沈國雙，鄭方超，趙久達(dá)

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院，西寧 810001)

青海地區(qū)回族胃癌患者PLCE1 rs3765524基因多態(tài)性研究*

沈國雙，鄭方超，趙久達(dá)※

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院，西寧 810001)

目的 探討青海地區(qū)回族胃癌患者PLCE1 rs3765524基因多態(tài)性。方法 采用1：1匹配病例對(duì)照研究。選取78例青海大學(xué)附屬醫(yī)院胃癌住院病例為病例組，按年齡、性別、民族匹配正常對(duì)照組。利用TanMan_MGB探針法對(duì)78例病例和78例對(duì)照進(jìn)行PLCE1基因 rs3765524位點(diǎn)基因型檢測(cè)，比較、分析病例組和正常對(duì)照組間的該位點(diǎn)基因型頻率的分布差異。結(jié)果 PLCE1基因rs3765524位點(diǎn)基因型的分布頻率在病例組和正常對(duì)照組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.207，P=0.075)。結(jié)論 PLCE1基因rs3765524位點(diǎn)C>T的多態(tài)性改變與青海地區(qū)回族人群胃癌患病易感性之間無關(guān)聯(lián)。

胃癌 回族 PLCE1 基因單核苷酸多態(tài)性

第三次全國全死因調(diào)查結(jié)果顯示，青海省胃癌發(fā)病率高居全國第二位，尤其是藏族和回族人群胃癌發(fā)病率較高[1-2]。本研究擬對(duì)該地區(qū)特定民族胃癌高發(fā)的原因及發(fā)病機(jī)制進(jìn)行相關(guān)研究。磷脂酶Cε1 (Phospholipase C epsilon-1， PLCE1)是近年來發(fā)現(xiàn)的磷酸酶C家族的一種同工酶、癌基因，位于人第10號(hào)染色體長臂2區(qū)3帶(10q23)，其能夠激活I(lǐng)P3/Ca2+、DG/PKC、EPK和MAPK等信號(hào)通路介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，參與細(xì)胞生長、分化、凋亡和血管生成等過程[3-4]。rs3765524定位于PLCE1基因第24個(gè)外顯子，其突變可導(dǎo)致第1 777位氨基酸編碼由蘇氨酸變?yōu)楫惲涟彼?ACC1777ATC)[5]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，PLCE1基因rs3765524位點(diǎn)C>T的多態(tài)性改變與人群胃癌和食管癌的發(fā)病易感性顯著相關(guān)[6-9]。此外，本研究團(tuán)隊(duì)早期發(fā)現(xiàn)青海地區(qū)漢、藏族人群胃癌患病易感性可能與PLCE1基因多態(tài)性有關(guān)[10]?？紤]到種族及區(qū)域因素對(duì)遺傳背景的影響，本研究利用1：1匹配病例對(duì)照研究，探索PLCE1基因rs3765524位點(diǎn)C>T的多態(tài)性改變是否可以增加青海地區(qū)回族人群胃癌的患病風(fēng)險(xiǎn)，以期為該地區(qū)回族人群胃癌早期診斷和靶向治療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選擇

從青海大學(xué)附屬醫(yī)院2010年10月至2011年10月間住院的胃癌患者中選取無血緣關(guān)系患者78例，年齡54.07±10.30歲，男性45(57.69%)例。所有胃癌患者要求世居青海，無與其他民族通婚情況，進(jìn)行R0切除術(shù)后經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)，且未進(jìn)行新輔助放射治療和抗腫瘤藥物治療。78例正常對(duì)照者，為同時(shí)期世居青海、無與其他民族通婚史、無腫瘤病史，且其他條件匹配的病例組1：1匹配。

研究方案經(jīng)青海大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者簽署知情同意書。由經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)的調(diào)查員，使用統(tǒng)一調(diào)查表對(duì)每個(gè)研究對(duì)象進(jìn)行面訪，調(diào)查內(nèi)容包括基本人口學(xué)資料及環(huán)境暴露史、H.pylori感染史及惡性腫瘤家族史等資料，并采集外周血5 mL。

1.2 PLCE1基因rs3765524位點(diǎn)基因分型

所有血樣標(biāo)本添加EDTA-K2抗凝，分裝后行程序降溫，最終置-80 ℃冰箱內(nèi)保存。采用全血DNA提取試劑盒(TianGen)按步驟提取，并純化全血基因組DNA。

