馬 錦，楊如意

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 810001)

益氣合劑對免疫受抑大鼠免疫功能的影響

馬 錦，楊如意

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 810001)

目的 研究益氣合劑對免疫受抑大鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。方法 腹腔注射環(huán)磷酰胺建立免疫受抑大鼠模型。測定模型大鼠血清IgG、IgA、IgM含量，IL-2生成能力，胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)等免疫指標(biāo)，評價(jià)益氣合劑免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果 益氣合劑組大鼠血清IgG、IgM、IgA的含量，IL-2的生成能力及胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)與模型組比較明顯升高(P<0.05)。結(jié)論 益氣合劑能增強(qiáng)免疫受抑大鼠的免疫功能。

益氣合劑 免疫功能 大鼠 影響

免疫功能低下可出現(xiàn)免疫細(xì)胞發(fā)育、分化、增生、調(diào)節(jié)和代謝異常，臨床表現(xiàn)為易反復(fù)感染、自身免疫現(xiàn)象和某些腫瘤的發(fā)生率增高?，F(xiàn)代研究表明補(bǔ)益類中藥有一定的免疫增強(qiáng)作用，能夠有效地調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡[1-2]。益氣合劑是青海大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)科的臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有益氣健脾、溫陽補(bǔ)腎的功效。相關(guān)研究表明益氣合劑對脾氣虛證模型大鼠有免疫調(diào)節(jié)作用，且能改善癌癥腫瘤放、化療后的不良反應(yīng)，對免疫功能似有提升效應(yīng)[3-4]。本研究通過觀察益氣合劑對大鼠免疫功能的影響，初步探討其作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

清潔級wistar大鼠，雌雄各半，50只，8～10周齡，體重180～220克，由甘肅中醫(yī)學(xué)院提供，動物許可證號為SCXK(甘)2013-0002。

1.1.2 藥物

益氣合劑：將黨參20 g、麥冬9 g、五味子6 g、黃精10 g、淫羊藿9 g分兩次煎煮，第一次加蒸餾水1500 mL，煎煮2 h，第二次加蒸餾水500 mL，煎煮1 h，合并兩次濾液，紗布過濾，水浴蒸發(fā)制成。將益氣合劑制成高劑量(12.6g/kg )、中劑量(6.3g/kg )、低劑量(3.2g/kg)制劑 。

環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：14031325)。

1.1.3 試劑和儀器

RaT IL-2 ELISA kit試劑盒(批號為L141105156，武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司)。DNM-9602酶表分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)。TS-100恒溫混勻儀(杭州瑞誠儀器有限公司)。 RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀( 上海亞榮生化儀器廠)。HH-6數(shù)顯電子恒溫水浴鍋( 常州國華電器有限公司)。FA1004B型電子天平( 上海佑科儀器儀表有限公司)。 TG16-WS臺式高速離心機(jī)( 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥方法

將50只大鼠，隨機(jī)分平均為空白組、模型組、益氣合劑高劑量組、益氣合劑中劑量組、益氣合劑低劑量組，在實(shí)驗(yàn)過程中，死亡12只，判斷造模成功與否用去8只，實(shí)際每組6只?？瞻捉M和模型組給予生理鹽水(3mL/只·天)灌胃；益氣合劑高、中、低劑量組分別給予益氣合劑高、中、低劑量水煎劑(3mL/只·天)灌胃；除空白組，其余各組在灌胃前3 d，在給藥1 h后，給予環(huán)磷酰胺造模，即腹腔注射環(huán)磷酰胺50 mg/kg[5]。均自由飲食，共計(jì)14 d。

1.2.2 造模成功指標(biāo)[6]

實(shí)驗(yàn)第7 d，在空白組與模型組中，每組隨機(jī)抽取4只大鼠，進(jìn)行造模指標(biāo)的判斷。一般癥狀：有不同程度腹瀉，甚至肛脫，毛色晦暗發(fā)黃，毛發(fā)扎堆直立，活動量少，群聚抱團(tuán)，精神萎靡，食欲不振。模型指標(biāo)：稱取大鼠體重后處死，無菌條件下取脾臟、胸腺，剝?nèi)テ⑴K、胸腺上的雜質(zhì)，生理鹽水沖洗，用濾紙吸去多余水分，電子稱稱重，計(jì)算脾臟指數(shù)( 脾臟濕重/體重×10)和胸腺指數(shù) ( 胸腺濕重/體重×10)。

