陳 瑾， 王素英， 董世瑞

(天津市食品生物技術重點實驗室 天津商業(yè)大學 生物技術與食品科學學院， 天津 300134)

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成簇規(guī)律間隔短回文重復系統(tǒng)的結構、作用機制及應用

陳 瑾， 王素英， 董世瑞

(天津市食品生物技術重點實驗室 天津商業(yè)大學 生物技術與食品科學學院， 天津 300134)

成簇的規(guī)律間隔短回文重復(CRISPR)是一類廣泛分布于細菌和古細菌基因組中的DNA重復結構。重復結構與前導序列、一系列相關蛋白一起，為原核生物提供抵御噬菌體和質粒等外源基因的獲得性免疫能力。綜述了CRISPR系統(tǒng)的結構、作用機制及應用，介紹了最新的研究成果，并對其發(fā)展前景進行了展望。

CRISPR；原核生物；外源基因；免疫

原核生物在長期進化中逐漸形成一段成簇的規(guī)律間隔短回文重復結構，是針對噬菌體等外源DNA的獲得性免疫系統(tǒng)，在大約40%的細菌和90%的古細菌基因組中均存在這一結構[1-3]。1987年，日本大阪大學的科研小組在研究大腸桿菌(Escherichiacoli)K12的堿性磷酸酶基因時發(fā)現其末端有一段串聯(lián)間隔重復序列，該序列包括14個29 bp的重復序列及32～33 bp的間隔序列[4]。2002年，Jansen等[5]將這種結構命名為Clustered regularly interspaced short palindromic repeats。2005年，MOJICA等[6]發(fā)現該結構中的間隔序列與噬菌體的DNA序列同源性較高，判斷其可能與細菌的免疫防御作用機制有密切關系。從2013年開始，已利用CRISPR介導的基因編輯技術實現對人類細胞、果蠅、細菌、小鼠等模式生物基因的遺傳改造操作，從不同方面發(fā)掘出CRISPR的應用價值[7-10]。

細菌和古細菌通過CRISPR免疫系統(tǒng)吸收侵入的噬菌體DNA，作為間隔序列插入到自身基因組中，轉錄形成的RNA與二次入侵的外源DNA通過堿基互補配對的方式結合，并在Cas蛋白的作用下降解外源DNA[11]，使其無法進行轉錄和翻譯。根據Cas基因核心序列的差異將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為3種類型。Ⅰ型系統(tǒng)中包括6個Cas蛋白，其中Cas3蛋白具有DNA酶及解旋酶活性[12]；Ⅱ型系統(tǒng)以Cas9蛋白及向導RNA為核心。Cas9蛋白在CRISPR RNA(crRNA)的成熟過程中起作用，能夠靶向降解外源DNA[13]；Ⅲ型系統(tǒng)以Cas6蛋白為核心，能夠引導成熟的crRNA到達特殊的Cas剪切復合體中[14]。目前應用范圍最廣的是相對更簡單的CRISPR/Cas9系統(tǒng)。

本文介紹了CRISPR/Cas系統(tǒng)的結構、作用機制和應用等方面的研究進展，闡述了未來的發(fā)展前景及可能出現的問題。

1　CRISPR的結構和作用機制

CRISPR系統(tǒng)由前導序列、CRISPR基因座、Cas基因3個部分組成。CRISPR基因座由一段間隔的串聯(lián)重復序列(Direct Repeat, DR)和插入其中的差異的間隔序列(Spacer)組成，其中重復序列為21～48 bp[2]，包括一段5～7 bp的回文序列，具有穩(wěn)定的莖環(huán)結構[1,5]；而間隔序列為26～72 bp，來自噬菌體、質粒等外源DNA序列。Cas基因是CRISPR位點附近的一系列相關基因，一般包含4～10個保守基因[2]，其轉譯的Cas蛋白具有重要作用。根據Cas基因的保守程度將其分為核心Cas基因、RAMP組件基因和亞型特異性Cas基因[15]。所有CRISPR結構中均含有Cas1～6基因，因此被稱為核心Cas基因，且Cas1～2基因存在所有CRISPR系統(tǒng)中，在解旋酶、核酸酶、聚合酶、RNA結合等結構域均發(fā)現有Cas1～2蛋白的存在[15-16]。前導序列(Leader)位于CRISPR的5′端，是一段300～500 bp、種內保守但種間有差異、富含AT堿基的序列，與第一個重復序列直接相連[16]。前導序列為新的間隔序列的插入提供了識別位點[8]，并且促進CRISPR基因座的轉錄過程[7]。

