唐超群，永 勝，朱徳銳，劉 靜，雙 杰

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

青海牧區(qū)57份自制牦牛乳制品中產(chǎn)EPS乳酸菌的分離鑒定及特性研究

唐超群，永 勝，朱徳銳，劉 靜，雙 杰*

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

目的 從青海牧區(qū)牧民家庭自制牦牛乳制品(酸奶、曲拉)中分離產(chǎn)EPS乳酸菌，得到青海地區(qū)產(chǎn)EPS乳酸菌種群系統(tǒng)發(fā)育樹，并鑒定高產(chǎn)EPS乳酸菌，為后期產(chǎn)EPS乳酸菌在乳品工業(yè)中的開(kāi)發(fā)及利用提供理論基礎(chǔ)。方法 隨機(jī)采集樣本，乳酸菌采用CaCO3的MRS平板法分離，以形態(tài)結(jié)合生化實(shí)驗(yàn)初篩，用分子生物學(xué)方法即16s rDNA序列測(cè)定、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，最終確定乳酸菌種屬；用苯酚-硫酸法對(duì)乳酸菌進(jìn)行多糖產(chǎn)量定量分析；用瓊脂擴(kuò)散法行抑菌試驗(yàn)。模擬體外胃腸道環(huán)境完成生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果 從57份樣品中分離出純菌種86株，生化試驗(yàn)結(jié)合16s rDNA分析確定乳酸菌菌株52株，歸屬于5個(gè)菌屬，分別是嗜熱乳酸鏈球菌(33株)、糞腸球菌(6株)、側(cè)孢短芽孢桿菌(4株)、干酪乳桿菌(5株)、嗜酸乳桿菌(4株)；產(chǎn)EPS菌株為31株，以嗜熱鏈球菌為主，EPS濃度為(16.09±5.39)mg/L，最高濃度達(dá)28.83 mg/L，產(chǎn)量最高的是嗜熱鏈球菌，來(lái)自果洛州；抑菌試驗(yàn)中的52株乳酸菌菌株對(duì)四種致病菌均有抑制作用，排除強(qiáng)酸和H2O2干擾后，有部分菌株無(wú)抑菌圈，且所有菌株抑制病原菌生長(zhǎng)的能力較弱。模擬胃腸道生存實(shí)驗(yàn)中，不同時(shí)間生存率有差異，χ2=247.87(秩和檢驗(yàn)值=卡方值)，P<0.01，存活率中位數(shù)(四分位數(shù)間距，%)為：模擬胃液3 h為92.70(91.75，93.54)、腸液3 h為88.54(87.99，89.18)、腸液6 h為84.36(83.21，86.28)、腸液12 h為76.02(74.42，77.21)、腸液24 h為65.43(64.32，66.94)，存活率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。結(jié)論 青海傳統(tǒng)牦牛發(fā)酵乳中主要的優(yōu)勢(shì)乳酸菌為嗜熱鏈球菌，其次為糞腸球菌和干酪乳桿菌；青海牧區(qū)傳統(tǒng)牦牛發(fā)酵乳中乳酸菌產(chǎn)EPS產(chǎn)量相對(duì)較低；乳酸菌對(duì)四種腸道病原菌的抑制作用較弱，其中對(duì)大腸桿菌抑制作用最強(qiáng)；乳酸菌抵抗胃酸生長(zhǎng)能力較強(qiáng)；在不同胃腸道生長(zhǎng)環(huán)境(模擬)中乳酸菌存活率有差異；不同菌株間存活率不完全相同。

青海 牦牛 乳制品 EPS乳酸菌 特性

青海牦牛發(fā)酵乳中產(chǎn)胞外多糖(EPS)乳酸菌的種類、EPS產(chǎn)量與其他地區(qū)可能存在一定的差異，此次研究旨在發(fā)現(xiàn)產(chǎn)EPS乳酸菌的物種資源及優(yōu)勢(shì)菌種，獲得青海地區(qū)乳酸菌產(chǎn)EPS含量的值域范圍及其益生特性，為后期乳酸菌發(fā)酵制品的開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采集青海省四個(gè)牧區(qū)(果洛州、玉樹州、黃南州、海北州)牧民家庭中的自制乳制品(曲拉、酸奶)于滅菌管中，密封好放入冰盒置冰箱(4℃)保存。