造模結(jié)束后，于實(shí)驗(yàn)第七天，分別在空白對照組及造模組中各隨機(jī)抽取4 只大鼠測定體重、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)，詳見表1。

組別動物數(shù)體重(g)脾臟指數(shù)胸腺指數(shù)空白組4194.75±13.5722.23±1.2512.189±2.19模型組4168.50±7.3315.01±1.744.88±0.57t-3.4046.7506.453P-<0.05<0.01<0.01

表1顯示，模型組大鼠體重減輕，與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)明顯下降，與空白組比較，差異有顯著性差異(P<0.01)。

1.2.3 取材方法

灌胃14 d，禁食12 h后，稱取大鼠體質(zhì)量，給予5%烏拉坦進(jìn)行腹腔麻醉，腹主動脈取血5 mL，室溫放置2 h，然后離心(3000r/min)10 min，取上清液，分裝于1 mLEP管中，-80 ℃保存。無菌條件下再分別剖取大鼠胸腺與脾臟，用濾紙吸干殘血，于分析天平稱取臟器質(zhì)量。

1.2.4 大鼠血清IgG、IgA、IgM含量及IL-2含量的測定方法[7]

取分裝于EP管的血清1 ml，用ELISA法測定IL-2的含量，剩余血清用全自動生化分析儀(透射比濁法)測定IgG、IgM、IgA的含量。

1.2.5 大鼠胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)測定方法

胸腺指數(shù)=胸腺重量/大鼠體重×10，脾臟指數(shù)=脾臟重量/大鼠體重×10，計(jì)算指數(shù)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般癥狀

造模第二天，除空白組，其他各組大鼠厭食、大便溏稀、活動減少、反應(yīng)遲鈍、卷曲拱背，一周后，除正常組，其他各組大鼠都有不同程度腹瀉，甚至肛脫癥狀，毛色晦暗發(fā)黃，毛發(fā)扎堆直立，活動量少，群聚抱團(tuán)，精神萎靡，食欲不振，益氣合劑低劑量組有死亡現(xiàn)象。

2.2 對大鼠IgG、IgA、IgM含量影響

空白組與模型組比較，模型組各指標(biāo)含量明顯降低(P<0.05)，說明造模成功；益氣合劑高、中、低劑量組與模型組比較，各指標(biāo)含量明顯升高(P<0.05)；益氣合劑高劑量組與中劑量組比較，IgA含量明顯升高(P<0.05)；益氣合劑高劑量組與低劑量組比較，IgG、IgA、IgM含量明顯升高(P<0.05)；益氣合劑中劑量組與低劑量組比較，IgG、IgM含量明顯升高(P<0.05)，詳見表2。

組別動物數(shù)IgAIgGIgM空白組60.216±0.0201.753±0.2220.452±0.041模型組60.162±0.011*1.148±0.130*0.199±0.022*益氣合劑高劑量組60.207±0.015#★▲1.703±0.139#▲0.380±0.015#▲益氣合劑中劑量組60.188±0.013#1.734±0.171#▲0.375±0.055#▲益氣合劑低劑量組60.184±0.014#1.455±0.281#0.284±0.091#F- 11.821 10.363 21.210P- <0.05 <0.05 <0.05

注：*與空白組比較P<0.05，#與模型組比較P< 0.05，★與益氣合劑中劑量組比較P<0.05，▲與益氣合劑低劑量比較P<0.05.

