益生菌乳酸發(fā)酵法生產(chǎn)高純度低聚異麥芽糖

許宏賢， 張曉萍， 段 鋼

（杜邦工業(yè)生物應(yīng)用科技部 杰能科（中國）生物工程有限公司，江蘇 無錫 214028）

益生菌乳酸發(fā)酵法生產(chǎn)高純度低聚異麥芽糖

許宏賢， 張曉萍， 段 鋼*

（杜邦工業(yè)生物應(yīng)用科技部 杰能科（中國）生物工程有限公司，江蘇 無錫 214028）

研究了一種新的高純度低聚異麥芽糖（IMO）生產(chǎn)方法。利用益生菌添加甜菜堿進(jìn)行乳酸發(fā)酵，將可發(fā)酵性糖葡萄糖、果糖和麥芽糖轉(zhuǎn)化為乳酸，使原料IMO等級由IMO-50提高到IMO-90，發(fā)酵液無需進(jìn)行菌體分離即可用于食品加工。

低聚異麥芽糖（IMO）；乳酸；益生菌；甜菜堿

低聚異麥芽糖（Isomalto-Oligosaccharides，簡稱IMO）是功能性低聚糖的一種[1]，又稱分枝低聚麥芽糖、異麥芽低聚糖、異麥芽寡糖，是指葡萄糖基以α-1，6糖苷鍵結(jié)合而成單數(shù)糖在2~6不等一類低聚糖，主要是玉米淀粉在α-淀粉酶和轉(zhuǎn)葡萄糖苷酶的作用下通過一系列反應(yīng)得到[2]，使含異麥芽糖（Isomaltose，IG2）、潘糖 （Panose，P）、異麥芽三糖（Isomaltotriose，IG3）以及四糖（含四糖）以上（Gn）的低聚糖。低聚異麥芽糖是一種酵母和乳酸菌難以利用的糖類，用于面包、酸奶等發(fā)酵食品時不能被酵母菌、乳酸菌發(fā)酵利用，它殘留在食品中發(fā)揮其各種理化性能和抗齲齒性，同時促進(jìn)腸道內(nèi)雙歧桿菌的發(fā)育。低聚異麥芽糖在發(fā)酵乳制品中不會妨礙正常乳酸菌發(fā)酵，低聚異麥芽糖的不發(fā)酵性是其在食品中發(fā)揮保健功能的前提基礎(chǔ)[3]。GBT20881-2007表明商品低聚異麥芽糖產(chǎn)品規(guī)格主要有兩種劑型即糖漿和糖粉；兩種規(guī)格即IMO-50型和IMO-90型[4]。IMO-50型含有一定量的葡萄糖、麥芽糖；而IMO-90型含葡萄糖和麥芽糖較少，是高純度產(chǎn)品。典型的酶法IMO生產(chǎn)工藝流程如圖1所示。

乳酸，學(xué)名為α-羥基丙酸、2-羥基丙酸、丙醇酸，其化學(xué)式為C3H6O3，相對分子質(zhì)量 90.08。乳酸是一種重要的有機酸，廣泛存在于人體、動植物及微生物中。乳酸是一種風(fēng)味物質(zhì)，同時乳酸、乳酸鹽及其衍生物廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、釀造、紡織等領(lǐng)域。L-乳酸的工業(yè)化生產(chǎn)我國多采用細(xì)菌發(fā)酵[5]。

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一群形態(tài)代謝性能和生理學(xué)特征不完全相同的能發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽性細(xì)菌總稱，它的自然宿主是人類、動物和植物[6]。益生菌是指通過攝入適當(dāng)量從而對宿主產(chǎn)生有益作用的活性微生物。益生菌對人體主要具有免疫調(diào)節(jié)、調(diào)整腸道菌群、防止腹瀉、降低糞便中某些酶活性及抗突變抗癌的醫(yī)療保健作用。最常見的益生菌主要有Bifidobacterium和Lactobacillus屬[7]。

