劉 潔，景香香，楊炳昂，符少清，王東林，吳湯娜

（海南省人民醫(yī)院，海南 ?？?570311）

NF-κB反義RNA基因在超聲聯(lián)合微泡作用下對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠血清TNF-α、IL-1β水平的影響

劉 潔，景香香，楊炳昂，符少清，王東林，吳湯娜

（海南省人民醫(yī)院，海南 海口 570311）

目的：觀察NF-κB反義RNA基因在超聲聯(lián)合微泡作用下對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）大鼠血清TNF-α、IL-1β水平的影響，探討其對(duì)RA治療的可行性。材料與方法：采用層-層吸附法將NF-κB反義RNA基因和多聚賴氨酸（Polylysine，PLL）分層吸附在自制的脂質(zhì)超聲微泡造影劑上，制備成載（PLL+DNA+PLL+DNA）的微泡。60只正常清潔級(jí)Wister雌性大鼠，分為6組（其中B～F組為造模成功后的RA大鼠），每組10只（20個(gè)膝關(guān)節(jié)）。A組：正常對(duì)照組；B組：RA大鼠模型對(duì)照組；C組：?jiǎn)渭僋F-κB反義RNA基因組；D組：超聲+NF-κB反義RNA基因組；E組：微泡+NF-κB反義RNA基因組；F組：超聲+微泡+NF-κB反義RNA基因組。ELISA檢測(cè)比較各組大鼠血清中的細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β水平變化。結(jié)果：模型對(duì)照組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平明顯高于正常大鼠組（P＜0.01），單純基因組、超聲+基因組、微泡+基因組、超聲+微泡+基因組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平均低于模型對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01），單純基因組、超聲+基因組、微泡+基因組3組之間比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05），超聲+微泡+基因組與單純基因組、超聲+基因組、微泡+基因組比較有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)論：NF-κB反義RNA基因在超聲聯(lián)合微泡作用下對(duì)RA大鼠血清TNF-α、IL-1β水平有明顯的下調(diào)作用，有助于提高RA的治療效果。

關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕；白細(xì)胞介素1；腫瘤壞死因子α；超聲檢查，介入性

超聲擊破微泡造影劑介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的方法，具有安全、高效和靶向性好的優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)已經(jīng)在心臟、腦、角膜及腫瘤組織中得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)[1-3]。本研究旨在觀察該方法介導(dǎo)NF-κB反義RNA基因?qū)︻愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）大鼠動(dòng)物模型的治療可行性，并通過(guò)觀察RA大鼠血清中細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β水平變化評(píng)價(jià)其治療效果。

1 材料與方法

1.1 RA大鼠動(dòng)物模型制備

60只正常清潔級(jí) Wister雌性大鼠，體質(zhì)量258～279 g，平均（261.57±5.42）g。福氏完全佐劑按4 mg/mL加入滅活的卡介苗，4℃保存?zhèn)溆?。將Ⅱ型膠原溶解于0.01mol/L的乙酸中，使終濃度為4mg/mL，4℃攪拌過(guò)夜。將攪拌好的Ⅱ型膠原乙酸溶液按1∶1滴加至冷的福氏完全佐劑中，充分乳化。每只大鼠在左后足底、尾根部、背部分3點(diǎn)皮內(nèi)注射乳化液共0.25mL，7 d后用同樣方法加強(qiáng)注射1次。大鼠四肢足爪均嚴(yán)重腫脹、踝關(guān)節(jié)直徑增長(zhǎng)幅度≥2 mm為造模成功。

1.2 載基因微泡的制備

采用層-層吸附法將NF-κB反義RNA基因和多聚賴氨酸（Polylysine，PLL）分層吸附在自制的脂質(zhì)超聲微泡造影劑上，制備成載 （PLL+DNA+PLL+ DNA）的微泡（重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所饋贈(zèng)）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為6組，1組為正常大鼠，5組均為RA大鼠模型，每組10只（20個(gè)膝關(guān)節(jié)）。A組：正常對(duì)照組；B組：模型對(duì)照組；C組：?jiǎn)渭僋F-κB反義RNA基因組；D組：超聲+NF-κB反義RNA基因組；E組：微泡+NF-κB反義RNA基因組；F組：超聲+微泡+NF-κB反義RNA基因組。

1.4 基因轉(zhuǎn)染方法

C組：?jiǎn)渭兿虼笫箨P(guān)節(jié)腔內(nèi)注射10 μg NF-κB反義RNA基因和300 μL生理鹽水；D組：先將10 μg NF-κB反義RNA基因和300 μL生理鹽水注射入大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)，再采用超聲持續(xù)輻照10 min；E組：市售SonoVue（意大利Bracco公司）凍干粉一支，用5mL生理鹽水（0.9%NaCl）稀釋后，取300μL與10μg NF-κB反義RNA基因混合之后，4℃靜置30 min，注射入大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)；F組：稀釋后的SonoVue 300μL與10 μg NF-κB反義RNA基因混合，注射入大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)之后，再用超聲（Philips HDI 4000）持續(xù)輻照10min。超聲輻照條件已經(jīng)在以前的實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化，探頭頻率10MHz，機(jī)械指數(shù)（MI）1.3，深度2cm。所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程均保持儀器設(shè)置一致。