1.2 主要試劑與儀器選擇

MRS(蛋白胨10.0g、肉膏10.0g、酵母浸粉5.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氫二鉀2.0g、檸檬酸氫二銨2.0g、碳酸鈣20.0g、乙酸鈉5.0g、硫酸鎂·7H2O 0.2g、硫酸錳·4H2O 0.05g、吐溫80 1.0mL、ddH2O 1000mL)固體(瓊脂15.0g)、液體(瓊脂7.5g)培養(yǎng)基；細(xì)菌生理生化鑒定試劑盒(北京陸橋生物制劑公司)；細(xì)菌DNA提取試劑盒(上海賽百盛公司)。

電子天平(PL203 Mettler To-ledo 公司)；小型高速冷凍離心機(jī)(5424型，德國(guó)Eppendorf公司)；PCR儀(TX-XP，杭州博日公司)；超純水系統(tǒng)(HealForceEasy公司)；恒溫培養(yǎng)箱(ZHWY-100B，上海智城公司)；恒溫?fù)u床 (ZD85，上海精達(dá)公司)；無(wú)菌操作臺(tái)(上海博訊公司)。

1.3 目標(biāo)菌株篩選

將樣品劃線于含有0.75%CaCO3的MRS平板上，培養(yǎng)48 h(37℃)，選出菌落周圍形成透明圈的菌落，將革蘭陽(yáng)性菌株繼續(xù)劃線于MRS平板，連續(xù)劃線培養(yǎng)2次以上直至確定為純菌，并記錄菌落的形態(tài)特征，純化后的菌株接種到MRS斜面培養(yǎng)基后，置冰箱(4℃)保存。

1.4 單個(gè)菌落涂片革蘭染色、H2O2酶實(shí)驗(yàn)及生化實(shí)驗(yàn)

革蘭染色方法：結(jié)晶紫初染1 min，用無(wú)菌雙蒸水沖洗后以碘液媒染1 min；用無(wú)菌雙蒸水沖洗后以95%酒精脫色30 s；用無(wú)菌雙蒸水沖洗后以堿性伊紅復(fù)染30 s。油鏡下觀察形態(tài)，記錄鏡下觀察結(jié)果(形態(tài)、大小、革蘭染色結(jié)果等)。

將革蘭陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)陰性的純菌菌株初步確定為乳酸菌。通過(guò)生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)合形態(tài)特征對(duì)乳酸菌進(jìn)行種鑒定，并對(duì)16S rDNA鑒定結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

1.5 牦牛乳制品中乳酸菌總DNA分離提取和16S rDNA鑒定

1.5.1 酸奶樣品的前處理

將已分離得到的純菌用脫脂乳液體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)3 d后，取帶菌脫脂乳樣品5 mL離心(4℃，2000r/min)5 min，收集上清液；將上清液離心(4℃，8000r/min)10 min，去上清液，收集細(xì)胞用2%檸檬酸鈉洗凈。

1.5.2 DNA提取、基因測(cè)序分析

將酸奶樣品細(xì)胞(1g)與2%無(wú)菌檸檬酸鈉溶液(9mL)混合，混合均勻放置2 min，將分離的乳酸菌菌株用生物試劑盒方法提取菌體總DNA，利用上下游通用引物，擴(kuò)增16S rDNA(PCR，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè))，-80 ℃保存。

將分離得到的乳酸菌總擴(kuò)增產(chǎn)物送生物工程公司行16S rDNA測(cè)序分析。將測(cè)序序列用GenBanK中的Blast程序進(jìn)行同源性比較，采用DNA MAN和Clustalx l.83b軟件比對(duì)分析序列后，用MEGA6.0軟件，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 生長(zhǎng)特性實(shí)驗(yàn)

