黃 超， 繆 銘， 金征宇， 江 波

(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122）

的樣品溶液。置于磁力攪拌器上加熱攪拌2 h，待樣品完全溶解后，放入4℃冰箱備用。樣品溶液使用前，常溫放置1 h。

不同濃度的水溶性葡聚糖溶液粘度由數(shù)字顯示粘度儀在25℃下測定，選擇RV3轉(zhuǎn)子。

不同濃度的水溶性葡聚糖樣品流變特性由AR-G2流變儀測定。采用錐板-平板測量系統(tǒng)。錐板直徑40 mm，設(shè)置間隙0.5 mm，加樣后，刮去平板外多余樣品，加上蓋板，并加入硅油以防止水分蒸發(fā)。每次測試均需更換樣品。

靜態(tài)剪切流變測試：在25℃下，剪切速率(γ）從0.01～100 s-1遞增，測定多糖溶液隨剪切速率增加時表觀粘度(η）的變化，由計(jì)算機(jī)自動進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和記錄。

動態(tài)黏彈性測定：采用小幅震蕩模式。溫度25℃，控制應(yīng)變0.2%(處于線性黏彈區(qū)），測定由低頻率(0.1 Hz）至高頻率(10 Hz）內(nèi)儲能模量(G’）、損耗模量(G”）隨著頻率的變化，由計(jì)算機(jī)自動進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和記錄。

新型水溶性(1→3）(1→6）-α-D-葡聚糖的性質(zhì)

黃 超， 繆 銘， 金征宇， 江 波*

(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122）

利用明串珠菌SK24.002發(fā)酵制備水溶性(1→3）(1→6）-α-D葡聚糖，采用高效液相色譜儀、掃描電鏡、Zeta電位/粒徑儀、熱分析系統(tǒng)、差示掃描量熱儀、旋轉(zhuǎn)流變儀等現(xiàn)代分析方法測定其理化性質(zhì)。結(jié)果表明，該葡聚糖表面呈多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，能溶于水，溶液中粒徑分布在40~160 nm范圍內(nèi)。相對分子質(zhì)量分布呈單一峰，具有較高的熱穩(wěn)定性，200℃以下只失去了吸附水，當(dāng)溫度在265~345℃時，發(fā)生強(qiáng)烈的熱裂解反應(yīng)，(1→3）(1→6）-α-D葡聚糖溶液的黏度在5~10 g/ dL范圍內(nèi)隨著質(zhì)量濃度增加呈指數(shù)上升，高濃度的葡聚糖溶液呈現(xiàn)剪切變稀特性，能形成弱凝膠。

(1→3）(1→6）-α-D-葡聚糖；掃描電鏡；熱特性分析；流變特性

多糖是一類空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物大分子，廣泛存在于各種動植物體內(nèi)，也可由微生物合成。水溶性葡聚糖作為一類重要的葡聚糖，由于其潛在的生物活性及加工性能越來越受到人們的重視[1]。李哲濤[2]等人發(fā)現(xiàn)苦瓜多糖和南瓜多糖都具有抗腫瘤活性，硫酸化修飾可以提高多糖的抗腫瘤活性。Carol F[3]等發(fā)現(xiàn)燕麥中β-葡聚糖是一種膳食纖維，可以降低血清中的膽固醇和血糖，有助于人體健康。李蓉[4]等人從甜玉米胚乳中提取的水溶性葡聚糖在體外模擬消化條件下其生物降解速率遠(yuǎn)低于蠟質(zhì)玉米淀粉，能緩慢釋放葡糖，在慢性消化方面顯示出較大的優(yōu)勢。此外，一些多糖還具有抗氧化，提高人體免疫力等作用[5-6]。