1.5 大鼠血清TNF-α及IL-1β水平檢測(cè)

各組大鼠在治療后30 d，股動(dòng)脈采血，提取分離上清，按照TNF-α和IL-1β檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明，采用ELISA方法檢測(cè)大鼠血清TNF-α、IL-1β的水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究數(shù)據(jù)處理使用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，本組數(shù)據(jù)資料經(jīng)檢驗(yàn)服從正態(tài)分布，組間比較采用方差分析（SNK法），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

大鼠RA動(dòng)物模型：每只大鼠在左后足底、尾根部、背部分3點(diǎn)皮內(nèi)注射乳化液，7 d后加強(qiáng)注射1次，14 d后大鼠四肢足爪均嚴(yán)重腫脹、踝關(guān)節(jié)直徑增長(zhǎng)幅度≥2 mm，并經(jīng)病理切片證實(shí)成功建立RA模型（圖1）。

各組大鼠血清TNF-α及IL-1β水平檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清TNF-α及IL-1β水平的比較（±s）

表1 各組大鼠血清TNF-α及IL-1β水平的比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，1：P＜0.01。與模型對(duì)照組比較，2：P＜0.05，3：P＜0.01。單純基因組、超聲+基因組、微泡+基因組3組之間比較，4：P＞0.05。超聲+微泡+基因組與單純基因組、超聲+基因組、微泡+基因組比較，5：P＜0.05。

組別 膝關(guān)節(jié)數(shù)（n） TNF-α（ng/L） IL-1β（ng/L）正常對(duì)照組 10 32.68±9.23 2.45±0.24模型對(duì)照組 10 90.12±16.14110.10±2.011單純基因組 10 72.12±10.272，47.57±1.482，4超聲+基因組 10 69.28±11.852，46.98±1.872，4微泡+基因組 10 70.64±15.292，48.10±1.292，4超聲+微泡+基因組 10 51.29±11.833，54.69±0.973，5

圖1 大鼠RA動(dòng)物模型。圖1a：正常大鼠關(guān)節(jié)，病理切片可見(jiàn)滑膜細(xì)胞基本呈單層整齊排列（HE）。圖1b：RA大鼠關(guān)節(jié)明顯腫脹，病理切片可見(jiàn)滑膜細(xì)胞明顯增生，排列紊亂，毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張充血（HE）。Figure 1.Rat model of RA.Figure 1a:Normal rat joints.The pathology slice shows that synovial cells are arranged regularly in a monolayer(HE).Figure 1b:Joints of RA rats are significantly swollen.Pathology slice shows significant proliferation and disorganization of synovial cells.Capillaries are significantly dilated and congested(HE).

3 討論

RA是關(guān)節(jié)疾病中最常見(jiàn)的一種以慢性炎癥、異常免疫反應(yīng)和滑液增多為特征的全身性自身免疫性疾病。到目前為止，RA的發(fā)病機(jī)制不十分清楚，因此尚無(wú)滿意的治療方法。國(guó)內(nèi)外研究表明，基因治療在RA疾病方面顯示出了較好的前景[4-6]。

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為RA的啟動(dòng)是通過(guò)提呈抗原給CD4+淋巴細(xì)胞，兩者相互作用從而激活了淋巴細(xì)胞。活化的淋巴細(xì)胞刺激單核-巨噬細(xì)胞釋放單核因子，特別是TNF-α和IL-1β。這些單核因子是主要的前炎癥細(xì)胞因子，對(duì)關(guān)節(jié)實(shí)質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞具有廣泛的作用，在形成RA炎癥、新生血管生成和骨質(zhì)破壞中起著重要的作用。RA病人血液和滑液中存在大量TNF-α，滑膜組織中巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞能表達(dá)抗原性TNF-α。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，小鼠轉(zhuǎn)入TNF-α基因，可持續(xù)表達(dá)TNF-α，自發(fā)產(chǎn)生類似RA的關(guān)節(jié)炎，抗TNF-αmAb能減輕TNF-α轉(zhuǎn)基因小鼠以及膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型小鼠的炎癥。在RA中，IL-1β是最強(qiáng)的骨吸收劑，尤其局部IL-1β的水平抑制軟骨修復(fù)的作用與TNF-α協(xié)同增強(qiáng)且較TNF-α更為重要；IL-1β可通過(guò)上調(diào)核因子NF-κB配基的受體激活劑活性，直接增強(qiáng)破骨細(xì)胞骨侵蝕吸收能力，導(dǎo)致骨的破壞，同時(shí)抑制Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的合成，抑制軟骨細(xì)胞的修復(fù)重建，最終引起關(guān)節(jié)軟骨、骨的損傷；IL-1β也可作用于成骨細(xì)胞，誘導(dǎo)NF-κB配基的受體激活劑的表達(dá)，它可刺激破骨細(xì)胞前體分化為成熟的破骨細(xì)胞，并進(jìn)一步使其活化，加速骨侵蝕。由此可見(jiàn)，TNF-α和IL-1β在RA的發(fā)生和進(jìn)展中起著決定性作用。

