郝蔚++王麗麗++景偉文++李克梅++陳全家++李丹++顧愛星

摘要：建立了一種改進(jìn)的棉酚和單寧含量高效液相色譜測定方法，確定該測定方法的優(yōu)點(diǎn)和適用范圍，通過室內(nèi)用棉花黃萎菌孢子懸浮液對不同抗病性的12個(gè)棉花品種進(jìn)行接菌，測定了葉片和根部棉酚和單寧的含量，并與未接菌的對應(yīng)品種進(jìn)行比較，研究不同棉花品種棉酚和單寧的含量與對落葉型黃萎病抗病性的關(guān)系，并且明確棉株不同組織中棉酚、單寧與品種抗病性的關(guān)系。結(jié)果表明，對該測定方法分析條件做了改進(jìn)，試驗(yàn)精密度及重復(fù)性好（棉酚RSD=1.06%，單寧RSD=1.64%），準(zhǔn)確度高（回收率為棉酚98%～102%，單寧98%～102.3%）。經(jīng)過棉花黃萎病菌的誘導(dǎo)，棉酚含量比未經(jīng)誘導(dǎo)高；未接菌根部棉酚平均含量比葉部棉酚平均含量高出8.65%，而接菌處理則高出4.56%；且抗病品種棉酚含量均高于感病品種，棉酚含量與棉花品種相對病情指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)（葉片未接菌r=-0.936，葉片接菌處理r=-0.941，根未接菌r=-0.991，根接菌處理r=-0.939）。未接菌葉部單寧平均含量比根部單寧平均含量高出6.81%，而在接菌處理下高出1.90%。未接菌的抗病品種葉部和根部的單寧含量均高于感病品種葉部和根部的單寧含量，單寧含量與相對病情指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)（葉片未接菌r=-0.992，根未接菌r=-0.988）；而在接菌處理下呈現(xiàn)相反趨勢，單寧含量與相對病情指數(shù)呈顯著正相關(guān)（葉片接菌處理r=0.980，根接菌處理r=0.874）。

關(guān)鍵詞：棉花；單寧；棉酚；抗病性；黃萎??；高效液相色譜法

中圖分類號： S435.621.2+4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0147-04

收稿日期：2015-01-20

基金項(xiàng)目：新疆研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（編號：xjau-2013-yjsky—）；新疆維吾爾自治區(qū)科學(xué)技術(shù)廳高技術(shù)項(xiàng)目（編號：201111117）；棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（編號：CB2014A05）。

作者簡介：郝蔚（1989—），女，陜西麟游人，碩士研究生，主要從事棉花抗病育種研究。E-mail：982733172@qq.com。

通信作者：顧愛星，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事作物轉(zhuǎn)基因、微生物資源利用和抗病蟲分子克隆的研究。Tel：（0991）8763825；E-mail：guai_xing@sina.com。棉花黃萎病是一種土傳維管束病害，廣泛分布于世界各產(chǎn)棉國，對棉花的生產(chǎn)造成了嚴(yán)重影響。自20世紀(jì)90年代以來，我國棉花黃萎病持續(xù)暴發(fā)對棉花的危害和產(chǎn)量影響嚴(yán)重。棉花黃萎病（Verticillium wilt）被稱為棉花“癌癥”[1]，在生產(chǎn)中極具毀滅性。1935年，棉花黃萎病傳入中國，并逐漸在478個(gè)產(chǎn)棉縣（市）蔓延[2]。新疆是我國主要產(chǎn)棉區(qū)，近年來黃萎病發(fā)生嚴(yán)重[3]。由于棉花黃萎病菌能夠以微菌核的形式長期存活于土壤中，因此防治困難，目前仍無有效的防治方法[4-5]。當(dāng)黃萎病菌侵染[6]棉株，會引起棉株發(fā)生一系列生理生化反應(yīng)[7-8]。研究表明，黃萎病菌侵染棉花后，毒素作用使得病原菌可以在寄主體內(nèi)蔓延、擴(kuò)展，棉花為了抵抗病菌的侵害，自身的生理生化代謝會向著有助于產(chǎn)生抗病物質(zhì)的方向發(fā)展。植物次生代謝是植物在進(jìn)化過程中對環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果，植物受到病原菌侵染后，會有小分子的抗性物質(zhì)，用以增強(qiáng)自身的抵抗力。棉酚和單寧等次級代謝產(chǎn)物對棉花的抗病有一定影響，棉花受病原菌侵染后，體內(nèi)棉酚和單寧含量明顯增加，因而推測棉酚和單寧對棉花抗病性有一定的作用。

