不同濃度鍶對 MC3T3-E1 細(xì)胞增殖、ALP 活性及成骨分化的影響

李忠海 韓麗偉 趙彥濤 楊梟雄 衷鴻賓 王福利 侯樹勛

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不同濃度鍶對 MC3T3-E1 細(xì)胞增殖、ALP 活性及成骨分化的影響

李忠海 韓麗偉 趙彥濤 楊梟雄 衷鴻賓 王福利 侯樹勛

( 81201380 )；軍事醫(yī)學(xué)項目 ( 13CXZ028，AWS14C007 )；北京市科技新星項目 ( Z1511000003150134 )

作者單位：100048 北京，解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院、全軍骨科研究所、北京市骨科植入醫(yī)療器械工程技術(shù)研究中心通信作者：趙彥濤，Email: 45828016@qq.com

【摘要】目的 觀察不同濃度鍶 ( Sr ) 對 MC3T3-E1 細(xì)胞增殖、堿性磷酸酶 ( alkaline phosphatase，ALP ) 活性及成骨分化的影響規(guī)律。方法 體外培養(yǎng) MC3T3-E1 細(xì)胞，將濃度不同的 Sr 作用于成骨細(xì)胞系MC3T3-E1 細(xì)胞，利用 MTT 法檢測細(xì)胞增殖活性，PNPP 法檢測細(xì)胞 ALP 活性，RT-PCR 法檢測幾種成骨標(biāo)志分子 mRNA 的表達(dá)情況。結(jié)果 Sr 離子濃度＞500 μg / ml 時，成骨細(xì)胞增殖明顯降低，生長受到抑制；濃度在 3.91～250.00 μg / ml 時，促進(jìn)作用達(dá)到最高水平；之后隨著濃度降低，促進(jìn)作用逐漸減弱。在觀察范圍內(nèi)，Sr 對成骨細(xì)胞 ALP 活性的影響呈明顯的濃度依賴性，Sr 能顯著的增加 MC3T3-E1 的 ALP 活性，濃度在3.91～125 μg / ml 范圍時，成骨細(xì)胞 ALP 活性顯著提高。RUNX2、ALP、Col1 等 mRNA 的表達(dá)量隨 Sr 的濃度在一定范圍內(nèi)逐漸升高，Sr 濃度為 31.25 μg / ml 左右時，其 mRNA 表達(dá)量達(dá)到峰值。結(jié)論 Sr 促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化具有顯著的劑量依賴關(guān)系，超過最優(yōu)濃度范圍其促進(jìn)作用下降，在一定閾值后甚至?xí)霈F(xiàn)毒性抑制作用。

【關(guān)鍵詞】鍶；成骨細(xì)胞；細(xì)胞分化；細(xì)胞增殖；生物活性

鍶 ( Sr ) 是與鈣元素同族的堿土金屬元素，是人體骨中必需元素之一。在成骨活性元素的研究中，人們發(fā)現(xiàn) Sr 具有促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收的雙重作用。在骨質(zhì)發(fā)生的早期，缺乏 Sr 可以導(dǎo)致骨形成不足及骨鈣化不良，新骨形成的初期，Sr 離子的濃度較高，隨著骨基質(zhì)的成熟，Sr 離子逐漸被鈣離子替換，Sr 離子在骨基質(zhì)中保持一定的比例以維持骨質(zhì)的正常功能；而骨質(zhì)中 Sr 的含量還與骨質(zhì)的抗壓強(qiáng)度大小密切相關(guān)[1]。目前研究表明，Sr 可以顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的生長復(fù)制，刺激新骨形成；體外成骨前體細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，含 Sr 組細(xì)胞培養(yǎng) 24 h 后，DNA 合成量是空白組的 3～4 倍，而成骨細(xì)胞內(nèi)的膠原和非膠原蛋白增加了 35%[2-4]。然而，Sr 離子對成骨細(xì)胞的增殖及分化的濃度依賴性范圍及其具體影響規(guī)律未見相關(guān)報道。本實驗將濃度不同的 Sr 作用于成骨細(xì)胞系 MC3T3-E1 細(xì)胞，觀察不同濃度 Sr對成骨細(xì)胞的增殖及分化的影響，以期為目前各種摻 Sr 材料的研究和應(yīng)用提供參考依據(jù)。