作者用到的多糖由明串珠菌SK24.002發(fā)酵制備，結(jié)構(gòu)單一，純度高，是一種新型水溶性(1→3）(1→6）-α-D-葡聚糖[7]。目前國內(nèi)外對該類型的葡聚糖很少報道。主要通過掃描電子顯微鏡(SEM）、Zeta電位/粒徑儀、熱分析系統(tǒng)(TGA）、差示掃描量熱儀(DSC）和流變儀等儀器對(1→3）(1→6）-α-D-葡聚糖基本性質(zhì)進(jìn)行探究，為擴(kuò)大該葡聚糖在食品工業(yè)中的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種 明串珠菌SK24.002：江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要試劑 葡聚糖標(biāo)品Dextran(相對分子質(zhì)量650 000）：購于Sigma公司；阿拉伯膠樣品：凱愛瑞集團(tuán)提供；其余樣品均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基配方：酪蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0 g，加入1 L蒸餾水溶解均勻，后加入乙酸鈉5.0 g，檸檬酸二胺2.0 g，吐溫80 1.0 mL，K2HPO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·H2O 0.05 g，調(diào)節(jié)pH至6.8，121℃高壓滅菌20 min。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 Delta 320s型pH計(jì)：美國梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品；Centrifuge 5804R離心機(jī)：德國Eppendorf公司產(chǎn)品；Zeta電位/粒徑儀（Nano ZS）：英國Malvern公司產(chǎn)品；數(shù)字顯示粘度儀：美國Brookfield公司產(chǎn)品；流變儀：美國TA公司產(chǎn)品；掃描電子顯微鏡：日本日立公司產(chǎn)品；差示掃描量熱儀：美國PerkinElmer公司產(chǎn)品；熱分析系統(tǒng)：瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品；AVANCE III 400 MHz全數(shù)字化核磁共振譜儀：美國Brucker公司產(chǎn)品；多角度激光光散射凝膠色譜系統(tǒng) (HPSEC-MALLS-RI）：美國Wyatt公司產(chǎn)品；Shodex OH pak SB-806 HQ凝膠柱：日本Shodex公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水溶性(1→3）(1→6）-α-D-葡聚糖提取 參考白愛娟等人的方法[8]，將活化后的菌種按體積分?jǐn)?shù)5%的接種量將種子液接入到1 L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，160 r/min，28℃恒溫振蕩培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液離心(6 000 r/min，15 min）得到上清液。取等體積的無水乙醇與發(fā)酵上清液混勻，攪拌10 min后，離心(10 000 r/min，10 min），蒸餾水復(fù)溶沉淀，加入等體積無水乙醇沉淀、離心、蒸餾水復(fù)溶，同樣方法重復(fù)3次，得到的粗多糖利用Sevage法除蛋白質(zhì)[9]。除完蛋白質(zhì)后的水溶性葡聚糖用蒸餾水復(fù)溶，真空干燥，得到水溶性葡聚糖粉末(苯酚-硫酸法測得總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.86%），于干燥皿中保藏。

1.2.2 核磁共振(13C NMR）分析 稱取50 mg葡聚糖樣品溶于0.45 mL的D2O中，進(jìn)行13C NMR分析，測試溫度70℃，5 mm PABBO-BB探針，zg30的脈沖序列。測試條件：1D13C-NMR：24 038 Hz的掃描寬度，弛豫時間2 s，記錄1 401次掃描。

1.2.3 水溶性葡聚糖表面形態(tài)觀察 取少量樣品粉末，粘著于樣品臺上，置于真空噴鍍儀內(nèi)噴金，用掃描電子顯微鏡觀察表面形態(tài)特征。

1.2.4 水溶性葡聚糖相對分子質(zhì)量及其分布測定稱取一定質(zhì)量葡聚糖樣品，用去離子水配成濃度為1 mg/mL的溶液，過0.45 μm的濾膜備用。樣品絕對相對分子質(zhì)量及其分布由高效液相排阻色譜(HPSEC）、多角度激光散射檢測器(MALLS）和示差折光檢測器(RI）聯(lián)用系統(tǒng)測定。其中，多角度激光散射檢測器中He-Ne激光源的波長λ為632.8 nm，選用Shodx OHpak SB-806HQ色譜柱，流動相為0.1 mol/L NaNO3溶液，流量為0.5 mL/min，葡聚糖的折光指數(shù)增量設(shè)定為dn/dc=0.146，利用Astra軟件對色譜圖中的單個色譜峰進(jìn)行分析[7]。

1.2.5 水溶性葡聚糖粒徑分布 將水溶性葡聚糖粉末用蒸餾水配成 質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%，在25℃下用粒徑儀測定其粒徑分布。

1.2.6 水溶性葡聚糖的熱特性分析(DSC，TGA）稱取2 mg水溶性葡聚糖粉末于鋁盤中，從30℃到300℃以10℃/min加熱速率掃描，測定該水溶性多糖的變性溫度和活化能等。

將一定量的水溶性葡聚糖粉末置于熱分析天平中，用氮?dú)?50 mL/min）置換，以10℃/min的速率從45℃升溫至550℃。記錄升溫過程中的失重曲線。

1.2.7 水溶性葡聚糖流變特性分析 準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的葡聚糖樣品，加入去離子水調(diào)成不同濃度