將待測(cè)菌株過(guò)夜培養(yǎng)，至OD600值達(dá)1.20左右。純活菌劃線接種于不同NaCl濃度梯度(0、2%、4%、6%、8%、10%和15%)、不同溫度(10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃)、不同pH值(3、4.5、6、7、8、9)的MRS固體培養(yǎng)基中，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)平行組，恒溫振蕩培養(yǎng)(37℃，20h)，觀察菌落生長(zhǎng)情況。

1.7 EPS分離提純

1.7.1 分離

將分離得到的乳酸菌接種到經(jīng)滅菌的MRS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)活化(37℃，2～3次)。將活化后的菌液調(diào)整菌數(shù)到2×108CFU/mL，再按2%的接種量分別接種桿菌和球菌到2 mL MRS的培養(yǎng)基中。37 ℃發(fā)酵培養(yǎng)24 h后離心 (4℃，10000r/min)10 min，取上清液。加入4倍體積95%冷乙醇于上清液中，過(guò)夜沉淀(4℃)，離心(4℃，12000r/min)6 min，收集沉淀。再加入2 mL 45 ℃熱的超純水溶解，并裝入分子量為8000～14000的透析袋中放置冰箱(4℃)透析24 h，每天換3次水(每隔8 h換水1次)，定容測(cè)定多糖含量。

1.7.2 糖含量測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定糖含量。

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖20 mg于500 mL容量瓶中，加水定容。各種試劑按照表1所示的量加入試管中后，靜置10 min，搖勻，室溫放置20 min后于490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度。將2 mL蒸餾水同樣處理后作空白對(duì)照。以O(shè)D值和多糖含量構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 胞外多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

Table 1 The standard curve of Extracellular polysaccharide content

將純化的多糖(1.7.1)，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定程序，檢測(cè)490 nm處的吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算EPS的量，并篩選出高產(chǎn)EPS的乳酸菌菌株。

1.8 乳酸菌體外益生功能研究

1.8.1 抑菌能力研究

采用瓊脂擴(kuò)散法行抑菌試驗(yàn)。

乳酸菌發(fā)酵上清液準(zhǔn)備：將乳酸菌活化兩次，調(diào)整菌數(shù)(1×108CFU/mL)，按2%的比例接種到3個(gè)不同的10 mL MRS液體培養(yǎng)基中(分別編號(hào)1、2、3，37℃下培養(yǎng)24h)。將乳酸菌發(fā)酵液離心10 min，取上清液。1、2號(hào)管上清液用1.0 mol/L的NaOH調(diào)整pH到6.5，排除酸的影響。2號(hào)管添加過(guò)氧化氫酶溶液(300U/mL，溶于PBS緩沖液)，排除H2O2的影響。3號(hào)管上清液作為對(duì)照管，以2號(hào)管的抑菌直徑作為實(shí)際抑菌結(jié)果。

將20 mL營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基或腦心浸液培養(yǎng)基(含0.75%瓊脂)滅菌后冷卻到45 ℃，分別接入已過(guò)夜培養(yǎng)的四種不同致病菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、志賀氏菌)，使其終濃度為1×106CFU/mL，混勻，傾倒到無(wú)菌培養(yǎng)皿中。冷卻凝固后，用無(wú)菌打孔器在平板上打孔(8mm)，孔內(nèi)分別加入100 μL不同乳酸菌1、2、3號(hào)發(fā)酵液，4 ℃環(huán)境中擴(kuò)散5 h后放置培養(yǎng)(37℃，24h)，最后量取抑菌圈直徑(扣除8mm孔徑的大小)。

1.8.2 乳酸菌抵抗模擬胃腸道環(huán)境生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

根據(jù)規(guī)定[1]，設(shè)定實(shí)驗(yàn)N0的基數(shù)為1×106CFU/mL。模擬胃液(pH=3)：0.35 g胃蛋白酶溶于100 mL 0.2%的無(wú)菌生理鹽水，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH到3.0，過(guò)0.45 μm濾膜除菌。模擬腸液(pH=8)： 0.1 g胰蛋白酶、1.8 g膽鹽溶于無(wú)菌溶劑含1.1 g NaHCO3、0.2 g NaCl及100 mL蒸餾水，用0.5 mol/L的NaOH調(diào)整pH到8.0。溶液過(guò)0.45 μm濾膜除菌。