資料與方法

一、實驗材料與設(shè)備

SrCl2( 國藥，中國 )、α-MEM 培養(yǎng)基 ( Gibco，美國 )、特級胎牛血清 ( Hyclone，美國 )、雙抗( Hyclone，美國 )、0.25% 胰蛋白酶 ( Hyclone，美國 )、MTT 試劑 ( Sigma，美國 )、PNPP ( 大連美侖生物 )、MgCl2( 北京化工廠，中國 )、二乙醇胺 ( 大連美侖生物，中國 )、RT 試劑盒 ( 寶生生物，中國 )、PCR 試劑盒 ( 寶生生物，中國 )、PCR 引物 ( 上海生工合成，中國 )。

二、實驗方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)：MC3T3-E1 細(xì)胞用含 10% FBS 的α-MEM 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞 80% 融合時，接種到細(xì)胞培養(yǎng)板。用 PBS 洗滌細(xì)胞 1 次，然后加入 0.25%胰酶進(jìn)行消化，1000 r / min 離心 5 min 后用含 10% FBS 的 α-MEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104/ ml。96 孔板每孔接種 100 μl，12 孔板每孔接種 2 ml。

2. 藥物干預(yù)：細(xì)胞接種到培養(yǎng)板 24 h 后，每組分別加入 2000.00、1000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49、0.24 μg / ml 的 Sr 進(jìn)行藥物干預(yù)。

3. MTT 實驗：藥物干預(yù) 72 h 后，取其中一個 96孔板進(jìn)行 MTT 實驗。棄去原培養(yǎng)基后，用 PBS 洗滌細(xì)胞 1 次，加入用 α-MEM 培養(yǎng)基稀釋的 5 mg / ml 的 MTT 溶液，每孔 100 μl。37 ℃ 孵育 4 h，棄上清液，加 DMSO 150 μl，震蕩 10 min，490 nm 波長檢測吸光度，計算相對增殖率。

4. PNPP 法檢測細(xì)胞堿性磷酸酶 ( alkaline phosphatase，ALP ) 活性：細(xì)胞加藥干預(yù) 72 h 后，取另一個 96 孔板進(jìn)行 ALP 活性的測定。PNPP 反應(yīng)液的配制：6.7 mmol / L PNPP、25 mmol / L 二乙醇胺、1 mmol / L MgCl2溶于 PBS ( pH 7.4 ) 中。棄去原培養(yǎng)基，用 PBS 沖洗細(xì)胞 1 次，每孔加上述 PNPP 反應(yīng)液 100 μl，30 min 后加 0.1 N 氫氧化鈉終止反應(yīng)，405 nm 波長檢測吸光度。

5. 細(xì)胞總 RNA 的提?。杭?xì)胞加藥干預(yù) 72 h 后取 12 孔板進(jìn)行細(xì)胞總 RNA 的提取。棄去原培養(yǎng)基，用 PBS 沖洗 1 次。每孔加入 TRIzol 溶液 0.5 ml，靜置5 min 后反復(fù)吹打細(xì)胞，使其裂解，將裂解液收集到1.5 ml 無 RNA 酶離心管中。每管加入 0.1 ml 氯仿，劇烈混勻，靜置 5 min 后 4 ℃、12 000 g 離心 15 min。離心后液體分層，取上層透明水相到另一個 1.5 ml 離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后靜置 5 min，4 ℃、12 000 g 離心 15 min。離心后棄去管中液體，用 75% 乙醇洗滌沉淀，4 ℃、7500 g 離心 15 min。離心后棄去液體，晾干沉淀，用 10 μl 無 RNA 酶水溶解。紫外分光光度計檢測總 RNA 的濃度及純度。

6. RT-PCR 反應(yīng)：取待測樣品總 RNA 100 ng 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成 cDNA。將生成的 cDNA 稀釋成100 ng / μl，取 1 μl 稀釋后的 cDNA 進(jìn)行 RT-PCR 反應(yīng)。按照表 1 配制成 PCR 反應(yīng)體系。反應(yīng)條件見表 2，引物序列見表 3。

7. 細(xì)胞生長形態(tài)觀察：分別在培養(yǎng) 1 天和 3 天時間點用倒置顯微鏡記錄細(xì)胞生長狀態(tài)。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用 SPSS 11.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)用x-±s 來表示，采用 t 檢驗進(jìn)行分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表 1　PCR 反應(yīng)體系Tab.1 PCR reaction system