2.3 對大鼠臟器指數(shù)和IL-2的影響

空白組與模型組比較，模型組臟器指數(shù)和IL-2的含量明顯降低(P<0.05)，說明造模成功；益氣合劑高劑量組與模型組比較，各指標(biāo)明顯升高(P<0.05)；益氣合劑中劑量組與模型組比較，脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯升高(P<0.05)；益氣合劑低劑量組與模型組比較，各指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；益氣合劑高劑量組與中劑量組比較，胸腺指數(shù)和IL-2含量明顯升高(P<0.05)，益氣合劑高劑量組與低劑量組比較，各指標(biāo)明顯升高(P<0.05)；益氣合劑中劑量組與低劑量組比較，脾臟指數(shù)明顯升高(P<0.05)，詳見表3。

組別動物數(shù)胸腺指數(shù)(g/l)脾臟指數(shù)(g/l)IL-2(pg/ml)空白組610.309±1.20020.077±2.78228.45±4.90模型組66.155±1.938*14.796±1.836*19.44±1.41*益氣合劑高劑量組610.165±0.656#★▲20.183±2.185#▲27.66±2.18#★▲益氣合劑中劑量組68.380±1.506#19.895±0.981#▲22.30±3.56益氣合劑低劑量組67.399±1.50916.346±2.63522.64±4.17F- 9.415 7.988 7.229P- <0.05 <0.05 <0.05

注：*與空白組比較P<0.05，#與模型組比較P<0.05，★與益氣合劑中劑量組比較P<0.05，▲與益氣合劑低劑量比較P<0.05.

3 討論

免疫功能低下的最大特點(diǎn)是易反復(fù)感染且難以治愈，患者易感的外源性病原體種類主要取決于免疫系統(tǒng)受損的組分：體液免疫、吞噬細(xì)胞或補(bǔ)體缺陷患者易患細(xì)菌性感染，細(xì)胞免疫缺陷患者易發(fā)生病毒、真菌及原蟲等胞內(nèi)寄生性感染，另外病原體感染也可影響特異性和非特異性免疫功能，如HIV所致獲得性免疫缺陷綜合征。免疫功能低下患者也易發(fā)惡性腫瘤和自身免疫病，西醫(yī)治療以“補(bǔ)充和替代治療”為主，通過補(bǔ)充各種免疫分子(如胸腺肽、轉(zhuǎn)移因子、免疫球蛋白等)，以提高機(jī)體免疫功能。

環(huán)磷酰胺通過與細(xì)胞DNA的烷化反應(yīng)產(chǎn)生破壞力，特別是對增殖分化較快的骨髓造血組織、淋巴組織、生殖細(xì)胞等破壞作用明顯，因而具有抑制免疫和造血的作用[8]。實(shí)驗(yàn)研究方面，環(huán)磷酰胺能使小鼠脾臟、胸腺萎縮，碳廓清吞噬功能降低，NK細(xì)胞活性降低，血清溶血素含量降低，降低耳腫脹度及小鼠脾臟 T 淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)，對非特異性免疫和特異性免疫均有抑制作用[9]。本實(shí)驗(yàn)中，模型組與正常組比較有差異性(P<0.05)，可以說明環(huán)磷酰胺能導(dǎo)致大鼠體內(nèi)IgG、IgA、IgM含量、IL-2含量及脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)降低。

IGA、IGG和IGM屬于體液免疫，IGA作為體液中抗體，對抑制病原菌的吸附侵入起重要作用，具有重要的自然被動免疫功能。IGG具有抗細(xì)菌、抗病毒、抗毒素和主動免疫功能。IGM具有抗傷寒桿菌體及類風(fēng)濕因子等功能，在感染早期作用更強(qiáng)，對機(jī)體免疫防護(hù)有重要作用。益氣合劑各劑量組都能增加IgG、IgM、IgA的含量(P<0.05)，高劑量組IgA含量優(yōu)于中、低劑量組(P<0.05)，但是中低劑量組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，高、中劑量組IgM、IgG含量優(yōu)于低劑量組(P<0.05)，但是高、中劑量組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明益氣合劑能升高IgG、IgM的含量，且以高、中劑量為佳，也能升高IgA含量，且以高劑量為最佳。

胸腺與脾臟屬于重要的免疫器官，其臟器指數(shù)可在一定程度上反應(yīng)機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱，胸腺主要產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞，主要參與細(xì)胞免疫，脾臟主要儲存大量淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，B細(xì)胞比例較大，主要參與體液免疫。益氣合劑高、中劑量組脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)明顯優(yōu)于模型組(P<0.05)，益氣合劑低劑量組脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)與模型組比較，無顯著性差異(P>0.05)，高劑量組胸腺指數(shù)優(yōu)于中、低劑量組(P<0.05)，但中、低劑量組比較無差異(P>0.05)，高、中劑量組脾臟指數(shù)優(yōu)于低劑量組(P<0.05)，但高、中劑量組比較無差異(P>0.05)。

