金幼平，楊雪英，沈 雁，孫建峰

（紹興市水環(huán)境科學(xué)研究院有限公司，浙江紹興 312000）

預(yù)處理方式對(duì)水中葉綠素a檢測(cè)結(jié)果的影響

金幼平，楊雪英，沈 雁，孫建峰

（紹興市水環(huán)境科學(xué)研究院有限公司，浙江紹興 312000）

文章以純?cè)宸N培養(yǎng)液及天然水樣為試驗(yàn)樣本，對(duì)分光光度法測(cè)定葉綠素a常用的3種預(yù)處理方法：研磨、反復(fù)凍融、直接浸泡的效果進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，反復(fù)凍融及直接浸泡提取效率受樣本所含藻種類別影響顯著，在實(shí)際應(yīng)用中存在較大局限性；研磨法提取效果穩(wěn)定，且可以用機(jī)器代替手工作業(yè)，是較為理想的葉綠素a預(yù)處理方法。該研究可以為水質(zhì)檢測(cè)人員在選擇葉綠素a檢測(cè)方法時(shí)提供參考。

葉綠素a 分光光度法 研磨 凍融 直接浸泡

在環(huán)境監(jiān)測(cè)中，葉綠素a通常被作為湖泊富營(yíng)養(yǎng)化評(píng)估的重要指標(biāo)之一，其常用的檢測(cè)方法有分光光度法、熒光光度法和高效液相色譜法等[1]。其中，以分光光度法使用最為普遍。目前，國(guó)內(nèi)分光光度法測(cè)定葉綠素a的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)包括《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》（第四版）[1]、《水和廢水檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法》（美國(guó)公共衛(wèi)生協(xié)會(huì)等。目前，最新版本為第22版）[2]、《水質(zhì) 葉綠素的測(cè)定 分光光度法》SL 88-2012[3][4]，還有一些文獻(xiàn)中采用的方法，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行了偏離[5-10]。比較發(fā)現(xiàn)，這些檢測(cè)方法的主要差異體現(xiàn)在葉綠素a的提取方式上。文章以不同優(yōu)勢(shì)種水樣為研究對(duì)象，對(duì)不同提取方式的效果進(jìn)行了比對(duì)，比對(duì)結(jié)果可以給相關(guān)人員在選擇葉綠素a檢測(cè)方法時(shí)提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

選取3個(gè)天然水樣及4種純?cè)宸N培養(yǎng)液（藻種購(gòu)買自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所）開(kāi)展相關(guān)研究。

1.2 試驗(yàn)方法

每個(gè)水樣均勻分成若干份，分別用裝有玻璃纖維（孔徑0.45μm）的抽濾裝置負(fù)壓過(guò)濾，抽濾過(guò)程結(jié)束前，在濾器中加入2 ml飽和碳酸鎂懸液。抽濾完成后，取出帶有浮游植物的濾膜，并用濾紙吸干濾膜上的水分，按不同標(biāo)準(zhǔn)的要求，對(duì)含藻濾膜進(jìn)行處理，并將處理后的溶液轉(zhuǎn)移到10 ml帶蓋離心管中，4℃冰箱暗處?kù)o置24 h后（中途震搖2次），5 000 r/min離心15 min，取上清液進(jìn)行葉綠素a的測(cè)定，并計(jì)算結(jié)果。

對(duì)高通量組織研磨器（品牌:寧波新芝）和手工研磨效果進(jìn)行比對(duì)。組織研磨器參考研磨條件為：70 Hz，1 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同樣品葉綠素a檢測(cè)結(jié)果的比較

2.1.1 純?cè)宸N培養(yǎng)液葉綠素a檢測(cè)結(jié)果

純?cè)宸N培養(yǎng)液采用不同提取方式測(cè)得的葉綠素a結(jié)果見(jiàn)表1。

試驗(yàn)結(jié)果表明，不同提取方式的提取效率與樣本中所含藻種有密切關(guān)系。以研磨法為參照，除裸藻、針桿藻外，普通小球藻、雙對(duì)柵藻用直接浸泡、反復(fù)凍融方式提取效率均較低。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因，可能與藻種細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)致密性或組成成分有關(guān)。