CRISPR/Cas系統(tǒng)抵御噬菌體或質粒等外源遺傳物質的入侵過程分3個階段，即適應階段、表達階段和干擾階段[17]。在適應階段，當外源噬菌體侵入時，其短的DNA序列插入到細菌基因組中前導序列和第一個重復序列之間，同時再產生一個重復序列；在表達階段，重復-間隔序列轉錄成長鏈RNA，此為CRISPR RNA前體(Pre-crRNA)，隨后被切割并加工成小的成熟的crRNA，并與Cas基因翻譯出的具有內切酶功能的Cas蛋白形成特殊的crRNA/Cas復合體；最后在干擾階段，當細菌再次被外源DNA侵染時，crRNA會與外源DNA序列互補配對，通過復合體的作用降解外源DNA，以此維持細菌基因組的穩(wěn)定性。

2 CRISPR的應用領域

2.1基因修飾

RNA干擾(RNAi)技術是真核生物常用的基因修飾技術；對于原核生物，傳統(tǒng)的基因修飾技術主要包括鋅指核酸酶(ZFNs)和轉錄激活因子樣效應物核酸酶(TALENs)。ZFNs和TALENs是以人工開發(fā)的特異性DNA結合蛋白作為靶標定位工具，成本高；而CRISPR是利用RNA來定位靶標，容易實現；CRISPR技術操作簡單、方便且迅速，而且CRISPR/Cas9的切口酶定位精確，安全性高，因此應用前景較廣泛，不僅推進基因編輯技術的發(fā)展，還在某些疑難問題解決方面顯示出一定的優(yōu)越性，如在CRISPR基因編輯技術出現之前，人們對引起免疫力較低人群致命感染的白色念珠菌無能為力，2015年Vyas等[18]對CRISPR/Cas系統(tǒng)進行了改造，設計得到能夠作用于98%的白色念珠菌基因組和絕大多數真菌的CRISPR/Cas系統(tǒng)。改造后的CRISPR/Cas系統(tǒng)能夠同時使抗生素抗性基因和必需基因的兩個拷貝同時突變，效果顯著。

2.2細菌的分子分型和進化分析

CRISPR結構的重復序列在種內保守，因此CRISPR位點在細菌分子分型中具有高分辨率[7-8]。相對于傳統(tǒng)的分型方法，CRISPR技術操作更加簡便迅速，具有高效性。目前基因分型的主要方法是T7E1內切酶法。而Zhu等[19]通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)建立了6個株系的基因組修飾小鼠，并用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)法對從F0至F2代的小鼠進行了基因分型，靈敏度可達到0.5%。證明利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)的PAGE分型法比T7E1內切酶法更簡便高效，滿足了基因分型更高的要求。在細菌抵抗外源遺傳物質的過程中，外源DNA作為新的間隔序列插入細菌基因組中使細菌獲得對外源遺傳物質的免疫記憶，且新的間隔序列總是插入前導序列和第一個重復序列之間。從間隔序列的排列順序變化可以得到細菌在不同時間及空間遭受外源遺傳物質的侵染，反映了細菌的進化過程。

2.3疾病治療

由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因編輯技術中表現的精確性，研究者已將其用于疾病的診斷與治療。研究表明，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對CXCR4進行基因組編輯可賦予細胞抵抗I型人類免疫缺陷病毒(HIV-1)的能力[20]。HIV-1可利用CXCR4進入細胞。研究人員利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)將CXCR4功能缺失突變株導入某些細胞中，賦予了被改造細胞對HIV-1的抵抗力。亨廷頓氏病(Huntingtons disease)是由能夠破壞大腦的突變蛋白引起的一種神經系統(tǒng)疾病。研究人員利用病毒作為載體感染兩組健康小鼠，通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)和突變基因的靶DNA對其中一組進行治療，效果顯著[21]。

2.4器官或組織修復

研究人員利用CRISPR/Cas9技術改造人體血管內皮細胞，Cas9蛋白能清除CIITA基因，而CIITA基因編碼調控II型主要組織相容性復合物(MHC)的轉錄因子。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對基因進行敲除，使細胞無法激活T細胞[22]，從而不能對外源物質產生免疫應答反應，保證系統(tǒng)的正常運行。結果證明利用CRISPR/Cas9技術有助于器官修復或組織工程的研究。