的樣品溶液。置于磁力攪拌器上加熱攪拌2 h，待樣品完全溶解后，放入4℃冰箱備用。樣品溶液使用前，常溫放置1 h。

不同濃度的水溶性葡聚糖溶液粘度由數(shù)字顯示粘度儀在25℃下測定，選擇RV3轉(zhuǎn)子。

不同濃度的水溶性葡聚糖樣品流變特性由AR-G2流變儀測定。采用錐板-平板測量系統(tǒng)。錐板直徑40 mm，設(shè)置間隙0.5 mm，加樣后，刮去平板外多余樣品，加上蓋板，并加入硅油以防止水分蒸發(fā)。每次測試均需更換樣品。

靜態(tài)剪切流變測試：在25℃下，剪切速率(γ）從0.01～100 s-1遞增，測定多糖溶液隨剪切速率增加時表觀粘度(η）的變化，由計(jì)算機(jī)自動進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和記錄。

動態(tài)黏彈性測定：采用小幅震蕩模式。溫度25℃，控制應(yīng)變0.2%(處于線性黏彈區(qū)），測定由低頻率(0.1 Hz）至高頻率(10 Hz）內(nèi)儲能模量(G’）、損耗模量(G”）隨著頻率的變化，由計(jì)算機(jī)自動進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和記錄。

2 結(jié)果與討論

2.1 水溶性葡聚糖的結(jié)構(gòu)鑒定

利用13C-NMR測定葡聚糖的結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖1所示。葡聚糖13C譜的中，異頭碳信號出現(xiàn)在90×10-6~110×10-6，非異頭碳信號出現(xiàn)在60×10-6~85× 10-6。圖中δ 99.62×10-6和δ 98.40×10-6出現(xiàn)兩個強(qiáng)度相當(dāng)?shù)男盘枺鶠棣?吡喃葡萄糖殘基的C1信號峰，說明該葡聚糖中主要含有兩種類型的糖苷鍵，且含量相當(dāng)。這兩個信號分別對應(yīng)1，3-糖苷鍵和1，6-糖苷鍵中C1的化學(xué)位移。C3和C6的化學(xué)位移一般出現(xiàn)在73.00×10-6和61.00×10-6左右[10]，由圖1可以看出，有部分C3和C6的信號分別出現(xiàn)在低場81.57×10-6和65.91×10-6，這是由于糖環(huán)上中C3和C6上發(fā)生了連接，導(dǎo)致碳信號峰向低場移動，同時也說明該葡聚糖中主要存在1，3-糖苷鍵和1，6-糖苷鍵。圖1中71.94×10-6，69.70×10-6和71.94×10-6附近的信號峰為其它未被連接的吡喃糖環(huán)上C2，C4和C5的信號峰。

2.2 水溶性葡聚糖表面形態(tài)特征

利用掃描電子顯微鏡(SEM）觀察葡聚糖的表面微觀形態(tài)，結(jié)果如圖2所示。(1→3）(1→6）-α-D-葡聚糖表面呈現(xiàn)相對比較均一的聚集體，并且聚集的形態(tài)比較相似，整體外觀呈現(xiàn)聚集的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這種聚集可能是由于糖鏈中的一些官能團(tuán)相互作用交聯(lián)引起的。Majumder[11]等人報道的乳酸菌胞外多糖也呈現(xiàn)類似的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這些網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中分布的空隙，能提高聚合物的持水力，使得該葡聚糖可以作為一種質(zhì)構(gòu)改良劑應(yīng)用到食品工業(yè)中。

2.3 水溶性葡聚糖相對分子質(zhì)量及其分布

多糖的理化性質(zhì)往往和其相對分子質(zhì)量密切相關(guān)。(1→3）(1→6）-α-D-葡聚糖的相對分子質(zhì)量分布如圖3所示。該水溶性葡聚糖的液相結(jié)果呈現(xiàn)一個單一對稱的色譜峰，這表明利用此方法得到的葡聚糖相對分子質(zhì)量分布均一，純度高。利用系統(tǒng)軟件分析，得到該葡聚糖的重均相對分子質(zhì)量(Mw）為1.71×107，數(shù)均相對分子質(zhì)量(Mn）為1.48×107，多分散性指數(shù)(Mw/Mn）為1.16。多分散性指數(shù)可以用來表示多糖的相對分子質(zhì)量分布，值越小，表明多糖的相對分子質(zhì)量分布越集中。作者得到的水溶性(1→3）(1→6）-α-D-葡聚糖多分散性指數(shù)為1.16，接近1.0，說明該葡聚糖相對分子質(zhì)量分布集中、均一。