將已活化3次的菌液按10%的接種量接種到模擬胃液(pH=3)中，混勻，厭氧培養(yǎng)(37℃)，分別在0、3 h取樣做平板計(jì)數(shù)。在模擬胃液中培養(yǎng)3 h后，吸取I mL培養(yǎng)液接種到9 mL模擬腸液(pH=8)中(腸道的實(shí)際pH在6.8～7.3之間，所以加入的胃液可將腸液pH調(diào)至6.8～7.3之間)，厭氧培養(yǎng)(37℃)，分別在0、3、6、11、24 h即刻取樣計(jì)數(shù)。

存活率(%)= (1g N1/1g N0)×100%

N1、N0分別代表經(jīng)過(guò)模擬胃腸道培養(yǎng)后、前的乳酸菌數(shù)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS19.0軟件，計(jì)量資料采用方差分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)/確切概率法，不服從正態(tài)分布的計(jì)量資料(如存活率)采用秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)P=0.05。

2 結(jié)果

2.1 樣本

2013年3月～2014年12月隨機(jī)從青海果洛州、玉樹州、黃南州、海北州四個(gè)牧區(qū)57戶牧民家中無(wú)菌采集到傳統(tǒng)自制牦牛發(fā)酵乳制品—曲拉和酸奶57份(表2)，4 ℃保存。

表2 牦牛發(fā)酵乳制品地區(qū)分布

Table 2 The regional distribution of yak fermented dairy products

2.2 革蘭染色及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

通過(guò)革蘭染色從57份樣品中分離到G+菌(鏡下呈紫色或藍(lán)色)純菌種86株。其中球菌52株，桿菌34株。生化實(shí)驗(yàn)結(jié)合16s rDNA比對(duì)確定52株乳酸菌菌株，歸屬于5個(gè)菌屬，分別是嗜熱乳酸鏈球菌屬(33株)、糞腸球菌屬(6株)、干酪乳桿菌(5株)，嗜酸乳桿菌(4株)、側(cè)孢短芽孢桿菌屬(4株)。系統(tǒng)發(fā)育樹及屬種分類單元統(tǒng)計(jì)如圖1、表3。

圖1 52株乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹

Figure 1 Phylogenetic tree of 52 strains lactic acid bacteria

表3 屬種分類單元統(tǒng)計(jì)表

Table 3 A statistical relation between species

2.3 乳酸菌菌株生理實(shí)驗(yàn)

所有的菌株在8個(gè)溫度梯度中均有菌落生長(zhǎng)，以35 ℃生長(zhǎng)最好，有6株糞腸球菌菌株于45 ℃生長(zhǎng)較其他菌株好；pH實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)為低濃度的4個(gè)梯度有菌落生長(zhǎng)，后2個(gè)梯度無(wú)菌落生長(zhǎng)，又以pH=6和7兩個(gè)值的平板菌落生長(zhǎng)數(shù)目最多；耐鹽試驗(yàn)中，NaCl濃度為0、2%、4%、6%的固體培養(yǎng)基上有菌落生長(zhǎng)，濃度越大菌落數(shù)越少，NaCl濃度為8%、10%、15%時(shí)無(wú)菌落生長(zhǎng)。

2.4 產(chǎn)EPS含量及菌株

對(duì)52株乳酸菌產(chǎn)EPS性狀分析，發(fā)現(xiàn)31株產(chǎn)EPS。地區(qū)—含量“方差分析”結(jié)果見(jiàn)表4。

地區(qū)NEPS含量(mg/L)果洛州917.27±6.99玉樹州715.90±3.82黃南州616.25±5.99海北州914.97±4.86F0.26 P0.86

31株所產(chǎn)EPS含量為(16.09±5.39)mg/L，產(chǎn)量最高的為果洛州的嗜熱鏈球菌(28.83mg/L)。對(duì)地區(qū)—EPS含量行方差分析，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，P=0.86，表明不同地區(qū)產(chǎn)EPS含量無(wú)差異。

不同種屬產(chǎn)EPS檢出情況采用“行×列表卡方檢驗(yàn)”中的Fisher′s Exact 法，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同菌株產(chǎn)EPS檢出及含量情況