表1 純?cè)宸N培養(yǎng)液不同提取方式葉綠素a檢測(cè)結(jié)果 μg/L

表2 天然水樣不同提取方式葉綠素a檢測(cè)結(jié)果的比較 μg/L

表3 不同研磨方式葉綠素a檢測(cè)結(jié)果 μg/L

2.1.2 天然水樣葉綠素a檢測(cè)結(jié)果

天然水樣采用不同提取方式時(shí)，測(cè)得的葉綠素a結(jié)果見(jiàn)表2。

不同提取方式對(duì)實(shí)際水樣葉綠素的提取效率同樣存在差異性，優(yōu)勢(shì)種為裸藻和硅藻時(shí)3種方式的提取效率相對(duì)接近，優(yōu)勢(shì)種為綠藻時(shí)提取效率差異較大。

2.2 不同研磨方式葉綠素a檢測(cè)結(jié)果的比較

在研究過(guò)程中，共選取3種純?cè)宸N培養(yǎng)液，對(duì)手工研磨和組織研磨器的研磨效果進(jìn)行了比對(duì)，比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表3。

試驗(yàn)表明，手工研磨和高通量組織研磨器的研磨效率基本相當(dāng)，不同藻種兩者提取效率的相對(duì)偏差均小于5%，能夠滿足實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)精密度的要求。

3 結(jié)論

（1）研磨法、凍融法、直接浸泡提取法3種預(yù)處理方法，對(duì)不同藻種的葉綠素a提取效率并不一致。從試驗(yàn)結(jié)果看，3者中研磨法提取效率最高，且相對(duì)穩(wěn)定，可作為葉綠素a檢測(cè)優(yōu)先選用的預(yù)處理方式。

（2）凍融法和直接浸泡操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但其提取效率受水樣所含藻種的影響顯著，在日常檢測(cè)和研究工作中，除非有特殊情況，否則不推薦使用。

（3）試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)震蕩頻率和震蕩時(shí)間適宜時(shí)，高通量組織研磨器與手工研磨的效果基本相當(dāng)。由于機(jī)器研磨具有效率高、工作強(qiáng)度相對(duì)較低的優(yōu)點(diǎn)，所以可作為手工研磨的替代方式。

[1] 《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》第四版．中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社：670～671

[2] Lenore S．Clesceri Arnold E．Greenberg Andrew D．Eaton．Standard Methods For The Examination of Water and Wastewater 22 th Edition．10200 H．Chlorophyll

[3] 《水質(zhì) 葉綠素的測(cè)定 分光光度法》SL 88-2012．中國(guó)水利水電出版社

[4] 宋書(shū)群，孫軍，俞志明．長(zhǎng)江口及其鄰近水域葉綠素a的垂直格局及成因初析．植物生態(tài)學(xué)報(bào)，2009，33（2）：369～379

[5] 林佳，蘇玉萍，鐘厚璋．一座富營(yíng)養(yǎng)化水庫(kù)—福建山仔水庫(kù)夏季熱分層期間浮游植物垂向分布．湖泊科學(xué)，2010，22（2）：244～250

[6] 姚緒姣，劉德富，楊正健，等．三峽水庫(kù)香溪河庫(kù)灣冬季甲藻水華生消機(jī)理初探．環(huán)境科學(xué)研究，2016，25（6）：645～651

[7] 趙辛．葉綠素a測(cè)定方法改進(jìn)的探討．福建分析測(cè)試，2007，16（1）：31～32

[8] 吳志旭，張雅燕．浮游植物體內(nèi)葉綠素a測(cè)定方法的改進(jìn)．化學(xué)分析計(jì)量，2002，11（6）：37～38

[9] 張如美，孫曉斌．對(duì)葉綠素a測(cè)定方法的改進(jìn)．環(huán)境監(jiān)測(cè)管理與技術(shù)，2002，14（2）：31

[10] 韓桂春，谷豐，張忠臣．淡水中葉綠素a測(cè)定方法的探討．中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)，2005，21（1）：55～57