王曉春,陶 靜,李鐵純

(1.鞍山師范學院 化學與生命科學學院，遼寧 鞍山 114016;2.國家地質(zhì)實驗測試中心，北京 100037)

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定農(nóng)田土壤中的六溴環(huán)十二烷和四溴雙酚A

王曉春1,2*,陶 靜1,李鐵純1

(1.鞍山師范學院 化學與生命科學學院，遼寧 鞍山 114016;2.國家地質(zhì)實驗測試中心，北京 100037)

建立了加速溶劑萃取/高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(ASE/HPLC-MS/MS)批量檢測農(nóng)田土壤中六溴環(huán)十二烷(HBCDs)和四溴雙酚A(TBBPA)殘留的分析方法。土壤樣品經(jīng)加速溶劑萃取，Sep-pak C18固相萃取柱凈化后，在多反應監(jiān)測(MRM)負離子電噴霧模式下進行HPLC-MS/MS分析。色譜柱為X Bridge C18反相柱(150 mm × 2.1 mm × 3.5 μm)，流動相為梯度變化的甲醇和水溶液。在最佳實驗條件下,六溴環(huán)十二烷和四溴雙酚A在0.50～200.0 μg/L范圍內(nèi)線性關系良好(r≥0.998)，方法檢出限(S/N≥3)為1.80～10.0 ng/kg。在1.0～40.0 μg/kg 添加水平內(nèi)，平均加標回收率為73.8%～106.9%，相對標準偏差(RSD)為5.8%～11.2%。采用該方法分析了我國某區(qū)域內(nèi)表層土壤樣品的HBCDs和TBBPA，得到理想的分析效果。

加速溶劑萃??；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)；農(nóng)田土壤；六溴環(huán)十二烷(HBCDs)；四溴雙酚A

六溴環(huán)十二烷(C12H18Br6，簡稱HBCDs)是一種高溴含量的脂環(huán)族添加型溴代阻燃劑，可按照一定比例添加在發(fā)泡聚苯乙烯、聚丙烯以及其它苯乙烯樹脂和不飽和聚酯樹脂中，在電器、針織物、粘合劑和涂料等領域應用較廣泛，具有用量低、阻燃效果好、對材料物理性能影響小等特點。在阻燃劑產(chǎn)品中，HBCDs的使用量僅次于十溴聯(lián)苯醚和四溴雙酚A(TBBPA)[1-3]。商品化的HBCDs 由3 種非對映異構體(α，β，γ-HBCD)組成，其中γ-HBCD在混合物中所占比例最大(約占78%)[4]。HBCDs在自然環(huán)境中相當穩(wěn)定，不易被降解，能夠在環(huán)境中長期積累、遷移和轉(zhuǎn)化，具有一定的慢性或亞毒性，可導致老鼠肝臟增重、甲狀腺增大等，已被列入“斯德哥爾摩公約”優(yōu)先控制POPs候補名單。隨著高效阻燃劑多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)在全球的禁用，HBCDs作為PBDEs的替代品，其造成的環(huán)境污染問題日益引起各國的關注。TBBPA是目前產(chǎn)量和使用量最大的溴阻燃劑[5]，主要應用于電子電氣產(chǎn)品、印刷線路板層壓板、樹脂和塑料生產(chǎn)中。在生產(chǎn)、使用及處置過程中會逐漸釋放到環(huán)境中，引發(fā)潛在毒害風險[6-8]，尤其是對水生生物具有毒性，低濃度TBBPA就具有內(nèi)分泌干擾和生殖等毒性作用效應[9-11]。

2016年3月，歐盟持久性有機污染物(POPs)法規(guī)(EC)No.850/2004進行修訂，將HBCDs正式加入附錄禁用物質(zhì)列表，即HBCDs含量超過100 mg/kg的物質(zhì)、混合物或物品禁止進入歐盟市場。湖北省食品安全地方標準(DBS 42/004-2014)中規(guī)定：動物性食品中六溴環(huán)十二烷異構體(α，β，γ-HBCD)和TBBPA的限量標準分別為0.102，0.032，0.058，0.103 ng/g。我國目前尚無關于土壤中HBCDs的限量標準。

因此，建立針對HBCDs和TBBPA的分析方法，監(jiān)控其在環(huán)境介質(zhì)中的變化情況顯得尤為重要。由于HBCDs在160 ℃以上會發(fā)生異構體重排，在240 ℃以上有脫溴降解現(xiàn)象,因此氣相色譜或氣相色譜-質(zhì)譜不適于分析HBCDs[12]。近年來，LC-MS/MS逐漸被用于HBCDs異構體的分離分析，如金軍等[13]利用超高效液相色譜-電噴霧離子源-串聯(lián)三重四極質(zhì)譜分析了土壤中的六溴環(huán)十二烷，α-HBCD的檢出限達20 pg/g。TBBPA雖可用氣相色譜或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進行分析，但需繁瑣的衍生化處理[14]，而LC-MS/MS分析方法由于穩(wěn)定性好、速度快和靈敏度高的特點被應用于TBBPA的檢測。