Table 5 Detection and EPS content in different strains

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，P<0.01，表明乳酸菌不同屬之間產(chǎn)EPS上存在差異，即五個(gè)屬中至少有兩個(gè)以上菌種在產(chǎn)生EPS問(wèn)題上有差異，進(jìn)一步對(duì)產(chǎn)EPS菌株進(jìn)行種屬—EPS含量分析結(jié)果見(jiàn)表6。

乳酸菌種屬NEPS含量(mg/L)嗜熱鏈球菌2216.81±5.79糞腸球菌616.27±2.44嗜酸乳桿菌310.47±3.97合計(jì)3116.09±5.39

31株乳酸菌產(chǎn)EPS濃度為16.09±5.39 mg/L，22株嗜熱鏈球菌為16.81±5.79 mg/L，糞腸球菌為16.27±2.44 mg/L，嗜酸乳桿菌為10.47±3.97 mg/L，其中側(cè)芽孢乳桿菌和干酪乳桿菌透析液未檢出EPS。

2.5 抑菌試驗(yàn)結(jié)果

所有的以3號(hào)試管內(nèi)上清液行瓊脂擴(kuò)散法抑菌試驗(yàn)的培養(yǎng)基上均出現(xiàn)了抑菌圈，且抑菌圈直徑大于1號(hào)管(排除強(qiáng)酸的抑菌作用，存在H2O2影響)、2號(hào)管(無(wú)強(qiáng)酸、無(wú)H2O2影響)，2號(hào)管的抑菌直徑最小，部分培養(yǎng)基上無(wú)抑菌圈。該現(xiàn)象的差異表明，青海牧區(qū)乳酸菌的可產(chǎn)生酸類抑菌物質(zhì)和H2O2。對(duì)(3號(hào)管-2號(hào)管)抑菌直徑進(jìn)行方差分析結(jié)果見(jiàn)表7。

病原菌N抑菌直徑(mm)大腸桿菌465.35±1.95金黃色葡萄球菌323.01±1.23*李斯特菌383.06±1.18*志賀菌414.48±1.96#&F18.84 P<0.01

*：與大腸桿菌比較，P<0.05；#：與金黃色葡萄球菌比較，P<0.05；&：與李斯特菌比較P<0.05.

52株乳酸菌菌株對(duì)四種致病菌的抑制數(shù)量上略有差異，46株對(duì)大腸桿菌、32株對(duì)金黃色葡萄球菌、38株對(duì)李斯特菌、41株對(duì)志賀菌產(chǎn)生抑制作用?？傮w上來(lái)說(shuō)，乳酸菌對(duì)四種常見(jiàn)致病菌的抑制能力普遍較弱，且對(duì)各病原菌的抑制作用(抑菌圈直徑大小)存在差異(F=18.84，P<0.01)。行SNK法分析，發(fā)現(xiàn)乳酸菌對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用與對(duì)李斯特菌的抑制作用無(wú)差異(P=0.90)，對(duì)大腸桿菌、志賀菌的抑制作用無(wú)差異(P=0.21)，對(duì)其余病原菌的受抑制作用之間存在差異，三組間的比較，均表現(xiàn)為P<0.01。分別對(duì)乳酸菌種屬、地區(qū)兩個(gè)因素對(duì)大腸桿菌的抑制作用進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表8～9。

地區(qū)N抑菌圈直徑(mm)果洛州155.80±1.47玉樹州106.68±2.16黃南州74.52±1.80#海北州144.35±1.77*#F4.16 P0.01

*：與果洛州比較，P<0.05；#：與玉樹州比較，P<0.05.

統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌的抑制作用存在地區(qū)差異(F=4.16，P=0.01)，行SNK兩兩比較，顯示海北州與果洛州、玉樹州與黃南州、玉樹州與海北州在抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)上存在差異(P<0.05)，其余各組間無(wú)差異。

菌種抑菌圈直徑(mm)嗜熱鏈球菌6.21±1.76糞腸球菌3.73±1.53*側(cè)芽胞乳桿菌4.83±0.51嗜酸乳桿菌4.53±1.81干酪乳桿菌3.18±0.85*F5.95P<0.01

*：與嗜熱鏈球菌比較，P<0.05.