表 2　PCR 反應(yīng)條件Tab.2 PCR reaction conditions

結(jié) 果

一、不同濃度 Sr 對 MC3T3-E1 細(xì)胞增殖的影響

MTT 實驗提示，Sr 濃度為 1.95 μg / ml 時開始促進(jìn)細(xì)胞的增殖 ( P＜0.05 )，到 Sr 濃度為 3.91～250.00 μg / ml 時促進(jìn)作用達(dá)到較高水平 ( P＜0.05 )，繼續(xù)增大 Sr 濃度，細(xì)胞增殖活力開始下降，至超過500 μg / ml 濃度時出現(xiàn)了細(xì)胞毒性，增殖抑制作用隨濃度增加顯著增強(qiáng)，在 8 mg / ml 以上濃度細(xì)胞不能存活 ( 圖 1 )。

圖 1　Sr 對 MC3T3-E1 細(xì)胞增殖的影響情況Fig.1 Effects of strontium on the proliferation of MC3T3-E1 cells

二、不同濃度 Sr 對 MC3T3-E1 細(xì)胞 ALP 活力的影響

Sr 濃度為 1.95 μg / ml 時，ALP 活性出現(xiàn)升高趨勢；隨著濃度達(dá)到 3.91～125 μg / ml 范圍時，ALP 活性顯著提高 ( P＜0.05 )；Sr 濃度至 250 μg / ml 時，ALP活力顯著降低 ( P＜0.05 )，水平接近對照組 ( 圖 2 )。

圖 2　Sr 對 MC3T3-E1 細(xì)胞 ALP 活力的影響情況 ( 7 天 )Fig.2 Effects of strontiumon ALP activity in MC3T3-E1 cells ( 7 days )

三、不同濃度 Sr 對 MC3T3-E1 細(xì)胞成骨特異性分子基因表達(dá)的影響

從 RT-PCR 實驗可以看出，ALP、COL1α 以及轉(zhuǎn)錄因子 RUNX2 的 mRNA 含量均在加入 31.25 μg / ml Sr 后明顯升高 ( P＜0.05 )，在此基礎(chǔ)上加大或減小 Sr的用量，其表達(dá)水平均下降，在高濃度 250 μg / ml時已接近對照組水平，在低濃度 7.81 μg / ml 時其促進(jìn)效應(yīng)也接近對照組水平 ( 圖 3～5 )。

圖 3　不同濃度 Sr 對 MC3T3-E1 細(xì)胞 ALP 表達(dá)水平的影響Fig.3 Effects of different concentrations of strontiumon on the expression of ALP in MC3T3-E1 cells

圖 4　不同濃度 Sr 對 MC3T3-E1 細(xì)胞 COL1 表達(dá)水平的影響Fig.4 Effects of different concentrations of strontium on the expression of COL1 in MC3T3-E1 cells

圖 5　不同濃度 Sr 對 MC3T3-E1 細(xì)胞 RUNX2 表達(dá)水平的影響Fig.5 Effects of different concentrations of strontium on the expression of RUNX2 in MC3T3-E1 cells

四、細(xì)胞的顯微鏡觀察

顯微鏡觀察可見，成骨細(xì)胞成三角或多角形外觀。觀察后 1 天細(xì)胞貼壁，伸展形態(tài)正常，細(xì)胞折光度良好，胞質(zhì)透亮，外觀平滑飽滿。細(xì)胞成群集落樣生長，推測這種聚集現(xiàn)象為細(xì)胞貼壁后增殖分裂而成，兩組細(xì)胞形態(tài)無顯著差異 ( 圖 6 )。觀察后3 天細(xì)胞密度顯著增加，尤以加入 31.25 μg / ml Sr組細(xì)胞密度更高，細(xì)胞間空隙較少，已接近長成平層。細(xì)胞折光度依然良好，胞質(zhì)透亮，外觀平滑飽滿，表現(xiàn)為旺盛增殖期的細(xì)胞狀態(tài)。對照組第 3 天時可見一些細(xì)胞出現(xiàn)胞質(zhì)內(nèi)顆粒，少部分細(xì)胞有類似老化現(xiàn)象，且細(xì)胞間空隙多，細(xì)胞密度低于實驗組 ( 圖 7 )。

表 3　PCR 引物序列Tab.3 PCR primer sequences

圖 6　第 1 天細(xì)胞貼壁 a：Sr 含量 31.25 μg / ml 組；b：對照組Fig.6 The fi rst day of cell adherence a: Strontium content of 31.25 μg / ml group; b: The control group

圖 7　第 3 天細(xì)胞形態(tài)和密度觀察 a：Sr 含量 31.25 μg / ml 組；b：對照組Fig.7 The third day of cell morphology and density of the observation a: Strontium content of 31.25 μg / ml group; b: The control group