為實現(xiàn)HBCDs和TBBPA的同時分析，開發(fā)簡單快速的LC-MS/MS分析方法成為研究熱點之一。部分學者在此領域做了一定的工作，分析的對象包括土壤、水體和動物源食物[15-18]。其中，李芳等[15]建立了一種同時分析土壤中HBCDs和TBBPA的LC-MS/MS技術，方法靈敏度較高，TBBPA，α-HBCD，β-HBCD 和γ-HBCD 的檢出限分別為0.031 5，0.767，0.197，0.163 ng/g。該技術以索氏提取法提取了土壤樣品，耗時較長(16 h)，無法滿足批量土壤樣品的快速集成分析。為此，本文采用加速溶劑萃取技術對土壤樣品進行批量處理，液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)同時分析六溴環(huán)十二烷3種異構體和四溴雙酚A，方法無需衍生化處理，操作簡單、快速，適合大量樣品的快速集成分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

API4000高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(美國應用生物系統(tǒng)公司)；Dionex 200型加速溶劑萃取儀(美國戴安公司)；Metler Toledoal 204電子天平(瑞士梅特勒公司)；KL512/519J型氮吹儀(北京康林科技有限公司)。甲醇、乙腈、丙酮、正己烷(農(nóng)殘級，F(xiàn)isher Scientific公司)；實驗用水為Millipore高純水；Sep-pak C18固相萃取柱(3 cc/500 mg，Waters公司)。標準品：HBCDs的3種非對映異構體標準溶液α-HBCD，β-HBCD，γ-HBCD以及TBBPA標準溶液(質(zhì)量濃度為100 mg/L，溶于甲苯)購自美國Accustandard公司。

1.2 標準系列的配制

單標儲備液：分別準確量取100 mg/L的α-HBCD，β-HBCD，γ-HBCD和 TBBPA標準溶液適量，分別以甲醇稀釋，得到濃度為10 mg/L和1 mg/L的各物質(zhì)的單標儲備液。

混標儲備液：分別取濃度為10 mg/L的α-HBCD，β-HBCD，γ-HBCD和TBBPA單標儲備液100 μL，置于1 mL棕色瓶中，以甲醇稀釋至刻度，即得1 mg/L的混標儲備液。

標曲溶液：取適量的上述1 mg/L混標儲備液，向其中添加適量的甲醇，得濃度分別為0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100，200 μg/L的混標溶液，置于冰箱中冷藏保存，待測。

1.3 樣品制備

自然晾干的土壤樣品，經(jīng)土壤破碎機粉碎，過40目篩，四分法混勻。采用加速溶劑法萃取樣品中的目標化合物。準確稱取10 g混勻樣品，以正己烷和丙酮混合液(體積比3∶1)為溶劑，120 ℃萃取溫度,5 min預熱，10 min靜態(tài)時間，萃取壓力10.0 MPa，循環(huán)2次，吹掃90 s。提取液用氮氣濃縮后，以1 mL正己烷復溶，待凈化。

依次以二氯甲烷(2 mL)和甲醇(2 mL)對Sep-pak C18固相萃取柱進行活化和平衡。土壤樣品濃縮液上柱，樣品瓶中殘留濃縮液需用1 mL正己烷潤洗1次，合并上樣；棄去流出液后，用6 mL二氯甲烷進行洗脫，收集洗脫液于帶尾錐管的K-D瓶中。將K-D瓶中的洗脫液氮吹濃縮近干，加入2 mL甲醇，振蕩混勻后，過0.45 μm濾膜，待測。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

液相色譜條件：美國Waters公司X Bridge C18柱(2.1 mm × 150 mm × 3.5 μm)；柱溫30 ℃；進樣量5 μL。以甲醇(A)和水(B)為流動相進行線性梯度洗脫，流速300 μL/min。梯度洗脫條件：0～1.0 min，30%～90% A；1.0～5.0 min，90%A；5.0～5.5 min，90%～95%A；5.5～12.0 min，95%A；12.0～15.0 min，95%～30%A；15.0～20.0 min，95%～30%A。

質(zhì)譜條件：ESI電噴霧離子源，多反應監(jiān)測(MRM)；負離子掃描；離子噴射電壓為-4 500 V；霧化溫度400 ℃;GS1：65 psi;GS2：40 psi；Curtain Gas：35 psi；CAD：10 psi；各化合物的解簇電壓(DP)、入口電壓(EP)、碰撞能(CE)和碰撞室出口電壓(CXP)參數(shù)見表1。

