(fā).2003,24(6):25.
[8] 李季倫,宋大康.微生物生理學[M].北京:北京農業(yè)大學出版社,1993.
蘭州市科技計劃項目(項目編號2015-3-138)
Q935
A