厚樸麻黃湯對(duì)哮喘大鼠氣道炎癥的影響

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厚樸麻黃湯對(duì)哮喘大鼠氣道炎癥的影響

張川林陳志斌李希王春娥王斌燦
福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院350000福州市五四路282號(hào)

摘要目的：觀察厚樸麻黃湯對(duì)哮喘大鼠氣道炎癥及肺部組織形態(tài)學(xué)的影響，探討其作用機(jī)制。方法：SD大鼠60只隨機(jī)分成正常對(duì)照組、哮喘模型組、厚樸麻黃湯組和地塞米松組，除正常對(duì)照組外，其余各組均采用卵蛋白誘導(dǎo)大鼠建立遲發(fā)性哮喘反應(yīng)模型。左肺肺泡灌洗行細(xì)胞計(jì)數(shù)，放射免疫法和硝酸還原酶法測定肺泡灌洗液（BALF）中ET-1和NO含量；右肺組織進(jìn)行HE染色，觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果：哮喘模型組肺泡灌洗液中的細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)均較正常對(duì)照組明顯增加，而厚樸麻黃湯組和地塞米松組均較哮喘模型組明顯下降（均P<0.05）；與正常對(duì)照組比較，哮喘模型組NO、ET-1水平顯著升高（P< 0.01）；與哮喘模型組比較，厚樸麻黃湯組和地塞米松組NO、ET-1水平都顯著降低（P<0.01），但厚樸麻黃湯組和地塞米松組間NO、ET-1水平比較無顯著性差異（P>0.05）。結(jié)論：厚樸麻黃湯能明顯減輕氣道炎癥，此可能為其治療支氣管哮喘的藥效機(jī)制。

關(guān)鍵詞厚樸麻黃湯；哮喘；氣道炎癥；實(shí)驗(yàn)研究

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞(如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等)和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾?。?］，屬中醫(yī)學(xué)“哮病”范疇。臨床研究表明厚樸麻黃湯對(duì)哮病患者具有較好的療效，能明顯改善患者咳嗽、咳痰、氣喘癥狀。但目前有關(guān)其作用機(jī)制研究較少，為此本文建立哮喘大鼠模型，研究厚樸麻黃湯對(duì)哮喘大鼠氣道炎癥NO、ET-1及肺組織形態(tài)學(xué)的影響，探討厚樸麻黃湯對(duì)哮喘干預(yù)治療的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1動(dòng)物健康SPF級(jí)SD大鼠60只，6周齡，體重180～200 g，雌雄兼用，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005。

1.2試藥厚樸麻黃湯：厚樸15 g，麻黃12 g，生石膏30 g，杏仁9 g，半夏9 g，干姜6 g，細(xì)辛6 g，小麥30 g，五味子6 g。生藥材購買于福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院。先加1 000 ml水將小麥煮熟，去渣留湯，加諸藥武火煮至沸騰（15 min），再文火煎煮1.5 h。煎煮2遍，2次取汁混合，放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)得到濃縮液，含生藥1.2 g/ml。地塞米松（福州海王福藥制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H35020461，規(guī)格：5 mg/ml）；OVA（Sigma公司，批號(hào)：1001988502A5378-10G）。

1.3試劑NO試劑盒（南京建成生物工程研究所）；ET-1放射免疫試劑盒（北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司）。

2　方　法

2.1動(dòng)物分組及哮喘模型建立［2］

將大鼠隨機(jī)分成4組：正常對(duì)照組、哮喘模型組、厚樸麻黃湯組和地塞米松組，每組15只。除正常對(duì)照組外，其余各組均采用卵蛋白誘導(dǎo)大鼠建立遲發(fā)性哮喘反應(yīng)模型。即第1天和第8天腹腔內(nèi)注射抗原混懸液（每毫升含10 mg卵蛋白、100 mg氫氧化鋁）致敏。第15天起，將大鼠置于密閉玻璃容器內(nèi)，超聲霧化吸入1%卵蛋白溶液激發(fā)哮喘，每天1次，每次20 min，共霧化2周。地塞米松組每次激發(fā)前1 h以地塞米松0.5 mg/kg腹腔內(nèi)注射；正常對(duì)照組用生理鹽水腹腔內(nèi)注射和超聲霧化吸入；哮喘模型組灌服生理鹽水10 ml/kg；厚樸麻黃湯組每天按12 mg/kg灌服厚樸麻黃湯，灌胃容量為10 ml/kg。各組灌服時(shí)間均為30 d。造模及用藥過程觀察動(dòng)物的一般狀況，如精神狀態(tài)、呼吸、飲食、大小便等情況。