棉花黃萎病一直是我國棉花抗病遺傳育種領(lǐng)域植物病理學(xué)研究的重點(diǎn)。從棉花生產(chǎn)需求出發(fā)，分離并鑒定與棉花抗黃萎病有關(guān)的次級代謝產(chǎn)物，探明抗性生理生化機(jī)制[9]，不但有利于病理學(xué)和棉花遺傳育種學(xué)的發(fā)展完善，而且對創(chuàng)制抗病高產(chǎn)種質(zhì)、棉花抗病育種工作和提高病害綜合防治成效都具有重要的理論和實(shí)踐意義。

目前對于落葉型黃萎病棉花的次級代謝產(chǎn)物含量與抗病性關(guān)系的報(bào)道較少，對于次級代謝產(chǎn)物變化規(guī)律與抗病程度的關(guān)系研究有待深入研究，探明棉花對黃萎病抗性機(jī)制，對該病的抗病育種和防治工作具有重要意義。本研究用落葉型黃萎病菌侵染不同抗病性的棉花品種，采用人工接種落葉型黃萎病菌后，在苗期測定葉片和根部棉酚及單寧含量，通過研究棉花黃萎病棉株的棉酚和單寧含量與抗黃萎病性的關(guān)系，為棉花黃萎病的抗病性鑒定提供依據(jù)。筆者所在課題組根據(jù)文獻(xiàn)[10]，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件對已發(fā)表文獻(xiàn)報(bào)道方法做了一些改進(jìn)，建立測定棉酚和單寧的方法，使用高效液相色譜法（HPLC）對棉花葉片和根部的次級代謝產(chǎn)物棉酚和單寧進(jìn)行分離和測定，分析了落葉型黃萎病菌侵染前后棉株體內(nèi)棉酚和單寧含量的變化，以探討棉酚和單寧與落葉型黃萎病菌棉花抗病性的關(guān)系，以期為黃萎病的綜合防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試材料

供試棉花為盆栽棉花（冀668、遼棉18號、新海13號、軍海1號、新海30號、新海1號、川243、大鈴棉、碩豐1號、108夫、軍棉1號、K222）。供試棉花黃萎病菌株為落葉型棉花黃萎病菌V76（由美國南部平原棉花研究所提供）。

1.2儀器與試劑

島津LC-20AB型高效液相色譜儀，SPD-M20A檢測器，色譜柱：C18柱（5 μm，4.6 mm×150 mm），超聲清洗器，振蕩器，離心機(jī)，粉碎機(jī)。

棉酚標(biāo)準(zhǔn)樣品購自Sigma公司（95%，規(guī)格20 mg），單寧標(biāo)準(zhǔn)樣品購自Sigma公司（95%，規(guī)格20 mg），丙酮（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司），甲醇（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司），無水乙醇（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司），以上均為分析純；甲醇（色譜純）；磷酸（優(yōu)級純）。

1.3方法

1.3.1樣品的處理稱取棉株的不同組織，粉碎并過40目篩，取樣品0.1 g左右（精確至0.000 1 g）置于100 mL容量瓶中，以70%丙酮稀釋定容到50 mL，振蕩溶解后靜置1 h，放超聲清洗器中30 min，靜置片刻，取上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，測定棉酚時(shí)進(jìn)樣10 μL。

取棉株的不同組織，粉碎并過40目篩，取樣品0.1 g左右（精確至0.000 1 g）加入提取劑（丙酮水1 ∶1溶液60 mL），置于超聲清洗器中30 min，取上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，測定單寧時(shí)進(jìn)樣10 μL。

1.3.2色譜條件棉酚色譜柱C18柱（5 μm，4.6×150 mm），柱溫25 ℃，流動相為甲醇-體積分?jǐn)?shù)1%磷酸溶液（90 ∶10，V/V），流速1.0 mL/min，檢測波長254 nm，進(jìn)樣量10 μL。

單寧色譜柱C18柱（5 μm，4.6×150 mm），柱溫22 ℃，流動相為甲醇和水（體積比80 ∶20），流速為 0.5 mL/min，檢測波長 265 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.3取葉方法接菌15 d后，棉花表現(xiàn)出明顯癥狀后開始取樣，09：00開始取第1張真葉，去除葉脈后剪碎混勻，稱取0.5 g，續(xù)取3 d。每次測定采用隨機(jī)取樣方式，所有指標(biāo)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)。

1.3.4數(shù)據(jù)處理采用 SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料均以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差（x±s）”表示，進(jìn)行方差分析。各因素之間采用線性回歸方程進(jìn)行相關(guān)分析。指標(biāo)間相關(guān)性采用相關(guān)系數(shù)r值表示；P<0.05表示有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3.5棉種處理挑選飽滿的棉籽，首先用75%乙醇清洗2次，每次35 s，其次用30%H2O2浸泡 4～5 h后，用無菌水搖動清洗2～3遍，放入智能培養(yǎng)箱，在無菌水中浸泡催芽12 h，選露白的棉籽播種于裝有滅菌花卉用土的塑料花盆中，每個(gè)品種播種4個(gè)花盆，滅菌土覆蓋2～3 cm鋪平壓緊，花盆口覆蓋1層地膜保濕，每個(gè)花盆種植5粒種子，播種后將花盆置于托盤內(nèi)[11-12]，播種后進(jìn)行常規(guī)的溫室管理，晝溫30 ℃，夜溫 25 ℃，相對濕度 50%，光照各12 h，第3張真葉展平時(shí)進(jìn)行人工接菌。