甜菜堿是一種季銨型生物堿，生產(chǎn)方法有兩種[8]。一種是從甜菜制糖廢液中回收，另一種是化學(xué)合成，甜菜堿在化工、印染、日化、醫(yī)藥、食品、飼料等領(lǐng)域中都有廣泛的應(yīng)用，用它制造人造肉等食品，對老人保健、兒童生長發(fā)育都能起到良好的促進(jìn)作用。作為一種高效活性甲基供體生物營養(yǎng)素，甜菜堿具有多種生理功能，如促進(jìn)動物蛋白質(zhì)和脂肪代謝、調(diào)節(jié)滲透壓、穩(wěn)定維生素、改善飼料適口性等。

低聚異麥芽糖酶法工藝生產(chǎn)的糖漿如果不經(jīng)過專門的去除葡萄糖、麥芽糖的過程，其IMO質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般不會超過60%。

根據(jù)國標(biāo)GBT20881-2007，IMO-90中葡萄糖和麥芽糖的含量不高于10%，是高純度產(chǎn)品，高純度低聚異麥芽糖具有特殊的生物活性功能，甜度低、熱值低、抗齲齒，促進(jìn)人體腸道內(nèi)雙歧桿菌大量繁殖，明顯抑制腸道內(nèi)有害菌的繁殖及腐敗物質(zhì)的生成，具有防止便秘、增強機體免疫力等功效，更適宜糖尿病人和肥胖癥患者等人群食用，從而擴大了IMO的應(yīng)用范圍。利用發(fā)酵法去除可發(fā)酵性糖從而提高功能性低聚糖含量的研究近年開始見諸報道[9-10]，相關(guān)的研究有利用乳酸菌發(fā)酵法生產(chǎn)高活性大豆低聚糖[11-12]；利用酵母菌生產(chǎn)高純度低聚異麥芽糖聯(lián)產(chǎn)酒精等[13-15]；而少量殘余酒精可能影響產(chǎn)品的風(fēng)味；但是在商品IMO-50的基礎(chǔ)上，通過乳酸菌發(fā)酵從而提升IMO等級的研究尚未見報道，IMO濃縮糖漿的高滲透壓可能是影響乳酸發(fā)酵的技術(shù)障礙之一。作者研究了通過添加甜菜堿進(jìn)行益生菌發(fā)酵，將葡萄糖和麥芽糖轉(zhuǎn)化為乳酸，從而提高IMO的等級，該技術(shù)無需進(jìn)行發(fā)酵液菌體分離，有著廣泛的應(yīng)用前景和巨大的商業(yè)潛力。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

IMO-50糖漿：作者所在實驗室制備；甜菜堿Betafin BP20：杜邦工業(yè)生物應(yīng)用科技部提供；菌種：Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.2446：購自中國普通微生物菌種保藏管理中心；Lactobacillus plantarum CICC 20659：購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

分析試劑：乳酸，葡萄糖，果糖，麥芽糖，麥芽三糖，異麥芽糖，異麥芽三糖，異麥芽四糖，異麥芽五糖，異麥芽六糖，異麥芽七糖，潘糖，海藻糖，麥芽酮糖，曲二糖，黑曲霉糖：Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；醋酸鈉（ICS級）：Fisher公司產(chǎn)品。

基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，K2HPO42，檸檬酸氫二銨2，無水乙酸鈉5，葡萄糖20，Tween 80 1，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4· H2O 0.05，CaCO320，自來水配制，pH 6.5，基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂粉；121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：玉米漿40，酪蛋白10，牛肉膏 10，酵母膏 10，Tween 80 1.5，MnSO4·H2O 0.3，CaCO320，用實驗室自己制備的IMO-50配制，pH 6.5，根據(jù)試驗條件不同添加甜菜堿。

1.2 實驗設(shè)備

高壓液相色譜：Agilent 1100系列，Agilent公司產(chǎn)品；離子色譜（IC）：ICS-5000型離子色譜：戴安公司產(chǎn)品。1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸菌活化與擴培 從斜面上取一環(huán)乳酸菌，轉(zhuǎn)移到裝有100 mL液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37℃搖床200 r/min培養(yǎng)12~18 h。