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫報(bào)道人類PLCE基因DNA序列，利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)rs3765524位點(diǎn)PCR引物序列為：

上游5′CGTCTGTGTCGCAGGTATTCTC 3′，

下游5′GGGTTCGGGTTGGAAGAGTC 3′。

隨后在上?；瞪锛夹g(shù)有限公司訂購Taqman-MGB探針，Probe1：FAM-AAACTGACCCAGCACA-MGB，Probe2：HEX-AAACTGATCCAGCACAC-MGB。PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件：PCR反應(yīng)總體系為25 μL，含100 ng/mL DNA模板2 μL，10×緩沖液215 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，10 μmol/L引物1 μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.25 μL。反應(yīng)在溫度梯度PCR儀 (美國ABI公司)進(jìn)行，條件為：95 ℃變性 30 s，61 ℃退火40 s，72 ℃后延伸1 min，進(jìn)行36個(gè)循環(huán)。最后，取PCR產(chǎn)物2 μL進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。

根據(jù)7900HT定量PCR儀(美國ABI公司)終點(diǎn)讀板法基因分型操作流程，利用定制的TaqMan-MGB探針對(duì)PLCE1基因rs3765524位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。此外，由于DNA數(shù)量和質(zhì)量等原因，導(dǎo)致未能成功進(jìn)行分型的標(biāo)本則需重新進(jìn)行分型。所有標(biāo)本分型完成后，隨機(jī)抽取5%標(biāo)本進(jìn)行DNA測(cè)序驗(yàn)證。

1.3H.pylori感染狀況檢查

采用14C-尿素呼氣試驗(yàn)(14C-UBT)對(duì)上述研究樣本進(jìn)行幽門螺桿菌(Hp)感染檢查。14C-UBT使用無效放射性的穩(wěn)定同位素進(jìn)行檢測(cè)，具有較高的敏感度(>95%)和特異度(>95%)，適用于各個(gè)年齡段人群H.pylori感染的診斷和治療后的復(fù)查。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SAS 9.1.3軟件，采用χ2檢驗(yàn)方法或Fisher確切概率法，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料信息的比較分析

78例胃癌患者和78例正常對(duì)照按照年齡、性別和民族相同的條件進(jìn)行1：1匹配。與正常對(duì)照人群相比，青海地區(qū)回族胃癌患者的吸煙史陽性(15.38%vs.34.62% )、腫瘤家族史陽性( 24.36%vs.61.54%)和H.pylori感染史陽性(33.33%vs.55.13%)人群的比例均顯著性升高，提示家族遺傳因素和H.pylori感染因素可能是胃癌發(fā)病的危險(xiǎn)因子，詳見表1。

表1 病例組和正常對(duì)照組患者的一般信息(%)

Table 1 Comparison of general characteristics between cases and controls

2.2 PLCE1基因rs3765524位點(diǎn)基因型多態(tài)性分析

在78例正常對(duì)照人群中，PLCE1基因rs3765524位點(diǎn)CC、CT、和TT基因型分別占64.10%、34.61%和1.28%，T等位基因的頻率為0.19，且該位點(diǎn)T等位基因在正常對(duì)照中的分布符合Handy-Weinberg平衡(χ2=1.61，P=0.447)，提示對(duì)照組人群具有良好的代表性，詳見表2。此外，78例胃癌患者中CC、CT和TT的基因型頻率分別為50.00%、46.15%和3.85%，T等位基因的頻率為0.27，詳見表2。

表2 病例組和對(duì)照組中PLCE1基因rs3765524(C>T)位點(diǎn)基因頻率

Table 2 Distribution of genotypes of PLCE1 rs3765524(C>T)in cases and controls

2.3 PLCE1基因rs3765524位點(diǎn)基因型多態(tài)性與青海地區(qū)回族人群胃癌患病易感性的關(guān)系

PLCE1基因rs3765224位點(diǎn)基因型分布及其與青海地區(qū)回族人群胃癌患病易感性之間的關(guān)系詳見表2。如表所示，該位點(diǎn)基因型頻率在病例組和對(duì)照組之間的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.207，P=0.075)。

3 討論

遺傳變異可通過影響基因的表達(dá)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，進(jìn)而影響細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，改變細(xì)胞生命活動(dòng)，引起細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等行為，最終引發(fā)腫瘤或其他疾病的發(fā)生[5]。許多報(bào)道結(jié)果表明[6，7，10]，PLCE1基因突變與胃癌患病易感性密切相關(guān)，然而PLCE1基因rs3765524位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與胃癌之間關(guān)系的報(bào)道則相對(duì)較少。