2.4 水溶性葡聚糖粒徑分布

利用Zeta電位/粒徑儀分析葡聚糖在水溶液中的粒徑大小及其分布，結(jié)果如圖4所示。(1→3）(1→6）-α-D-葡聚糖粒徑分布在40~160 nm范圍內(nèi)，通過Zeta電位/粒徑儀分析，其平均粒徑為92.06 nm，PDI值為0.055。PDI值反映了溶液體系的分散穩(wěn)定性，PDI值越小，則溶液越均一穩(wěn)定。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，(1→3）(1→6）-α-D-葡聚糖溶于水后，具有穩(wěn)定均一的分散體系，而且粒徑分布集中，是一種典型的納米微粒。

2.5 水溶性葡聚糖熱特性分析

熱特性是影響多糖應(yīng)用的一個關(guān)鍵因素，實(shí)驗(yàn)中利用熱分析系統(tǒng)(TGA）和差示掃描量熱儀(DSC）對水溶性葡聚糖的熱特性進(jìn)行分析。

(1→3）(1→6）-α-D-葡聚糖熱降解主要分為3個主要階段，這與多糖的組成、含水量和聚集狀態(tài)有關(guān)[12]。在第一階段中，葡聚糖只失去了吸附水和部分結(jié)構(gòu)水，整體的質(zhì)量保持在一個穩(wěn)定的范圍內(nèi)；當(dāng)溫度達(dá)到265℃時，降解進(jìn)入第二階段，葡聚糖的重量開始出現(xiàn)快速下降。在該階段內(nèi)發(fā)生強(qiáng)烈的熱裂解反應(yīng)，發(fā)生了碳鏈和氫鍵的斷裂，生成水和二氧化碳。當(dāng)溫度達(dá)到500℃之后，葡聚糖質(zhì)量損失的趨勢再次變緩，這與Zamora[13]等人的結(jié)果一致。

從DSC結(jié)果看，(1→3）(1→6）-α-D-葡聚糖的相轉(zhuǎn)變溫度 (Tm）在133.89℃，由此產(chǎn)生的熔融焓(ΔHm）為111.93 J/g，活化能為240.12 kJ/mol。在260℃左右，葡聚糖開始降解，與熱重分析結(jié)果相一致。很多乳酸菌胞外多糖的Tm值在140~155℃范圍內(nèi)，ΔHm值處于101~217 J/g之間[14]，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

2.6 水溶性葡聚糖流變特性分析

(1→3）(1→6）-α-D-葡聚糖、右旋糖苷和阿拉伯膠與市售的右旋糖苷相比，5 g/dL的(1→3）(1→6）-α-D-葡聚糖溶液粘度(18 mPa·s）要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于右旋糖苷的粘度，這對于相對分子質(zhì)量在107數(shù)量級的葡聚糖來說并不常見。但是當(dāng)溶液濃度增加到10 g/ dL過程中，(1→3）(1→6）-α-D-葡聚糖溶液的黏度隨著濃度的增加呈指數(shù)型增長，并且形成了類似凝膠的形態(tài)。這可能是由于葡聚糖達(dá)到一定質(zhì)量濃度后，大分子開始聚集，顯著提高了溶液粘度。在測量范圍內(nèi)，(1→3）(1→6）-α-D-葡聚糖溶液的黏度均大于商業(yè)化阿拉伯膠的粘度。

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的葡聚糖溶液都呈現(xiàn)了一定的剪切變稀行為，其中質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的9%溶液中最為明顯。剪切稀化是剪切引起的分子形變伴隨著流體力學(xué)相互作用的變化及其作用下大分子既旋轉(zhuǎn)又形變的狀態(tài)[15]。在多糖溶液中，線性大分子之間相互纏繞。當(dāng)剪切力很小時，溶液中大分子的纏繞被破壞的速率與形成新纏繞的速率相等，宏觀上看，溶液的表觀粘度沒有下降。隨著剪切力的進(jìn)一步增大，分子結(jié)構(gòu)被拉直取向，纏結(jié)點(diǎn)進(jìn)一步減少，流動阻力降低，纏繞被破壞的速率大于新形成纏繞的速率，表現(xiàn)為表觀黏度隨著剪切力的增大而下降[16]。當(dāng)剪切速率增大到一定值時，大分子間的纏繞被完全破壞，溶液的粘度不再下降。