3　CRISPR系統(tǒng)的重要進展

隨著CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究熱潮，其優(yōu)勢得到了很好的體現，突破性的研究進展不勝枚舉。例如，Wong等[23]通過分析CRISPR的轉錄組數據，揭示了功能性向導RNA的特點，提供了設計向導RNA的新工具。只需在細胞中表達Cas9蛋白和向導RNA，Cas9蛋白會在向導RNA的作用下引入位點特異性的雙鏈斷裂，細胞通過同源重組進行修復，實現對基因組中特定位點的編輯。Gantz等[24]利用CRISPR/Cas9技術研發(fā)出一個新系統(tǒng)，利用它可以將一種雜合突變轉變成一種純合突變，即等位基因同時發(fā)生突變。純合突變時表型才會發(fā)生變化，這樣節(jié)省了人力物力。CRISPR/Cas9技術的編輯時間較長，無法靈活掌控。而Davis等[25]開發(fā)出一種能被類藥物小分子激活的Cas9酶形式，其活性可以暫時性的爆發(fā)，一段時間后酶活性下降，這種變化不會影響細胞進程。結果表明這種可被激活的Cas9形式的編輯速度比傳統(tǒng)的Cas9形式快25倍。Cas1和Cas2可以形成穩(wěn)定的復合體，發(fā)揮整合酶作用將獲得的新間隔序列插入到CRISPR位點中。Wang等[26]研究大腸桿菌中Cas1/Cas2復合物時發(fā)現其能夠與雙叉形式的前間隔序列相結合，而前間隔序列的3′端的側翼序列對于獲得新間隔序列尤為重要。因為側翼序列中存在PAM互補序列，此序列可被Cas1酶特異性識別并切割，切除5 bp左右的序列長度，剩余的DNA序列可插入到CRISPR位點中。研究結果揭示了依賴于PAM獲得新間隔序列的重要機制。

4　結論

CRISPR/Cas技術從問世到現在不到30年的時間，從2013年開始報道了許多研究成果以及發(fā)表了大量的論文，研究者對其的熱衷程度可見一斑。作為原核生物在進化過程中逐漸形成的一種免疫防御系統(tǒng)，CRISPR/Cas系統(tǒng)越來越展現出它的優(yōu)越性，在基礎研究、醫(yī)學、農業(yè)及食品工業(yè)等領域發(fā)揮著重要作用，相信未來在很多方面都會有更廣泛的應用價值。但是關于CRISPR/Cas介導的基因編輯技術的爭議也備受關注，有科學家利用此項技術對一些動物的生殖細胞進行改造，也許之后會對人體生殖細胞進行改造，這樣就涉及倫理道德的爭論問題。通過CRISPR技術人類可以消除疾病，但涉及改造人體生殖細胞的問題，這種行為屬于全球禁止的。一旦CRISPR技術被允許用于生殖細胞的改造工程，后果無法預料。凡事均有兩面性，究竟未來關于CRISPR技術的評判如何，還要依靠道德和法律的約束。不過我們始終相信，作為新一代基因編輯技術的強大工具，人類可以很好地運用這項新技術，最終造福社會。隨著人類想象力及創(chuàng)造力的不斷提升，CRISPR/Cas技術一定還有更廣的拓展方面和更大的應用價值。

[1]KUNIN V, SOREK R, HUGENHOLTZ P. Evolutionary conservation of sequence and secondary structures in CRISPR repeats[J]. Genome Biology, 2007, 8(4): 61.

[2]GRISSA I, VERGNAUD G, POURCEL C. The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats[J]. BMC Bioinformatics, 2007, 8: 172.

[3]MOJICA F J M, CESAR D EZ-VILLASE OR, SORIA E, et al. Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria[J]. Molecular Microbiology, 2000, 36(1): 244-246.

[4]ISHINO Y, SHINAGAWA H, MAKINO K, et al. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion inEscherichiacoli, and identification of the gene product[J]. Journal of Bacterioogyl, 1987, 169(12): 5429-5433.

[5]JANSEN R, EMBDEN J D, SCHOULS L M, et al. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes[J]. Molecular Microbiology, 2002, 43(6): 1565-1575.

[6]MOJICA F J, D EZ-VILLASE OR C, GARC A-MART NEZ J, et al. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements[J]. Journal of Molecular Evolution, 2005, 60(2): 174-182.

[7]LILLEST?L R K, REDDER P, GARRETT R A. A putative viral defence mechanism in archaeal cells[J]. Archaeaan International Microbiological Journal, 2006, 2(1): 59-72.

[8]POURCEL C, SALVIGNOL G, VERGNAUD G. CRISPR elements in Yersinia pestisacquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies[J]. Microbiology, 2005, 151(Pt 3): 653-663.