2.2支氣管肺泡灌洗液（BALF）的收集處理最后1次激發(fā)24 h后，以10%戊巴比妥液30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，下腔靜脈放血致死。氣管插管，行左肺肺泡灌洗術(shù)，用生理鹽水5 ml注入大鼠左側(cè)氣管肺組織內(nèi)，反復(fù)抽吸3次，回收率達(dá)80%以上，1 500 r/min離心15 min，計(jì)細(xì)胞數(shù)后行瑞氏-姬姆薩法染色，在400倍顯微鏡下，至少數(shù)200個(gè)細(xì)胞，行細(xì)胞分類。

2.3肺組織病理學(xué)檢查取大鼠右肺部組織放入10%的福爾馬林液中固定24 h后，經(jīng)80%、90%、100%乙醇及正丁醇脫水后，置于60℃蠟盒內(nèi)，包埋后切片，進(jìn)行HE染色，封片后在奧林巴斯顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化。

2.4肺組織切片HE染色肺組織蠟塊做厚度為5 μm的連續(xù)冠狀切片，經(jīng)過脫蠟、入水等操作后，置蘇木精水溶液中染色3 min，入酸水及氨水中分色；流水沖洗后入蒸餾水片刻，分別置70%及90%乙醇溶液中各10 min進(jìn)行脫水；最后加入酒精伊紅溶液染色3 min，染色后的切片再經(jīng)低濃度至高濃度乙醇溶液脫水及二甲苯透明處理；切片滴上中性樹膠，蓋上蓋玻片封固。

2.5生化檢查NO檢測采用硝酸還原酶法測定，利用硝酸還原酶特異性將NO3-還原成NO2-，通過顯色深淺測定其濃度的高低。ET-1檢測采用ELISA法分析測定，按說明書要求操作。

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)　果

3.1癥狀觀察實(shí)驗(yàn)中哮喘模型組大鼠出現(xiàn)煩躁、不停抓撓頭面部、打噴嚏、呼吸加快、靜伏不動(dòng)，嚴(yán)重者伸頸、縮胸、呈喘息狀等典型哮喘激發(fā)癥狀［2］。厚樸麻黃湯組和地塞米松組在藥物干預(yù)后上述癥狀均有不同程度的減輕。

3.2大鼠BALF中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類哮喘模型組炎癥細(xì)胞較正常對(duì)照組明顯增多（P<0.05）；地塞米松組和厚樸麻黃湯組炎癥細(xì)胞均較哮喘模型組有所下降（P< 0.05）。結(jié)果見表1。

表1　各組大鼠BALF細(xì)胞總數(shù)和分類計(jì)數(shù)比較　?。ā纒）

表1　各組大鼠BALF細(xì)胞總數(shù)和分類計(jì)數(shù)比較　　（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，①P＜0.05；與哮喘模型組比較，②P＜0.05

淋巴細(xì)胞（×105/L）正常對(duì)照組　27.31±5.21　2.98±0.97　0.67±0.34　3.45±0.79哮喘模型組　131.75±8.37①　16.35±1.71①　41.37±4.39①　21.57±2.18①地塞米松組　61.31±6.53②　9.15±1.39②　7.23±1.16②　11.13±1.91②厚樸麻黃湯組　79.23±3.87②　11.63±1.87②　15.37±2.11②　14.38±2.10②組別　　細(xì)胞總數(shù)（×105/L）n　　劑量（mg/kg）15　　—15　　—15　0.5 15　12.0中性粒細(xì)胞（×105/L）嗜酸性粒細(xì)胞（×105/L）

3.3各組大鼠BLAF中NO、ET-1水平的比較與正常對(duì)照組比較，哮喘模型組大鼠BALF中NO、ET-1含量明顯升高（P<0.01）；與哮喘模型組比較，厚樸麻黃湯組可明顯降低模型大鼠BALF中NO、ET-1水平（P<0.01）；厚樸麻黃湯組NO、ET-1含量與地塞米松組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表2。