統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌的抑制作用有乳酸菌種屬上的差異(F=5.95，P<0.01)，行SNK兩兩比較，顯示對(duì)大腸桿菌的抑制作用上，嗜熱鏈球菌與側(cè)芽胞乳桿菌、嗜酸乳桿菌無(wú)差異(P=0.17、P=0.09)，與糞腸球菌、干酪乳桿菌存在差異(P=0.02、P<0.01)；糞腸球菌與側(cè)芽胞乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌均無(wú)差異(P=0.15、P=0.58、P=0.49)，側(cè)芽胞乳桿菌與嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌無(wú)差異(P=0.82、P=0.17)，嗜酸乳桿菌與干酪乳桿菌抑菌作用無(wú)差異(P=0.26)。

2.6 乳酸菌抵抗模擬胃腸道環(huán)境生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

2.6.1 整體情況分析

52株菌株進(jìn)行模擬胃腸道生存實(shí)驗(yàn)，將生存率進(jìn)行SPSS秩和檢驗(yàn)，不同時(shí)間生存率存在差異，χ2=247.87，P<0.01，活率中位數(shù)(四分位數(shù)間距，%)：模擬胃液3 h為92.70(91.75，93.54)，腸液3 h為88.54(87.99，89.18)，腸液6 h中位數(shù)為84.36(83.21，86.28)，腸液12 h中位數(shù)為76.02(74.42，77.21)，腸液24 h中位數(shù)為65.43(64.32，66.94)，存活率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。

2.6.2 不同菌種間存活率比較

菌株間不同環(huán)境不同時(shí)間存活率秩和檢驗(yàn)分析結(jié)果見(jiàn)表10。

表10 不同菌株在不同環(huán)境不同時(shí)間存活率(%)

Table 10 Different strains survival rate in different times and different environment(%)

*：與嗜熱鏈球菌比較，P<0.05；#：與糞腸球菌比較，P<0.0；&：與側(cè)芽胞桿菌比較，P<0.05.

結(jié)果顯示，除了腸液3 h存活率不同菌種間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.22)外，其余各時(shí)間組不同菌株存活率均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。模擬胃液3 h存活率糞腸球菌與其余四種菌株均存在差異；模擬腸液6 h存活率嗜酸乳桿菌與糞腸球菌存在差異；模擬腸液12 h存活率糞腸球菌與嗜熱鏈球菌、側(cè)芽胞乳桿菌、嗜酸乳桿菌存在差異，干酪乳桿菌與側(cè)芽胞乳桿菌比較存在差異；模擬腸液24 h存活率嗜熱鏈球菌與糞腸球菌、側(cè)芽胞乳桿菌、干酪乳桿菌存在差異，嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌與糞腸球菌存在差異，側(cè)芽胞乳桿菌與干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌存在差異。

2.6.3 不同地區(qū)不同時(shí)間存活率比較

將存活率按地區(qū)分類，進(jìn)行秩和檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表11。

表11 不同地區(qū)乳酸菌存活率(%)

Table 11 Survival rate of lactobacillus in different areas(%)

*：與果洛州比較，P<0.05.

地區(qū)存活率上，胃液3 h、腸液3 h存活率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，認(rèn)為四個(gè)地區(qū)乳酸菌模擬胃液3 h、腸液3 h存活率基本相同，為同一個(gè)總體。腸液6、12、24 h在地區(qū)因素上存在差異(P<0.05)，具體存活率見(jiàn)表11，轉(zhuǎn)換秩次后行方差分析，發(fā)現(xiàn)在腸液6、12、24 h存活率上玉樹州與果洛州、黃南州與果洛州存在差異。

3 討論

本次實(shí)驗(yàn)從青海果洛州、玉樹州、黃南州及海西州四大牧區(qū)收集到傳統(tǒng)牦牛發(fā)酵乳制品57份，分離得到乳酸菌52株，主要優(yōu)勢(shì)菌株是嗜熱乳酸鏈球菌屬(63.46%)，其次為糞腸球菌屬(11.54%)，這與2013年雙杰[2]的研究結(jié)果一致，額外還分離到了干酪乳桿菌(5株)、嗜酸乳桿菌(4株)、側(cè)孢短芽孢桿菌屬(4株)。