1.3.2 乳酸發(fā)酵實驗步驟 配制發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量每個發(fā)酵罐1 000 mL。打開Bio-Command Plus軟件，控制溫度45℃；根據(jù)試驗條件不同用氨水或氫氧化鈣調(diào)節(jié)pH 6.5。按接種量體積分?jǐn)?shù)10%接入培養(yǎng)好的液體種子，開始發(fā)酵，過程中控制pH溫度穩(wěn)定。發(fā)酵過程中取樣進(jìn)行HPLC分析乳酸含量和殘余葡萄糖、二糖含量。發(fā)酵結(jié)束取樣進(jìn)行IC分析IMO組成。

2 結(jié)果與討論

2.1 甜菜堿添加量的影響

考慮到IMO-50糖漿的高滲透壓，而甜菜堿可以調(diào)節(jié)乳酸發(fā)酵滲透壓[18]，故首先考察甜菜堿不同添加量對發(fā)酵的影響。試驗菌種為L.rhamnosus CGMCC 1.2446，20%氨水調(diào)節(jié)pH，將不同含量的甜菜堿加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，定期取樣，采用HPLC測定發(fā)酵液中乳酸和殘余一糖二糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果如圖2所示。糖含量較高；添加甜菜堿后情況明顯好轉(zhuǎn)，高添加量3 g/L優(yōu)于低添加量1 g/L；由圖3可知，在不添加甜菜堿或甜菜堿添加量不足的情況下，乳酸含量較低，與圖2殘?zhí)墙档退较嗪魬?yīng)。相關(guān)研究表明，在高滲環(huán)境下細(xì)胞的生長速率和酶活會大幅下降，甜菜堿作為一種外源性的滲透保護(hù)劑，可以平衡細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓，從而提高微生物對高滲環(huán)境的耐受性；對于乳酸菌Lactobacillus，甜菜堿還是酶活的滲透壓保護(hù)劑。由于IMO-50糖漿的干物質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)，試驗結(jié)果再次證明了如果用IMO-50糖漿直接進(jìn)行發(fā)酵，必須添加適量的甜菜堿。

2.2 氫氧化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

在工業(yè)化規(guī)模乳酸發(fā)酵生產(chǎn)中，氫氧化鈣是最普遍使用的pH調(diào)節(jié)劑，故考察不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)氫氧化鈣對發(fā)酵的影響。試驗菌種 L.rhamnosus CGMCC 1.2446，將3 g/L甜菜堿加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用20%或8.5%氫氧化鈣溶液調(diào)節(jié)pH，定期取樣，采用HPLC測定乳酸含量和殘余一糖二糖的變化，結(jié)果見圖4和圖5。

由圖2可知，在不添加甜菜堿的情況下，在發(fā)酵的前17 h，殘余的一糖二糖幾乎沒有變化，發(fā)酵的延滯期非常長，發(fā)酵幾乎處于停滯狀態(tài)，最終殘

由圖4可知，質(zhì)量分?jǐn)?shù)8.5%和20%氫氧化鈣的最終殘余一糖二糖數(shù)值幾乎沒有差別，圖5表明8.5%的最終乳酸含量略高于后者，發(fā)酵過程中前者的產(chǎn)酸速率略快于后者，這可能是由于低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氫氧化鈣有一定的稀釋作用所致。由于HPLC顯示殘余的一糖含量接近零，二糖仍有部分殘余，而HPLC無法分辨殘余二糖的具體成分，故選取質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%氫氧化鈣的發(fā)酵液與原始糖漿進(jìn)行IC分析，結(jié)果如表1所示。