(1→3）(1→6）-α-D-葡聚糖溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)9%）的儲能模量(G’）和損耗模量(G”）在測定頻率范圍內(nèi)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)9%葡聚糖溶液的儲能模量始終大于損耗模量。這表明在較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)時，溶液能形成“弱凝膠”。此外，質(zhì)量分?jǐn)?shù)9%葡聚糖溶液的動態(tài)模量對頻率的依賴度較低，這表明葡聚糖大分子在高質(zhì)量分?jǐn)?shù)溶液中形成了復(fù)雜纏繞的結(jié)構(gòu)，溶液的流動性受到了限制，這與粘度結(jié)果相一致。

3 結(jié)語

利用發(fā)酵法合成的新型水溶性 (1→3）(1→6）-α-D-葡聚糖雜質(zhì)含量少，相對分子質(zhì)量分布均一，可形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，增加持水力。水溶性(1→3）(1→6）-α-D-葡聚糖是一種納米級多糖，水溶液中粒徑分布在40~160 nm范圍內(nèi)，是一種潛在的天然納米級材料。從熱分析結(jié)果看，水溶性(1→3）(1→6）-α-D-葡聚糖熱穩(wěn)定性高，當(dāng)溫度高于260℃才開始降解，在熔融過程中具有較高的活化能。從流變結(jié)果看，水溶性(1→3）(1→6）-α-D-葡聚糖在低質(zhì)量分?jǐn)?shù)時黏度較低，但黏度隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)指數(shù)增長，質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于10%的葡聚糖溶液很難制備。(1→3）(1→6）-α-D-葡聚糖溶液呈現(xiàn)剪切變稀特征，在測定范圍內(nèi)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)9%葡聚糖溶液的儲能模量始終大于損耗模量，這表明當(dāng)溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到一定值后，(1→3）(1→6）-α-D-葡聚糖能形成弱凝膠結(jié)構(gòu)。

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國際食品法典委員會修改單貝大豆產(chǎn)品等標(biāo)準(zhǔn)并征求意見

10月18日消息，世界衛(wèi)生組織（WHO）及糧農(nóng)組織（FAO）第20次亞洲會議（CCASIA20）同意修訂如下產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)：

1.“單貝（Tempe）”（CODEX STAN 313R-2013）標(biāo)準(zhǔn)中所列水分、蛋白質(zhì)含量、脂肪含量以及粗纖維含量分析方法被推薦標(biāo)準(zhǔn)方法中（CODEX STAND234-1999）相關(guān)分析方法取代。

2.修訂非發(fā)酵大豆制品產(chǎn)品區(qū)域標(biāo)準(zhǔn)（CODEX STAN322R-2015）中4.2.2部分有關(guān)食品添加劑的使用要求：增加抗氧化劑生育酚（INS:307a、b、c）的使用，最大使用限量200毫克/千克；取消風(fēng)味促進(jìn)劑氯化鉀（INS:508）的使用，最大使用限量1 000 mg/kg。

3.修訂辣醬產(chǎn)品區(qū)域標(biāo)準(zhǔn)（CODEX STAN 306R-2011）中第4.5部分食品添加劑使用要求：取消使用亞硫酸氫鈣（INS：227）和亞硫酸氫鉀（INS：228）。

評價截止日期2017年5月31日。

［信息來源］食品伙伴網(wǎng).國際食品法典委員會修改單貝大豆產(chǎn)品等標(biāo)準(zhǔn)并征求意見

[EB/OL].(2016-10-19).http://news.foodmate.net/2016/10/400292.html

Physicochemical Properties of a Novel Water-Soluble(1→3）(1→6）-α-D-Glucan

HUANG Chao， MIAO Ming， JIN Zhengyu， JIANG Bo*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

This paper studied physiochemical properties of the water-soluble(1→3）(1→6）-α-D-glucan from Leuconostoc.sp.SK24.002 by high performance liquid chromotagraphy，scanning electron microscope(SEM），Zeta Nano，thermogravimetry，differential scanning calorimetry and rotational rheometer.Surface morphology showed that the glucan had a porous structure and its particle size in water solution ranged from 40 to160 nm.It had a narrow and single weight distribution and a relatively high thermal stability and decomposed at 265～345℃.The viscosity increased exponentially with its concentration in the range of 5 to 10 g/100 mL，and concentrated solution showed typical shear-thinning behavior and possessed an obvious weak gel-like character.

(1→3）(1→6）-α-D-glucan，SEM，thermal properties，rheological character

Q 814.9

A

1673—1689（2016）11—1129—06

2015-01-19

國家863計(jì)劃項(xiàng)目(2013AA102102）；國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(31230057）；江蘇省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(BE2012613，BE2013311）。

*通信作者：江 波(1962—），男，江蘇無錫人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事食品生物技術(shù)研究。

E-mail：bjiang@jiangnan.edu.cn