溫度實(shí)驗(yàn)顯示，青海牧區(qū)乳酸菌10 ℃低溫有微弱生長(zhǎng)，這可能與青海牧區(qū)高海拔低溫環(huán)境有關(guān)，長(zhǎng)勢(shì)最好的是35 ℃，認(rèn)為該溫度是本次實(shí)驗(yàn)青海乳酸菌的最適生長(zhǎng)溫度，類同Betache等[3]的研究結(jié)果(牛乳中的優(yōu)勢(shì)微生物為中溫性乳酸菌)；熊素玉[4]、尚天翠[5]等研究發(fā)現(xiàn)，新疆伊犁乳酸菌最適生長(zhǎng)溫度在25 ℃～38 ℃之間，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果大致相同；由于實(shí)驗(yàn)中設(shè)定的相鄰兩個(gè)梯度跨度較大，未能準(zhǔn)確探究到乳酸菌的最適生長(zhǎng)溫度的確切值。pH結(jié)果符合乳酸菌最適生長(zhǎng)值為6.5～6.8；NaCl實(shí)驗(yàn)認(rèn)為青海乳酸菌是低鹽菌，非嗜鹽菌。

有些乳酸菌編碼相關(guān)酶及調(diào)節(jié)蛋白的基因大部分在質(zhì)粒上，如嗜酸乳球菌(Lactococcus lactis)等，嗜熱鏈球菌Sfi6(Stretococcus thermophilus Sfi6)的EPS 基因簇則位于染色體上，有15.25 kb，可編碼16個(gè)開(kāi)放閱讀框，其中，一個(gè)14.52 kb 的區(qū)域可編碼13個(gè)基因(從EPSA到EPSM)，這些基因決定了胞外多糖的合成[6-8]；Tian Z[9]等研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌合成胞外多糖的能力不穩(wěn)定，易受EPS 基因簇的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持該結(jié)論。EPS產(chǎn)量—地區(qū)無(wú)差異，認(rèn)為青海牧區(qū)乳酸菌產(chǎn)EPS含量為(16.09±5.39)mg/L，菌株間有差異，嗜熱鏈球菌產(chǎn)量最高，側(cè)芽胞乳桿菌與干酪乳桿菌未檢出。

抑菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)52株均有抑菌圈，加NaOH溶液處理后，部分菌株無(wú)抑菌圈，認(rèn)為菌株產(chǎn)生抑菌作用的物質(zhì)可能是某些弱酸性抑菌物質(zhì)如乙酸、有機(jī)酸和H2O2[10]。

乳酸菌可以影響動(dòng)物的免疫功能，增強(qiáng)自身免疫力，增加腸道粘膜對(duì)外界的抵抗力。體外模擬胃腸道環(huán)境監(jiān)測(cè)乳酸菌活菌數(shù)目，在一定程度上可以反映乳酸菌抵抗胃酸、腸液堿性及胃腸道酶類的消化程度，但由于缺乏腸道內(nèi)的正常菌群的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用或協(xié)同性增長(zhǎng)作用，以及缺乏正常菌群的代謝產(chǎn)物的影響，該實(shí)驗(yàn)只能反映其抵抗胃腸道酸堿性環(huán)境和酶類的消化情況，后期參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和相應(yīng)的參考文獻(xiàn)，添加胃腸道正常菌群，可以更加實(shí)際地反映胃腸道環(huán)境，亦或者進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，可探究青海乳酸菌對(duì)腸道功能及免疫等益生功能的影響。

綜上所述，青海傳統(tǒng)牦牛乳制品中主要的優(yōu)勢(shì)乳酸菌為嗜熱鏈球菌，其次為糞腸球菌和干酪乳桿菌；青海牧區(qū)傳統(tǒng)牦牛發(fā)酵乳中乳酸菌產(chǎn)EPS產(chǎn)量相對(duì)較低；乳酸菌對(duì)四種腸道病原菌的抑制作用較弱，其中對(duì)大腸桿菌抑制作用最強(qiáng)；乳酸菌抵抗胃酸生長(zhǎng)能力較強(qiáng)；在不同胃腸道生長(zhǎng)環(huán)境(模擬)中乳酸菌存活率存在差異；不同菌株間存活率不完全相同。