由表 2可知，通過 L.rhamnosus乳酸發(fā)酵，IMO-50糖漿一糖中的葡萄糖從 78.66 g降低到0.11 g，果糖含量從3.49 g降為零；二糖中的麥芽糖從7.29 g降低到3.68 g；異麥芽糖、黑曲霉二糖、麥芽酮糖略有下降，海藻糖和曲二糖變化不大；三糖及三糖以上成份變化不大。即通過L.rhamnosus乳酸發(fā)酵，可發(fā)酵性糖（葡萄糖、果糖、麥芽糖）大幅降低，從39.1%降低到3.1%；由于L.rhamnosus屬于益生菌，也會代謝某些低聚糖成份轉(zhuǎn)化為乳酸，如異麥芽糖、黑曲霉二糖和麥芽酮糖等，但利用順序靠后；總體來講，發(fā)酵前總糖為228.96 g，發(fā)酵后為122.14 g，有106.82 g糖通過L.rhamnosus轉(zhuǎn)化為103.45 g乳酸。發(fā)酵液是高純度IMO糖漿（可發(fā)酵性糖含量僅為3.1%）、乳酸和L.rhamnosus的混合物。

2.3 其它益生菌的發(fā)酵

試驗菌種L.plantarum CICC 20659，將3 g/L甜菜堿加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%氫氧化鈣調(diào)節(jié)pH，定期取樣，采用HPLC測定乳酸含量，結(jié)果如表2所示；采用IC測定發(fā)酵前后IMO成份變化，結(jié)果如表3所示。

由表 3可知：通過 L.plantarum乳酸發(fā)酵，IMO-50糖漿一糖中的葡萄糖從105.28 g降低到0.09 g；二糖中的麥芽糖含量從24.7 g降低到4.09 g；海藻糖從3.67 g降低到0.23 g，異麥芽糖從48.02 g降低到26.78 g，曲二糖、黑曲霉二糖略有下降，麥芽酮糖未見降低；三糖中麥芽三糖從3.34 g降低到0.78 g，潘糖從32.06 g降低到17.21 g，異麥芽三糖含量未見降低。即通過L.plantarum乳酸發(fā)酵，可發(fā)酵性糖（葡萄糖、麥芽糖）大幅降低，從49.17%降低到3.98%；由于L.plantarum屬于益生菌，也會代謝某些低聚糖成份轉(zhuǎn)化為乳酸，如異麥芽糖、海藻糖、曲二糖、黑曲霉二糖、潘糖等；總體來講，發(fā)酵前總糖為264.35 g，發(fā)酵后為104.97 g，有159.38糖通過乳酸菌L.plantarum轉(zhuǎn)化為145.73 g乳酸。發(fā)酵液是高純度IMO糖漿（可發(fā)酵性糖含量僅為3.98%）、乳酸和益生菌L.plantarum的混合物。

比較表1和表3可知，不同的益生菌如L. rhamnosus，L.plantarum進(jìn)行IMO乳酸發(fā)酵，盡管其最終發(fā)酵液中IMO的成分不盡相同，但是其可發(fā)酵性糖（葡萄糖、果糖、麥芽糖）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)都低于4%，從而使IMO-50的等級提高到IMO-90，當(dāng)然由于益生菌本身可以利用某些低聚糖成份，如何及時判斷和控制發(fā)酵終點尚值得進(jìn)一步探討。

3 結(jié)語

低聚異麥芽糖是一種集營養(yǎng)、保健、療效于一體的功能性低聚糖。益生乳酸菌因為與人類健康息息相關(guān)而日益?zhèn)涫荜P(guān)注。作者提供的方法所得發(fā)酵液中所含成分（IMO，乳酸，益生菌）均是可食用成分，發(fā)酵液無需進(jìn)行菌體分離即可用于食品加工。

[1]PATEL S，GOYAL A.Functional oligosaccharides：production，properties and applications[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，2010，27（5）：1119-1128.

[2]張曉萍，段鋼.功能性低聚糖酶法制備研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2011（4）：159-165. ZHANGXiaoping，DUANGang.Recentprogessonenzymepreparationoffunctionaloligosaccharides[J].Food and Fermentation Industries，2011（4）：159-165.（in Chinese）

[3]王良東.低聚異麥芽糖性質(zhì)、功能、生產(chǎn)和應(yīng)用[J].糧食與油脂，2008（4）：43-47. WANG Liangdong.The properties，functions，production and utilizations of isomaltooligosacharide[J].Cereals and Oils，2008（4）：43-47.（in Chinese）

[4]GBT 20881-2007，低聚異麥芽糖[S].