表1 α-HBCD，β-HBCD，γ-HBCD和TBBPA的母離子、子離子及部分質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Precursor ions,product ions and some MS/MS parameters for α-HBCD,β-HBCD,γ-HBCD and TBBPA

2 結果與討論

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

與索氏提取、超聲提取和經(jīng)典的分液漏斗等成熟方法相比，加速溶劑萃取技術具有有機溶劑用量少、快速、基體影響小、萃取效率高、選擇性好和自動化程度高等優(yōu)點，尤其適用于土壤、底泥等復雜基質(zhì)固體樣品的前處理。為實現(xiàn)HBCDs與TBBPA的同時快速批量集成化分析，本實驗采用加速溶劑萃取技術提取土壤中的目標物。

在文獻[14]的基礎上，以正己烷-丙酮混合溶液(3∶1)為萃取溶劑，萃取壓力為10.0 MPa，預熱時間為5 min，吹掃90 s，循環(huán)2次，對HBCDs與TBBPA的萃取溫度和萃取時間進行優(yōu)化，測定3次，取平均值。發(fā)現(xiàn)當萃取溫度為90，120，150 ℃時，4種待測物(α-HBCD，β-HBCD，γ-HBCD,TBBPA)的平均回收率分別為75.7%～91.4%，83.3%～102.4%和78.9%～89.4%。因此，目標化合物的最佳ASE萃取溫度選擇為120 ℃。另外，還考察了不同萃取時間下(6，8，10，12，14 min)的回收率，發(fā)現(xiàn)萃取6 min 和8 min時，回收率較低，當萃取時間為10 min時，回收率達83.5%～99.4%。延長萃取時間至12 min 和14 min，對回收率并無明顯改善。考慮到實驗成本，選擇靜態(tài)萃取時間為10 min。

凈化程序上，分別考察了Oasis HLB，Supelclean LC-SCX 和Sep-pak C183種固相萃取柱的凈化效果，發(fā)現(xiàn)采用Sep-pak C18固相萃取柱凈化時，基線平穩(wěn)且雜質(zhì)少，效果較好。因此本實驗采用Sep-pak C18固相萃取柱凈化。

2.2 液相色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1 液相色譜條件的優(yōu)化 以實驗室現(xiàn)有的Luna C18柱(150 mm × 2.0 mm，3 μm)，X Bridge C18(2.1 mm × 150 mm，3.5 μm)和Symmetry C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)對α-HBCD，β-HBCD，γ-HBCD 和TBBPA進行分離，發(fā)現(xiàn)4種目標物在Luna C18柱上的相對保留時間較短，分離效果一般，峰形較差；以Symmetry C18進行分析時，目標化合物的保留時間過長，不適合批量樣品的快速集成測試；在X Bridge C18柱上，目標化合物均可實現(xiàn)基線分離，具有較好的分離效果，且分析速度快，符合批量快速測試的要求，因此最終選擇X Bridge C18柱對目標物進行分析。

實驗還考察了以甲醇-水、乙腈-水作流動相時的分離情況，發(fā)現(xiàn)以甲醇-水為流動相進行梯度洗脫的分離效果優(yōu)于乙腈-水為流動相進行梯度洗脫時的分離效果，且基線更穩(wěn)定。據(jù)文獻報道，流動相中添加1 mmol/L 醋酸銨能提高TBBPA的質(zhì)譜響應[19]，因此實驗也考察了甲醇-醋酸銨水溶液(1 mmol/L)作流動相時的效果，發(fā)現(xiàn)醋酸銨的加入會造成六溴環(huán)十二烷的質(zhì)譜響應大大降低。因此本實驗選擇甲醇-水作為流動相。

2.2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 通過針泵進樣技術確定各目標化合物定性和定量使用的母離子和子離子，形成離子對以MRM模式優(yōu)化與化合物本身性質(zhì)有關的質(zhì)譜參數(shù)(DP、EP、CE和CXP)。質(zhì)譜連接液相色譜后通過流動注射(FIA)模式優(yōu)化與流動相有關的質(zhì)譜參數(shù)(離子源GS1、GS2、Curtain Gas、碰撞氣、溫度、噴霧電壓)，優(yōu)化結果見表1。

2.3 線性關系與檢出限

在最佳LC-MS/MS條件下，測定不同濃度的混標溶液，不加權最小二乘法進行回歸運算，獲得標準工作曲線。4種化合物的線性范圍為0.50～200.0 μg/L，相關系數(shù)(r)均大于0.998。采用逐步稀釋法測定各物質(zhì)的檢出限。α-HBCD，β-HBCD，γ-HBCD 和TBBPA的檢出限(S/N≥3)分別為2.80，1.80，2.40，10.0 ng/kg，定量下限(S/N≥10)分別為9.40，6.00，8.00，33.4 ng/kg(見表2)。圖1為4種化合物標準溶液(10 μg/L)的HPLC-MRM譜圖。