1.3.5病原菌的培養(yǎng)及接種方法菌液的配制在新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)生物樓制作完成，將落葉型黃萎菌V76接入PDA液體培養(yǎng)基，放入振蕩培養(yǎng)箱使之繁殖生長72 h后，3層滅菌紗布過濾，用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法計(jì)算菌液中孢子含量為2×106～3×106個(gè)/mL，4 ℃冷藏備用。

切根蘸菌法：等棉株長到2～3張真葉時(shí)接菌，剪刀滅菌后剪掉塑料花盆底部[13-14]，并將露出的棉苗須根剪掉 1～3 mm，放入盛有40 mL孢子懸液的培養(yǎng)皿中，菌液濃度為 2×106～3×106個(gè)/mL，放回托盤中，不接菌的以無菌水浸泡作為對照，接菌40 min后在托盤中灌滿清水，保持高濕狀態(tài) 48 h，溫度25 ℃。以后常規(guī)澆水。

1.3.6病級分類0級：健株，葉片無病狀；1級：有25%及以下的葉片表現(xiàn)癥狀，即葉片出現(xiàn)葉肉變黃或呈現(xiàn)不規(guī)則形的黃色病斑；2級：26%～50%的葉片表現(xiàn)病狀，病斑顏色大部分變?yōu)辄S色或黃褐色，葉片邊緣略有卷枯現(xiàn)象；3級：51%～75% 的葉片表現(xiàn)病狀，少數(shù)病葉凋落；4級：76%及以上的葉片表現(xiàn)病狀，多為褐色掌狀枯斑，嚴(yán)重時(shí)葉片大量脫落，甚至棉株枯死。病情指數(shù)按下列公式計(jì)算：病情指數(shù)=（∑各級病葉數(shù)×相應(yīng)病級）/（總?cè)~數(shù)×最高病級）×100；相對病情指數(shù)=校正系數(shù)K×鑒定材料病情指數(shù)；校正系數(shù)K= 50/感病對照品種實(shí)際病指，50為規(guī)定感病對照的標(biāo)準(zhǔn)病指。抗病性分級標(biāo)準(zhǔn)詳見表1。

2結(jié)果與分析

2.1方法學(xué)評價(jià)

2.1.1重復(fù)性測定選擇同一個(gè)品種稱取6份樣品各0.1 g于具塞離心管中，加入提取單寧和棉酚溶劑，超聲-振蕩提取后離心，取上清液過濾后進(jìn)行測定，考察試驗(yàn)的精密度，結(jié)果棉酚RSD為1.06%（表2），單寧RSD為1.64%（表3），表明試驗(yàn)的重復(fù)性及儀器的精密度良好。

2.1.2回收率試驗(yàn)稱取同一個(gè)品種樣品3份，每份0.1 g，按上述確定的條件進(jìn)行提取和測定，通過峰面積計(jì)算出樣液中棉酚和單寧的濃度，在提取液中分別加入棉酚和單寧標(biāo)準(zhǔn)液（實(shí)際量為1、2、3 mg/L）進(jìn)行測定，通過峰面積計(jì)算出加標(biāo)后濃度，計(jì)算回收率，所得回收率棉酚為98%～102%，單寧為98%～102.3%（表4、表5）。

2.2不同棉花品種的相對病情指數(shù)和抗性級別

可由表6可知，抗病材料3份，占25%；耐病材料5份，占41.67%；感病材料4份占33.33%。

2.312個(gè)棉花品種的棉酚含量

由表7可見，最高抗病性品種是冀668，最低抗病性品種

是K222。在葉片和根部、未接菌和接菌處理間棉酚的含量均存在顯著差異（P<0.05），在未接菌情況下根部棉酚平均含量比葉部棉酚平均含量高出8.65%，而在接菌處理下高出 4.56%?？共∑贩N無論葉部和根部接菌前酚類物質(zhì)含量均高于感病品種，而且根部的含量高于葉部的含量，接菌后所有品種葉部的酚類物質(zhì)含量都比接菌前有所增加，抗病性高的品種酚類物質(zhì)含量顯著高于抗病性低的品種，由此表明棉酚含量與品種抗病性有關(guān)。