討 論

成骨活性元素 Sr 的應(yīng)用具有相對的穩(wěn)定性和較高的安全預(yù)期，這是因為化學(xué)元素 Sr 是與鈣元素同族的堿土金屬元素，在成熟骨骼中約相當(dāng)于鈣元素含量的 0.035%，是人體骨中必需元素之一[5-8]。在骨質(zhì)發(fā)生的早期，Sr 元素的缺乏可以導(dǎo)致骨形成不足及骨鈣化不良。Sr 元素在代謝上與鈣離子排泄途徑相似，因而具有較高的安全性。然而在植骨材料的應(yīng)用中其應(yīng)用濃度差異巨大，應(yīng)用形式和含量比例各不相同，其規(guī)范使用需要基礎(chǔ)研究提供基本的細(xì)胞實驗依據(jù)。筆者認(rèn)為各類摻 Sr 材料發(fā)揮作用的根本機(jī)制是依賴于溶解出的 Sr 離子進(jìn)而發(fā)揮對成骨細(xì)胞的刺激和調(diào)控作用。本研究中，筆者在MC3T3-E1 成骨細(xì)胞的培養(yǎng)液中添加了不同濃度含量的 Sr 離子，用于檢測成骨細(xì)胞對 Sr 離子濃度相依賴的生物反應(yīng)，對其關(guān)鍵性增殖和代表性成骨分化的指標(biāo)進(jìn)行了相關(guān)檢測。

細(xì)胞增殖是細(xì)胞生長代謝最重要的基礎(chǔ)性指標(biāo)，它可以反映材料植入后生物相容性的優(yōu)劣，用于指示組織修復(fù)細(xì)胞在支架表面生長能力以及最終組織再生修復(fù)能力的強(qiáng)弱。本研究結(jié)果提示，在 Sr離子濃度高于 500 μg / ml 時，成骨細(xì)胞增殖明顯降低，生長受到抑制，說明對細(xì)胞產(chǎn)生了毒性反應(yīng)。當(dāng)植入材料的溶出 Sr 離子濃度超過這一濃度范圍時，Sr 離子所發(fā)揮的將不再是對于組織修復(fù)的促進(jìn)作用，相反地，是對修復(fù)細(xì)胞的毒性和對再生的抑制。因此這一結(jié)果對組織工程支架材料的研究具有重要的指導(dǎo)意義，而當(dāng) Sr 離子的濃度降至一定的閾值后，其促進(jìn)作用也不再顯著，可以為各類相關(guān)研究提供參考。

ALP 活性是反應(yīng)成骨細(xì)胞分化水平的一個重要指標(biāo)，其活性越高，說明成骨細(xì)胞分化越明顯[9]。本實驗采用國際上公認(rèn)的 PNPP 法檢測成骨細(xì)胞ALP 活性，發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)，Sr 對成骨細(xì)胞 ALP活性的影響呈濃度依賴性，同時也發(fā)現(xiàn)了 Sr 元素作用的最大效應(yīng)濃度。

RUNX2 是一個功能多樣的轉(zhuǎn)錄因子，是 Runt家族的一員，在成骨細(xì)胞的整個分化過程中均有表達(dá)。有研究證明，RUNX2 既調(diào)控骨發(fā)生過程中骨的形成，又在出生后骨的形成中起到重要的調(diào)控作用，而且 RUNX2 能直接誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化[10-11]。本實驗中，RUNX2 mRNA 的表達(dá)量隨 Sr 的濃度在一定范圍內(nèi)逐漸升高，Sr 濃度為31.25 μg / ml 左右時，RUNX2 mRNA 表達(dá)量達(dá)到峰值，這與細(xì)胞增殖和堿性磷酸酶實驗的規(guī)律基本一致。MTT 結(jié)果與 PCR 和 ALP 等結(jié)果互相支持，細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察也為實驗提供了有力的佐證。

綜上所述，本研究證實 Sr 促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化具有顯著的劑量依賴關(guān)系，超過最優(yōu)濃度范圍其促進(jìn)作用下降，在一定閾值后甚至?xí)霈F(xiàn)毒性抑制作用。本研究為深入闡明 Sr 元素的促成骨機(jī)制以及組織工程支架材料的研究提供了重要的參考依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Boyd SK, Szabo E, Ammann P. Increased bone strength is associated with improved bone microarchitecture in intact female rats treated with strontium ranelate: a finite element analysis study. Bone, 2011, 48(5):1109-1116.

[2] Li Y, Shui X, Zhang L, et al. Cancellous bone healing around strontium-doped hydroxyapatite in osteoporotic rats previously treated with zoledronic acid. J Biomed Mater Res B Appl Biomater, 2015.