本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，利用匹配病例對(duì)照設(shè)計(jì)，在青海省回族人群中探討PLCE1基因rs3765524位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與胃癌患病易感性之間的關(guān)系。結(jié)果證實(shí)，PLCE1基因rs3765524位點(diǎn)C>T的多態(tài)性改變并未顯著增加青海地區(qū)回族人群胃癌的患病風(fēng)險(xiǎn)。

PLCE1基因rs3765524位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與胃癌患病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)，最早由Abnet等[6]人在中國太行山脈地區(qū)上消化道腫瘤高發(fā)區(qū)開展的全基因關(guān)聯(lián)研究中發(fā)現(xiàn)，其對(duì)2 240名胃腺癌患者和3 302名共同正常對(duì)照者進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)rs3765524位點(diǎn)C>T的多態(tài)性突變可以使該地區(qū)人群胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加31%。隨后，Mou等[11]人在中國漢族人群中對(duì)200例胃癌患者和134名正常對(duì)照者的研究中進(jìn)一步證實(shí)了rs3765524位點(diǎn)C>T的多態(tài)性改變與胃癌患病易感性之間的關(guān)聯(lián)。此外，梁平等[5]通過對(duì)西北地區(qū)476例胃癌患者和481例健康人群的研究，再一次證實(shí)PLCE1基因rs3765524位點(diǎn)C>T的多態(tài)性改變與我國西北漢族人群胃癌易感性顯著相關(guān)。

但是，本研究的結(jié)果與上述者的研究結(jié)果不同，究其原因可能如下：(1)所有納入分析的78例胃癌患者均未進(jìn)行Lauren分型，繼而未進(jìn)行深入分析，研究顯示[12]Lauren分型可以反映腫瘤的生物學(xué)行為，特別是在彌漫性胃癌患者中，其一般不伴萎縮性胃炎和胃黏膜上皮化生，且與個(gè)體的遺傳易感性密切相關(guān)。(2)本研究未考慮胃癌發(fā)生的部位，一般認(rèn)為賁門癌和非賁門癌由于解剖位置的差異，導(dǎo)致其分子生物學(xué)特性也不同，提示胃癌的發(fā)生部位在胃癌的發(fā)生過程中起到重要作用。(3)本研究納入分析的樣本量較小，導(dǎo)致多因素分析時(shí)無法達(dá)到較高的檢驗(yàn)功效進(jìn)而掩蓋其真實(shí)的效應(yīng)。因此，擴(kuò)大樣本量，納入Lauren分型和胃癌發(fā)生部位信息，將有助于全面研究PLCE1基因rs3765524位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與胃癌患病易感性之間的關(guān)聯(lián)。

此外，需要注意的是，胃癌是一種與H.pylori感染史密切相關(guān)的腫瘤，且這種關(guān)聯(lián)在大量研究已經(jīng)得到確認(rèn)[13-14]。然而本研究中，納入研究的人群中H.pylori感染的檢出率為44.23%，遠(yuǎn)低于全國56.22%的平均檢出水平[15]，尤其是正常對(duì)照人群中，分析其原因可能與青海地區(qū)回族人群生活習(xí)慣以及納入研究病例數(shù)較少有關(guān)[16]。

綜上所述，本研究認(rèn)為，在青海地區(qū)回族人群中PLCE1基因rs3765524位點(diǎn)C>T的多態(tài)性改變與該地區(qū)回族人群胃癌患病易感性之間無顯著性關(guān)聯(lián)，提示該位點(diǎn)基因型的多態(tài)性可能不是改變?cè)摰貐^(qū)回族人群胃癌患病易感性的遺傳因子。

此外，由于不同地域人群生活環(huán)境和遺傳背景存在差異，且本研究存在樣本量小、未進(jìn)行Lauren分型和未考慮腫瘤發(fā)生部位等不足，因此本研究結(jié)論尚需大樣本研究確認(rèn)。

[1]周脈耕，王曉風(fēng)，胡建平，等.2004～2005年中國主要惡性腫瘤死亡的地理分布特點(diǎn)[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2010，44(4)：303～8.

[2]李康，旦增，王義，等.西藏高原地區(qū)世居藏族人群胃癌臨床流行病學(xué)研究[J].中華流行病學(xué)雜志，2008，29(11)：1165～6.