2.412個(gè)棉花品種的單寧含量

由表8可見，葉片和根部、未接菌和接菌處理間單寧的含量均存在顯著差異（P<0.05）；在未接菌情況下葉部單寧平均含量比根部單寧平均含量高出6.81%，而在接菌處理下高出1.90%。接菌后所有品種的單寧含量比接菌前都有所增加。無菌處理的抗病品種單寧含量均高于感病品種，而在接菌處理下趨勢相反。

2.512個(gè)棉花品種相對病情指數(shù)與其不同組織棉酚和單寧含量的關(guān)系

無論是在根部還是葉片，在接菌處理和未接菌處理中，棉酚含量與品種的相對病情指數(shù)呈負(fù)相關(guān)?？共⌒栽讲?，相對病情指數(shù)越高，棉酚的含量越小。在未接菌的葉部和根部，單寧含量與品種的相對病情指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，相對病情指數(shù)越高，單寧含量越??；而在接菌處理的葉部和根部，單寧含量與品種的相對病情指數(shù)呈正相關(guān)。

3討論

通過查找文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，測定棉酚和單寧的方法有紫外分光光度法和液相色譜法，液相色譜法優(yōu)于紫外分光光度法，故筆者對液相色譜法進(jìn)行了改進(jìn)，并用重復(fù)性和回收試驗(yàn)進(jìn)行了方法學(xué)評價(jià)，棉酚的RSD為1.06%，單寧的RSD為1.64%；棉酚回收率為98%～102%，單寧的為98.0%～102.3%。采用高效液相色譜法測定含量，樣品處理方法省時(shí)簡便、取樣少、分離效果比較好、結(jié)果可靠。本方法對流動相進(jìn)行了改進(jìn)，前人用多種試劑作為復(fù)合流動相，而本研究都是應(yīng)用單一試劑，方便快速，精密度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

抗病性是由相對病情指數(shù)來表達(dá)的，相對病情指數(shù)越低抗病性越高，相對病情指數(shù)越高抗病性越低。無論是在根部還是葉片，在未經(jīng)黃萎病菌誘導(dǎo)和接菌處理中，棉酚含量與品種的相對病情指數(shù)都呈負(fù)相關(guān)。單寧在未經(jīng)黃萎病菌誘導(dǎo)時(shí)含量與品種的相對病情指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，而接菌后單寧含量呈正相關(guān)。感病品種單寧含量對落葉型黃萎病菌反應(yīng)明顯，感病品種接菌后，單寧含量激增；無菌處理的抗病品種單寧含量均高于感病品種，而在接菌處理下趨勢相反，可能是感病品種啟動防衛(wèi)反應(yīng)產(chǎn)生大量的單寧。棉酚含量在接菌前后的變化趨勢相近，因此苗期不接菌即可測定棉酚含量判定品種（系）抗性的指標(biāo)，這樣可以簡化測定步驟，節(jié)約測定時(shí)間。

本試驗(yàn)測得接菌前后根部棉酚含量高于葉部，可能是因?yàn)楦肯冉佑|病菌，反應(yīng)比葉部明顯，說明使用根部作為測定次級代謝產(chǎn)物的試驗(yàn)材料更具有代表性。沈其益認(rèn)為棉根中棉酚的含量高與抗病菌侵入及根內(nèi)擴(kuò)展密切相關(guān)[6]。而單寧接菌前后葉部含量高于根部，可能是因?yàn)閱螌幣c棉酚誘發(fā)部位不同。呂金殿等研究發(fā)現(xiàn)在同一品種中，無論是棉酚還是單寧含量，接菌處理均比未接菌的含量高[15]。本研究得出接菌后的棉酚和單寧含量均有所升高，由此說明病原菌可以刺激植物本身產(chǎn)生小分子的抗性物質(zhì)，用來增強(qiáng)自身的抵抗力。

棉酚和單寧是棉花植株內(nèi)重要的次生性物質(zhì)，對棉花病害表現(xiàn)出較好的抗性。本研究用強(qiáng)致病落葉型黃萎病菌侵染棉花，并在苗期測定棉花單寧的含量，探討棉花初期強(qiáng)致病力病菌侵染下次級代謝產(chǎn)物的含量與抗病性的關(guān)系。

4結(jié)論

抗病品種的棉酚含量均高于感病品種相應(yīng)組織中的含量，根組織內(nèi)的含量又高于葉片。接種棉花黃萎病菌葉片或根部棉酚含量比不接菌略有上升，抗病品種增長幅度顯著高于感病品種。棉酚含量與棉花品種相對病情指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)。

未接菌抗病品種單寧含量顯著高于感病品種，接菌之后呈相反趨勢。葉片組織內(nèi)的含量顯著高于根組織。經(jīng)黃萎病菌侵染后，棉苗組織中單寧含量比未接菌均有顯著提高。

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