[3] Takaoka S, Yamaguchi T, Yano S, et al. The Calcium-sensing Receptor (CaR) is involved in strontium ranelate-induced osteoblast differentiation and mineralization. Horm Metab Res, 2010, 42(9):627-631.

[4] Bonnelye E, Chabadel A, Saltel F, et al. Dual effect of strontium ranelate: stimulation of osteoblast differentiation and inhibition of osteoclast formation and resorption in vitro. Bone, 2008, 42(1):129-138.

[5] Silverman S, Christiansen C. Individualizing osteoporosis therapy. Osteoporos Int, 2012, 23(3):797-809.

[6] Cooper C, Reginster JY, Chapurlat R, et al. Ef fi cacy and safety of oral strontium ranelate for the treatment of knee osteoarthritis: rationale and design of randomised, double-blind, placebocontrolled trial. Curr Med Res Opin, 2012, 28(2):231-239.

[7] 張春麗, 趙彥濤, 侯樹勛, 等. 新型摻鍶硫酸鈣材料的成骨細(xì)胞生長活性研究. 中國骨傷, 2014, 27(5):415-418.

[8] 趙彥濤, 侯樹勛, 閆鈞, 等. 一種新型摻鍶凍干骨材料的細(xì)胞相容性研究. 中國組織工程研究, 2012, 12(51):1024-1029.

[9] Kyeyune NE, Lau KH, Baylink DJ, et al. l,25-Dihydorxyvitamin D3 stimulates both alkaline phosphatase gene tarnseription and mRNA stability in human bone cells. Aerh Biochem Bio Phys, 1991, 291(2):316-325.

[10] Pi SH, Lee SK, Hwang YS, et al. Differential expression of periodontal ligament-specific markers and osteogenic differentiation in human papilloma virus 16-immortalized human gingival fibroblasts and periodontal ligament cells. Periodontal Res, 2007, 42(2):104-113.

[11] Zhang X, Yang M, Lin L, et al. Runx2 overexpression enhances osteoblastic differentiation and mineralization in adiposederived stem cells in vitro and in vivo. Calcif Tissue Int, 2006, 79(3):169-178.

( 本文編輯：王萌 )

Effects of strontium on the proliferation, ALP activity and the differentiation of MC3T3 cells

LI Zhong-hai, HAN Li-wei, ZHAO Yan-tao, YANG Xiao-xiong, ZHONG Hong-bin, WANG Fu-li, HOU Shu-xun. Orthopaedic Institute of CPLA, the fi rst Af fi liated Hospital of PLA General Hospital, Beijing, 100048, PRC

【Abstract】Objective To study the effects of strontium concentration on the proliferation, ALP activity and the differentiation of MC3T3-E1 cells. Methods MC3T3-E1 cells were cultured in vitro, and added with strontium of different concentrations. We used MTT to detect the proliferation of MC3T3-E1 celsl, PNPP to detect ALP activity, and RT-PCR to detect mRNA of key proteins of osteoblast differentiation. Results When the concentration of strontium was higher than 500 μg / ml, the proliferation of osteoblasts was signi fi cantly decreased, and the growth was inhibited. When the concentration of strontium was 3.91 - 250.00 μg / ml, the promoting effect reached the highest level. With the decrease of strontium concentration, the promoting effect was gradually weakened. In the observation range, the effects of strontium on the activity of ALP was obviously dependent. Strontium could signi fi cantly increase the ALP activity of MC3T3-E1. When the concentration of strontium was in the range of 3.91 - 125 μg / ml, the ALP activity of osteoblasts was signi fi cantly increased. The expressions of RUNX2, ALP, Col1 and mRNA gradually increased with the concentration of strontium in a certain range. The expression of mRNA reached the peak value, while the concentration reached 31.25 μg / ml. Conclusions Strontium promotes the proliferation and differentiation of osteoblasts in a dose-dependent manner. However, when the concentration of strontium exceeds the optimal concentration range, its promotion effect is decreased, and the toxicity is inhibited after a certain threshold value.

【Key words】Strontium; Osteoblasts; Cell differentiation; Cell proliferation; Bioactivity

( 收稿日期：2016-02-04 )

Corresponding author:ZHAO Yan-tao, Email: 45828016@qq.com

基金項目：中國博士后科學(xué)基金特別資助 ( 2015T81101 )；北京市自然科學(xué)基金 ( 7152144 )；國家自然科學(xué)基金項目

DOI:10.3969/j.issn.2095-252X.2016.03.015

中圖分類號：Q291