[9]BOLOTIN A, QUINQUIS B, SOROKIN A, et al. Clustered regularly interspaced short palindrome repeats(CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin[J]. Microbiology, 2005, 151(Pt 8): 2551-2561.

[10]PRANGISHVILI D, FORTERRE P, GARRETT R A. Viruses of the Archaea: a unifying view[J]. Nature Reviews Microbiology, 2006, 4(11): 837-848.

[11]HELER R, MARRAFFINI L A, BIKARD D. Adapting to new threats: the generation of memory by CRISPR-Cas immune systems[J]. Molecular Microbiology, 2014, 93(1): 1-9.

[12]SINKUNAS T, GASIUNAS G, FREMAUX C, et al. Cas3 is a single-stranded DNA nuclease and ATP-dependent helicase in the CRISPR/Cas immune system[J]. Embo Journal, 2011, 30(7): 1335-1342.

[13]DELTCHEVA E, CHYLINSKI K, SHARMA C M, et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III[J]. Nature, 2011, 471(7340): 602-607.

[14]WANG R, PREAMPLUME G, TERNS M P, et al. Interaction of the Cas6 riboendonuclease with CRISPR RNAs: recognition and cleavage[J]. Structure, 2011, 19(2): 257 264.

[15]HAFT D H, SELENGUT J, MONGODIN E F, et al. A guild of 45 CRISPR-associated (Cas) protein families and multiple CRISPR/Cas subtypes exist in prokaryotic genomes[J]. PLoS Computational Biology, 2005, 1(6): e60.

[16]MAKAROVA K S, GRISHIN N V, SHABALINA S A, et al. A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action[J]. Biology Direct, 2006, 1: 7.

[17]MARRAFFINI L A, SONTHEIMER E J. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea[J]. Nat Rev Genet, 2010, 11(3): 181-190.

[18]VYAS V K, BARRASA M I, FINK G R. A CRISPR system permits genetic of essential genes and gene families[J]. Science Advances, 2015, 1(3): e1500248.

[19]ZHU X, XU Y, YU S, et al. An Efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 System[J]. Scientific Reports, 2014, 4: 6420.

[20]HOU P, CHEN S, WANG S, et al. Genome editing of CXCR4 by CRISPR/cas9 confers cells resistant to HIV-1 infection[J]. Scientific Reports, 2015, 5: 15577.

[21]HANAE A. Gene-editing method halts production of brain-destroying proteins[N]. Science, 2015-10-20.http://www.sciencemag.org/news/2015/10/gene-editing-method-halts-production-brain-destroying-proteins.

[22]ABRAHIMI P, CHANG W G, KLUGER M S, et al. Efficient gene disruption in cultured primary human endothelial cells by CRISPR/Cas9[J]. Circulation Research, 2015, 117(2): 121-128.

[23]WONG N, LIU W, WANG X. WU-CRISPR: characteristics of functional guide RNAs for the CRISPR/Cas9 system[J]. Genome Biology, 2015, 16(1):1-8.

[24]GANTZ V M, JASINSKIENE N, TATARENKONA O, et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2015, 112(49): e6736-6743.

[25]DAVIS K M, PATTANAYAK V, THOMPSON D B, et al. Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specilicity[J]. Nature Chemical Biology, 2015, 11(5): 316-318.

[26]WANG J, LI J, ZHAO H, et al. Structural and mechanistic basis of PAM-dependent spacer acquisition in CRISPR-Cas systems[J]. Cell, 2015, 163(4): 840-853.

The structure, mechanism and application of clustered regularly interspaced short palindromic repeats system

CHEN Jin, WANG Su-ying, DONG Shi-rui

(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is a kind of repetitive DNA structure, which is widely distributed in bacterial and archaeal genomes. The structure with leader sequence and a series of associated proteins together provide acquired immunity against phage and plasmid genes for prokaryotes. In this paper, the structure, mechanism and application of CRISPR system are summarized, the latest research progress is introduced, and the prospect of its development is prospected.

CRISPR; prokaryote; foreign gene; immune

2015-11-23；

2015-12-17

國家自然科學基金項目(31270050);天津市教委高等學?？萍及l(fā)展基金計劃項目(20130624)；天津市高等學校創(chuàng)新團隊(TD12-5049)

陳瑾，碩士研究生，研究方向為微生物資源開發(fā)與利用，E-mail:398358677@qq.com

董世瑞，博士，副教授，研究方向為生物技術，E-mail:dongshirui@tjcu.edu.cn

Q78;Q93

A

2095-1736(2016)05-0087-03

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.05.087