表2 目標化合物的保留時間、回歸方程、線性范圍及檢出限Table 2 Retention times,linear equations,linear ranges and LODs of α-HBCD,β-HBCD,γ-HBCD and TBBPA

*Yrepresents concentration of compound(μg/L),Xrepresents peak area

2.4 回收率與精密度

選擇經(jīng)400 ℃下灼燒后的土壤樣品進行LC-MS/MS分析，確認無目標化合物后將其作為空白樣品使用。取上述空白土壤樣品10 g，分別向其中添加高、中、低3個水平的混標溶液，得到濃度分別為1.0，10.0，40.0 μg/kg的加標樣品。按照實驗方法對樣品進行處理和測定，每個濃度水平重復測定6次，結果見表3。

結果顯示：在1.0～40.0 μg/kg 添加水平內(nèi)，α-HBCD，β-HBCD，γ-HBCD 和TBBPA的平均加標回收率為73.8%～106.9%，相對標準偏差(RSD)為5.8%～11.2%。方法具有較好的回收率與精密度，滿足檢測要求。

表3 加標回收率和精密度(n=6)Table 3 Recoveries and precisions of the method(n=6)

2.5 實際樣品分析

為考察所建立方法在環(huán)境樣品分析中的實用性，采用該方法分析了江蘇省常熟市區(qū)域內(nèi)的3個表層土壤樣品。圖2給出了實際樣品的HPLC-MRM譜圖。結果表明：α-HBCD,β-HBCD,γ-HBCD 和TBBPA均有檢出，其含量分別為9.5～83.6 μg/kg，12.3～78.7 μg/kg，6.8～95.7 μg/kg和16.8～69.6 μg/kg。

3 結 論

本文建立了一種能同時快速檢測HBCDs 3種異構體和TBBPA的高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。目前，我國尚未發(fā)布土壤中HBCDs和TBBPA的含量限量國家標準。湖北省食品安全地方標準《動物性食品中六溴環(huán)十二烷和四溴雙酚A的測定(DBS42/004-2014)》中規(guī)定α，β,γ-HBCD和TBBPA的限量標準分別為0.102，0.032，0.058，0.103 ng/g(以脂肪計)。本方法的檢出限為1.80～10.0 ng/kg，低于該地方限量標準，且略優(yōu)于文獻[15]的檢出限(31.5～767 ng/kg)，因此完全滿足實際樣品測定的需求。方法能有效地消除土壤樣本中復雜基質(zhì)的干擾，保證分析檢測的準確性，且靈敏度高，簡便快速，可以滿足實際樣品批量測試的需要。

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Determination of Hexabromocyclododecanes and Tetrabromobisphenol A in Farmland Soils by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WANG Xiao-chun1,2*,TAO Jing1,LI Tie-chun1

(1.Department of Chemistry and Life Science,Anshan Normal College,Anshan 114016,China;2.National Research Center for Geoanalysis,Beijing 100037,China)

A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric method(HPLC-MS/MS) was developed for the simultaneous determination of hexabromocyclododecanes(HBCDs) and tetrabromobisphenol A(TBBPA) in farmland soils.Samples were extracted by accelerated solvent extraction(ASE) and purified with Sep-pak C18solid phase extraction(SPE) cartridges.The targeted compounds were separated on an X Bridge C18(150 mm × 2.1 mm × 3.5 μm) using methanol-water as mobile phases,and then analyzed by HPLC-MS/MS in multiple reaction monitoring(MRM) mode with negtive electrospray ionization.The target compounds had good linear relationships(r≥ 0.998) in the range of 0.50-200.0 μg/L.The limits of detection(S/N≥ 3) were in the range of 1.80-10.0 ng/kg,and the average recoveries at spiked levels of 1.0- 40.0 μg/kg ranged from 73.8% to 106.9%with RSDs of 5.8%-11.2%.The method was successfully applied in the detection of HBCDs and TBBPA residues in practical farmland soils.

accelerated solvent extraction(ASE)；high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS);farmland soil;hexabromocyclododecanes(HBCDs);tetrabromobisphenol A(TBBPA)

2016-05-09；

2016-07-19

國家自然科學基金資助項目(41430641，41140032)；中國地質(zhì)局地質(zhì)調(diào)查工作項目(1212351211006)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.11.012

O657.63;TQ314.248

A

1004-4957(2016)11-1440-05

*通訊作者：王曉春，博士，副研究員,研究方向：環(huán)境分析化學，Tel:0412-2960058，E-mail:wangwxc@iccas.ac.cn