[5]段鋼.酶制劑在大宗生化品生產(chǎn)中的應(yīng)用[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2014.

[6]張文羿，白梅，張和平.益生乳酸菌遺傳穩(wěn)定性研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)報，2014，54（4）：361-366. ZHANG Wenyi，BAI Mei，ZHANG Heping.Genetic stability of probiotic lactic acid bacteria-a review[J].Acta Microbiologica Sinica，2014，54（4）：361-366.（in Chinese）

[7]DUAN G，LARS W P，YING Q，et al.Functional oligosaccharides composition and a method for reducing fermentable sugars：WO，2015061135A1[P].2015-4-30.

[8]汪家銘.甜菜堿發(fā)展前景看好[J].精細(xì)與專用化學(xué)品，1997，15：18. WANG Jiaming.Prospects of the development of Betaine[J].Fine and Specialty Chemicals，1997，15：18.（in Chinese）

[9]NAKAKUKI T.Present status and future of functional oligosaccharide development in Japan[J].Pure and Applied Chemistry，2002，74（7）：1245-1251.

[10]MUSSATTO S I，MANCILHA I M.Non-digestible oligosaccharides：A Review[J].Carbohydrate Polymers，2007，68（3）：587-597.

[11]劉欣，張春紅，趙秀紅，等.乳酸菌發(fā)酵法生產(chǎn)高活性大豆低聚糖的研究[J].食品工業(yè)科技，2006，27（11）：137-139. LIU Xin，ZHANG Chunhong，ZHAO Xiuhong，et al.Study of high activity of functional soya oligosaccharide produced by lactic acid bacteria fermentation[J].Science and Technology of Food Industry，2006，27（11）：137-139.（in Chinese）

[12]劉長江，張春紅，趙秀紅，等.乳酸菌發(fā)酵法生產(chǎn)高活性大豆低聚糖工藝[P].中國專利：200610045808.7，2006-10-4.

[13]劉宗利，王乃強，袁衛(wèi)濤，等.高純度低聚異麥芽糖及酒精聯(lián)產(chǎn)制備方法[P].中國專利：101805767 A，2010-8-18.

[14]ZHONG Z S，ZHU J H，LI X L，et al.Method for the removal of monosaccharide in oligosaccharides production：US，7906314 B2 [P].2011-3-15.

[15]梁磊，黃向陽，尚紅巖，等.用于發(fā)酵法純化生產(chǎn)高純度低聚異麥芽糖的固定化酵母[P].中國專利：201020223072，2010-6-10.

Production of High-Purity IMO by Lactic Acid Fermentation Using Probiotics

XU Hongxian， ZHANG Xiaoping， DUAN Gang*
（DuPont Industrial Biosciences，Genencor（China）Bio-Product Co.，Ltd.Wuxi 214028，China）

A new method for the production of high-purity isomalto-oligosaccharides（IMO）by the lactic acid fermentation using probiotic strains was demonstrated.With the addition of betaine and the fermentation of sugars such as glucose，fructose and maltose into lactic acid by probiotics，the low-purity IMO-50 was effectively converted into the high-purity IMO-90.There was no need to separate the strains after conversion.The method is an easy way to manufacture edible products.

Isomalto-Oligosaccharides（IMO），lactic acid，probiotic strain，betaine

Q 815

A

1673—1689（2016）11—1219—05

2015-01-18

許宏賢（1970—）女，江蘇無錫人，工學(xué)碩士，高級工程師，主要從事食品與發(fā)酵工程研究。E-mail：xuhongxian@hotmail.com

*通信作者：段 鋼（1966—），男，遼寧沈陽人，工學(xué)博士，亞太地區(qū)技術(shù)總監(jiān)，主要從事工業(yè)酶應(yīng)用與開發(fā)研究。E-mail：gang.duan@dupont.com