[3]崔曉賓，陳云昭，李鋒.磷脂酶Cε1基因與腫瘤關(guān)系研究進(jìn)展[J].中華病理學(xué)雜志，2012，41(3)：213～6.

[4]李曉岑，王秀梅.磷脂酶 Cε1與腫瘤相關(guān)性的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2015，(21)：3207～10.

[5]梁平.磷脂酶C～ε1基因單核苷酸多態(tài)性及基因表達(dá)與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性研究[D].第四軍醫(yī)大學(xué)，2014.

[6]ABNET C C，F(xiàn)REEDMAN N D，HU N，et al.A shared susceptibility locus in PLCE1 at 10q23 for gastric adenocarcinoma and esophageal squamous cell carcinoma[J].Nature genetics，2010，42(9)：764～7.

[7]利基林，馮雁，寧淑芳，等.磷脂酶C～ε1基因單核苷酸多態(tài)性及基因表達(dá)與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性探討[J].中國實(shí)用醫(yī)藥，2015，(30)：27～8.

[8]張尚書.PLCE1基因多態(tài)性與河南漢族人群食管鱗癌遺傳易感性的關(guān)聯(lián)[D]. 鄭州大學(xué)，2014.

[9]段富交.PLCE1基因多態(tài)性與中國中部人群食管鱗癌遺傳易感性[D].鄭州大學(xué)，2013.

[10]趙久達(dá)，耿排力，趙君慧，等.青海地區(qū)漢、藏族PLCE1rs2274223基因多態(tài)性與胃癌相關(guān)性[J].青海醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，35(1)：18～21.

[11]MOU X，LI T，WANG J，et al.Genetic variation of BCL2(rs2279115)，NEIL2(rs804270)，LTA(rs909253)，PSCA(rs2294008)and PLCE1(rs3765524，rs10509670)genes and their correlation to gastric cancer risk based on universal tagged arrays and Fe3O4 magnetic nanoparticles[J].Journal of biomedical nanotechnology，2015，11(11)：2057～66.

[12]LAUREN P.The Two Histological Main Types Of Gastric Carcinoma：Diffuse And So～Called Intestinal～Type Carcinoma.An Attempt at a Histo～Clinical Classification[J].Acta pathologica et microbiologica Scandinavica，1965，64：31～49.

[13]FORMAN D，WEBB P，PARSONNET J.H pylori and gastric cancer[J].The Lancet，1994，343(8891)：243～4.

[14]ISLAMI F，KAMANGAR F.Helicobacter pylori and esophageal cancer risk：a meta～analysis[J].Cancer prevention research，2008，1(5)：329～38.

[15]張萬岱，胡伏蓮，蕭樹東，等.中國自然人群幽門螺桿菌感染的流行病學(xué)調(diào)查[J].現(xiàn)代消化及介入診療，2010，15(5)：265～70.

[16]王凱娟，王潤田.中國幽門螺桿菌感染流行病學(xué)Meta分析[J].中華流行病學(xué)雜志，2003，24(6)：443～6.

Polymorphisms of PLCE1 rs3765524 among Hui patients with gastric cancer in Qinghai area

Shen Guoshuang，Zheng Fangchao，Zhao jiuda

(Department of Breast and Thyroid Surgery，Qinghai University Affiliated Hospital，Xining，Qinghai 810001)

Objective To explore the polymorphisms of PLCE1 rs3765524 among Hui patients with gastric cancer in Qinghai area.Methods 1：1 matched case-control study was conducted.78 patients with gastric cancer in Qinghai University Affiliated Hospital were recruited as case group，healthy controls were matched according to the same age，sex，and nationality.Genotypes of PLCE1 rs3765524 were detected using TapMan-MGB method among 78 gastric cancer cases and 78 matched healthy controls，then the difference in genotype frequencies of PLCE1 rs3765524 was analyzed between cases and controls.Results No significant difference in genotype frequencies of PLCE1 rs3765524 was observed between cases and controls，with P value being 0.207 or 0.075.Conclusions These findings suggest that the mutation from C to G of PLCE1 rs3765524 is not associated with Hui patients with gastric cancer in Qinghai area.

Gastric cancer Hui population PLCE1 Gene Polymorphism

*：青海省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2012-Z-739) 沈國雙(1976～)，男，土族，青海籍，碩士，副主任醫(yī)師

R394.3

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.01.006

2015-03-04

※：通訊作者，博士，Email_jiudazhao@126.com