[1]中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與食品安全所.GB/T 4789.2-2010食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

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The separation，identification and characteristics of Lactic acid bacteria which produce EPS in home-made yak dairy from part of the pastoral areas in Qinghai

Tang Chaoqun，Yong Sheng，Zhu Derui，Liu Jing， Shuang Jie*

(Qinghai UniversityMedical college)

Objective To separate Lactic acid bacteria which produce EPS in homemade yak milk(yogurt，pull)from the Qinghai pastoral herdsmen，get the phylogenetic tree of EPS Lactic acid bacteria in Qinghai region，identified high levels of produce EPS Lactic acid bacteria；To provide theoretical basis for development and application of EPS Lactic acid bacteria in dairy industry.Methods 57 samplesfor Lactic acid bacteria were separated using CaCO3 MRS culture medium with flat test and the form in combination with biochemical experiment，as well as molecular biology method like the sequence of 16s rDNA，compared with BLAST in the NCBI database，built the phylogenetic tree，and determined Lactic acid bacteria species in the end；The Phenol-Sulfuric acid method was used for all of the Lactic acid bacteria for Quantitatively analyzing the production of polysaccharide；Agardiffusion method was used to observe the bacteriagrowth inhibitionsituation；Simulated the stomach and intestinal environment to complete the growth experiments in vitro.Results 86 pure strainsisolatedfrom 57 samples，the biochemical tests combined with the analysis of the 16 s DNA to determine 52 strain of Lactic acid bacteria which belongs to five species.Including the Streptococcus thermophilus(33 strains)，Enterococcus faecalis(6 strains)，Brevibacillus laterosporus(4 strains)，Lactobacillus casei(5 strains)and Lactobacillus acidophilus(4 strains).31 of 52 strains can produce EPS.The most EPS producing bacteria is the Streptococcus thermophilus isolated at Guoluo prefecture，the concentration of EPS is(16.09±5.39)mg/L，the maximum concentration is 28.83mg/L，Bacteriostatic test found that all of 52 strains of Lactic acid bacteria showed inhibition for four kinds of pathogenic bacteria.Some strains of bacteria without bacteriostatic ring after eliminated the interference of strong acid and H2O2.Allthe strains showed weaker growth inhibition ability for the pathogenic bacteria.There are differences between the different survival time in the simulated gastrointestinal survival experiment，χ2=247.87(Rank Value=chi-square test Value，P<0.01).The median(Quartiles，%)of survival rate grown in simulated gastric liquid for 3h was 92.70(91.75，93.54)：grown in simulated intestine liquid for 3h was 88.54(87.99，89.18)；grown in simulated intestine liquid for 6h was 84.36(83.21，86.28；grown in simulated intestine liquid for 12h was 76.02(74.42，77.21 and grown in simulated intestine liquid for 24h is 65.43(64.32，66.94).The survival rate decreased with the increase of time.Conclusion Main advantage of lactic acid bacteria in Qinghai yak traditional fermented milk is containedabundant streptococcus thermophilic，followed by Enterococcus faecalis and Lactobacillus casei；the EPS is relatively low in Lactic acid bacteria in traditional fermented yak milk from pastoral areas in Qinghai.The bacteria static effect of Lactic acid bacteria in thefour kinds of pathogenic bacteria is generallyweak but they show the strongest inhibitory effect on E.Coli.Lactic acid bacteria shows strong ability to resist acid during the growth and survival rate in the simulated intestinal liquid decreases with the increase of time.Survival rates between different strains are not exactly the same.

Qinghai Yak Dairy production EPS Lactic acid bacteria Feature

R378.2

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.01.003

2015-06-12

唐超群(1990～)，女，漢族，湖南籍，2013級(jí)科學(xué)班研究生.*：通訊作者，副教授，976537915@qq.com