IL-2作為一種淋巴因子，能使細(xì)胞毒性T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞增殖，增強(qiáng)殺傷活性，促進(jìn)淋巴細(xì)胞分泌抗體和干擾素，具有抗腫瘤、抗病毒和增強(qiáng)免疫功能的作用[10]。益氣合劑中、低劑量組IL-2含量與模型組比較，無顯著差異(P>0.05)，益氣合劑高劑量組IL-2含量優(yōu)于模型組和中、低劑量組(P<0.05)。

中醫(yī)理論中，正虛邪勝或正邪兩衰，屬于免疫力低下，用扶正的方法，可扶正祛邪，最終達(dá)到陰平陽秘的狀態(tài)。黨參健脾補(bǔ)肺、益氣生津，能使碳粒廓清速率及胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均明顯高于模型組，能減輕環(huán)磷酰胺對小鼠免疫功能的抑制作用[11]。五味子收斂固澀，益氣生津，寧心安神，可顯著提高正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬百分率和吞噬指數(shù)，促進(jìn)溶血素和溶血空斑形成，促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化[12]。淫羊藿補(bǔ)腎壯陽，祛風(fēng)除濕，強(qiáng)筋鍵骨，能增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性和ConA誘導(dǎo)小鼠T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化活性，能增強(qiáng)脾細(xì)胞IL-2的產(chǎn)生，并降低CD8陽性細(xì)胞百分率，CD4/CD8陽性細(xì)胞細(xì)胞百分率顯著提高[13]。黃精補(bǔ)氣養(yǎng)陰，健脾，潤肺，益腎，能提高免疫抑制小鼠的臟器和溶血素指數(shù)，高劑量組血清中SOD活性恢復(fù)顯著，MDA水平顯著降低，達(dá)到或超過了正常小鼠水平，小鼠吞噬能力也有所提高，一定程度上緩解了炎癥[14]。麥冬養(yǎng)陰生津，潤肺清心，能增加CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平，能抑制白細(xì)胞減少，減輕惡心、嘔吐等化療副反應(yīng)，穩(wěn)定KPS評分和體質(zhì)量，提高生活質(zhì)量[15]。五藥配伍，氣血陰陽并補(bǔ)，肺脾腎兼顧，旨在共達(dá)益氣養(yǎng)陰，滋補(bǔ)肝腎之功，可達(dá)到增強(qiáng)免疫功能的作用。

本研究顯示，益氣合劑能增強(qiáng)免疫功能低下大鼠的免疫功能，與模型組比較，IGG、IGM、IGA、IL-2、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均有所提高(P<0.05)；說明益氣合劑通過對機(jī)體細(xì)胞特異性免疫、體液特異性免疫及免疫器官等作用，從而增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。因此，益氣合劑可以做為免疫增強(qiáng)劑應(yīng)用于臨床，但其對非特異性免疫的作用及增強(qiáng)免疫功能的機(jī)制，需做進(jìn)一步研究。

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The effect of yiqi mixture on immune function of immunosuppressed rats

Ma Jin，Yang Ruyi

(Qinghai University Medical college，Qinghai，Xining，810001)

Objective To study the effect of YiQi Mixture on immune function of immunosuppressed rats.Methods The immunosuppressed model was established by intraperitoneal injecting of cyclophosphamide in rats.serum IgG，IgM and IgA，IL-2 production capacity，spleen index and thymus index were detected afteradministrating YiQi Mixture.Results Serum IgG，IgM，IgA and IL-2，the spleen index and thymus index in therapeutic group of YiQi Mixture were raised compared those with the model group.Condusion The YiQi Mixture can improve the immune function of immunosuppressed rats.

YiQi Mixture Immune Function Rat Effect

R363.1

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.01.010

2015-10-10

馬 錦(1990～)，女，回族，青海籍，2013級科學(xué)班研究生