3.4肺組織HE染色結(jié)果見圖1。鏡下見正常對(duì)照組大鼠肺組織形態(tài)正常，無明顯炎癥反應(yīng)；哮喘模型組大鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤，以嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主；地塞米松組及厚樸麻黃湯組較哮喘模型組炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕。

表2　各組大鼠BLAF中NO、ET-1水平的比較　　（±s）

表2　各組大鼠BLAF中NO、ET-1水平的比較　?。ā纒）

注：與正常對(duì)照組比較，①P＜0.01；與哮喘模型組比較，②P＜0.01

組別　n正常對(duì)照組　15哮喘模型組　15地塞米松組　15劑量（mg/kg）　NO（μmol/L）　ET-1（pg/ml）——0.5 13.13±1.15 33.87±4.03①22.54±2.59②31.75±3.51 67.12±4.37①48.01±7.89②厚樸麻黃湯組　1512.0　25.51±3.16②　41.05±4.73②

4　討　論

氣道炎癥是所有類型哮喘的共同病理特征，是臨床癥狀和氣道高反應(yīng)性的基礎(chǔ)，存在于哮喘的所有時(shí)段。呼出氣NO可評(píng)估哮喘相關(guān)的氣道炎癥程度，NO含量越高，氣道炎癥越嚴(yán)重，吸入激素治療后NO含量可降低，目前臨床已把NO含量作為哮喘控制的指標(biāo)之一，并作為降級(jí)治療的參考依據(jù)［3］。ET-1是目前發(fā)現(xiàn)最早的支氣管收縮活性物質(zhì)。呼吸系統(tǒng)有廣泛的ET-1 和ET-1受體分布，對(duì)肺通氣功能和循環(huán)變化有重要調(diào)節(jié)作用［4］。ET-1含量升高可誘使前列環(huán)素、15-脂肪氧合酶及氧自由基等形成增加，損傷肺上皮細(xì)胞，使炎性細(xì)胞聚集，分泌多種炎性介質(zhì)而誘發(fā)加重哮喘［5］。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，支氣管哮喘屬“哮病”“伏飲”等范疇。哮病是由于宿邪伏肺，遇感引觸的一種發(fā)作性痰鳴氣喘疾患［6］?！疤碉嫹巍薄捌⒛I陽虛，腎不納氣”是本病的夙根，復(fù)感外邪是其發(fā)作的誘因，痰遇風(fēng)動(dòng)，痰隨氣升，肺氣郁閉，不得宣通為基本病機(jī)［7-8］。支氣管哮喘呈現(xiàn)慢性病程，反復(fù)發(fā)作，治療上較為困難，且長期應(yīng)用激素，副作用較大，臨床費(fèi)用較高，相比之下中醫(yī)中藥治療該病有優(yōu)勢。

本實(shí)驗(yàn)中所選方劑厚樸麻黃湯出自《金匱要略》，曰“咳而脈浮者，厚樸麻黃湯主之”。其病機(jī)為內(nèi)有痰飲，遇寒引觸，相互搏結(jié)，壅遏肺氣，肺氣不利，難以宣降而發(fā)為氣喘。若寒飲久郁或陽盛體質(zhì)，寒飲化熱，可見煩躁。厚樸麻黃湯以厚樸泄?jié)M下氣為君藥，麻黃、杏仁宣肺降逆，又以細(xì)辛、干姜、半夏溫化寒飲，石膏清解郁熱，五味子酸斂肺氣，小麥護(hù)胃安中，全方共奏散飲除熱、止咳平喘之功。

本研究發(fā)現(xiàn)哮喘模型組大鼠BALF中NO、ET-1水平顯著升高，提示哮喘氣道和肺組織內(nèi)NO、ET-1釋放增加。厚樸麻黃湯組可明顯降低哮喘模型大鼠BALF中NO、ET-1含量，與地塞米松組比較無顯著性差異（P>0.05）。提示厚樸麻黃湯可能是通過抑制肺泡灌洗液中NO、ET-1的合成和釋放，減少支氣管和肺組織中炎癥浸潤，從而減輕哮喘氣道炎癥，達(dá)到降低氣道高反應(yīng)性的效果。

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（2015-11-18收稿/編輯陳明偉）

·中藥方劑·

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1003-0719（2016）01-0066-03