臧學(xué)麗，李亞芹，曾鳳英

（長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林長春 130031）

淺析納豆激酶固體發(fā)酵條件優(yōu)化

臧學(xué)麗，李亞芹，曾鳳英

（長春醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，吉林長春 130031）

文章主要研究產(chǎn)納豆激酶的枯草芽孢桿菌的固體發(fā)酵條件優(yōu)化。優(yōu)化接種量、培養(yǎng)溫度、時間及納豆的蒸煮時間等影響納豆激酶產(chǎn)量的因素。試驗結(jié)果表明，接種量為8%，培養(yǎng)溫度為37℃，納豆激酶產(chǎn)量達到最高。經(jīng)過條件的優(yōu)化酶活達到4 080 U/g，為進一步的發(fā)酵研究提供依據(jù)。

納豆激酶 固體發(fā)酵 枯草芽孢桿菌

納豆激酶（Nattokinase，NK）是由納豆枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis natto，BSN ）產(chǎn)生的1種堿性絲氨酸蛋白酶。它能夠溶解體內(nèi)的血栓，并能夠明顯地縮短優(yōu)球蛋白的溶解時間（ELT）[1]。納豆激酶不但能直接作用于纖溶蛋白，還能激活體內(nèi)纖溶酶原，加強內(nèi)源性纖溶酶的作用效果，從而更有效地發(fā)揮溶栓性能[2]。與其它的傳統(tǒng)溶栓藥物相比，納豆激酶具有特異性強、安全[3]、價格低廉、可以口服吸收、在體內(nèi)半衰期長等優(yōu)點[4]，是一種具有開發(fā)潛力的溶栓藥物。文章對產(chǎn)納豆激酶的枯草芽孢桿菌固體發(fā)酵條件進行優(yōu)化，使納豆激酶的酶活性得到了很大的提高。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗菌株：納豆枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis natto，BSN），長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生工實驗室保藏。

1.2 方法

1.2.1 納豆激酶活性測定

纖維蛋白平板法[5]（參照Astrup法）。

1.2.2 納豆中納豆激酶活力測定

稱取黃豆500 g，洗凈加入2.5倍水，浸泡過夜，分裝到250 ml三角瓶中，121℃高壓滅菌0.5 h，自然冷卻至50℃時以8%的接種量接上種子液，在37℃條件培養(yǎng)25 h。稱取納豆50 g，加入100 ml生理鹽水，浸泡30 min，5 000 r/min離心10 min，取上清液稀釋一定的倍數(shù)，采用纖維蛋白平板法測定酶活。

1.2.3 納豆枯草芽孢桿菌固體發(fā)酵條件優(yōu)化

（1）不同接種量對納豆枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶的影響。在接種量為4%、6%、8%、10%和12%的條件下分別測定納豆枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶的酶活。

（2）不同培養(yǎng)時間對納豆激酶酶活的影響。在培養(yǎng)時間為20 h、22 h、24 h、26 h、28 h，分別測定納豆激酶的酶活。

2 結(jié)果與討論

2.1 接種量對納豆激酶酶活的影響

試驗結(jié)果表明，在接種量為8%時，酶產(chǎn)量達到峰值，酶活性達到4 020 U/g。原因可能為隨著接種量的增加，發(fā)酵液中可產(chǎn)納豆激酶的菌體數(shù)量逐漸增加。而在超過8%時，隨著接種量的增加，酶活性逐漸降低，可能原因是在有限的營養(yǎng)環(huán)境中，隨著發(fā)酵菌體的增加，對營養(yǎng)的競爭逐步激烈，大量菌體的存在抑制了酶的生產(chǎn)。

2.2 培養(yǎng)溫度對納豆激酶酶活的影響

試驗結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌最適的產(chǎn)酶溫度為37℃，酶活性達到4 080 U/g。發(fā)酵溫度較低時，酶活相對較低，達到產(chǎn)酶峰值時間較長，這無疑增加了生產(chǎn)成本。而在發(fā)酵溫度較高時，酶活并未得到有效的提高，且過高的溫度也會增加工業(yè)生產(chǎn)中的成本。

3 結(jié)論

該研究經(jīng)過發(fā)酵條件的優(yōu)化，酶活得到了大量的提高，與現(xiàn)代的高效理念相符。在接種量為8%，培養(yǎng)溫度為37℃的條件下，納豆激酶酶活達到4 080 U/g。

[1] 李淑英，趙仲麟，聶瑩，等．納豆激酶研究進展．中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2013，（4）：139～143

[2] 程守強，梁鳳來，王仁靜，等．納豆激酶的研究進展．微生物學(xué)雜志，2005，（2）：69～74

[3] He Ni，Peng-Cheng Guo，Wei-Ling Jiang，et al．Expression of nattokinase in Escherichia coli and renaturation of its inclusion body．Journal of Biotechnology，2016

[4] 逯京華，孫智杰．納豆激酶的研究現(xiàn)狀與展望．生物技術(shù)通報，2009，（8）：41～45

[5] Sumi，H．Experimentia，1987，43:1110～1111