核轉(zhuǎn)錄因子是一類蛋白質(zhì)，具有和某些基因上啟動(dòng)子區(qū)的固定核苷酸序列結(jié)合而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的功能。自1986年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，許多以NF-κB為作用靶點(diǎn)治療或緩解疾病的研究已相繼報(bào)道。在這些研究中，NF-κB與RA的相關(guān)研究成為熱點(diǎn)之一，其已被證實(shí)在成人RA發(fā)病中起關(guān)鍵作用。在免疫介導(dǎo)的RA的炎癥、增生和骨侵蝕三大病理過(guò)程中，NF-κB都起著中心調(diào)節(jié)作用。以NF-κB為靶點(diǎn)，針對(duì)其信號(hào)通路中的各個(gè)環(huán)節(jié)抑制其活化，目前已成為抗炎、抗風(fēng)濕治療研究的熱點(diǎn)，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)選用反義RNA技術(shù)，人工合成NF-κB反義RNA基因質(zhì)粒，通過(guò)抑制滑膜組織中NF-κB的表達(dá)，以NF-κB為靶點(diǎn)，抑制RA的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中各個(gè)環(huán)節(jié)的活化，最終達(dá)到抑制或減輕RA疾病的目的。

近年來(lái)，超聲造影劑微泡作為一種新型的、安全的、高效的基因靶向載體，是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)課題。研究表明超聲照射本身就可以促進(jìn)基因在體外和體內(nèi)的轉(zhuǎn)染，而超聲通過(guò)擊破造影劑微泡，令進(jìn)入血液循環(huán)中的微泡在指定部位“爆破”，釋放所攜帶的基因，微泡爆破產(chǎn)生的振蕩可增加真核細(xì)胞的通透性，有利于DNA分子穿透，提高了基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)的效率[7]。近年來(lái)，體內(nèi)外試驗(yàn)均證明造影劑微泡在超聲作用下可增加外源基因轉(zhuǎn)染率和表達(dá)水平[8-10]。

我們也做了大量有關(guān)超聲微泡介導(dǎo)將空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織的研究，驗(yàn)證了超聲聯(lián)合微泡這種基因轉(zhuǎn)染方法在關(guān)節(jié)疾病中應(yīng)用的可行性，摸索了保證基因轉(zhuǎn)染成功的客觀條件[11-13]。在本研究中，我們應(yīng)用超聲微泡介導(dǎo)這種新型的基因轉(zhuǎn)染方法，以NF-κB反義RNA為靶基因，進(jìn)行RA的治療。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，造模后，RA大鼠血清TNF-α和IL-1β水平明顯升高（與正常對(duì)照組比較，P＜0.01），提示這兩種細(xì)胞因子在RA的病理過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。單純基因組、超聲+基因組、微泡+基因組、超聲+微泡+基因組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平均低于模型對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01），單純基因組、超聲+基因組、微泡+基因組3組之間比較無(wú)顯著性差異 （P＞0.05），超聲+微泡+基因組與單純基因組、超聲+基因組、微泡+基因組比較有顯著性差異 （P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，所有實(shí)驗(yàn)組均具有一定的治療作用，但是超聲+微泡+基因組的治療效果更顯著，提示超聲和微泡的聯(lián)合作用可以明顯提高基因的轉(zhuǎn)染效率，增強(qiáng)基因治療的療效。

[1]唐海林，王志剛，李巧，等.超聲輻照微泡促骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)大鼠急性腎損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華超聲影像學(xué)雜志：電子版，2015，12（8）：652-655.

[2]汪朝霞，王志剛，朱葉鋒，等.超聲聲學(xué)造影劑介導(dǎo)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因轉(zhuǎn)染的體外實(shí)驗(yàn)[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)影像技術(shù)，2009，25（6）：935-937.

[3]Southerland KW,Frazier SB,Bowles DE,et al.Gene therapy for the prevention of vein graft disease[J].Transl Res,2013,161(4): 321-338.

[4]Grimstein C,Choi YK,Wasserfall CH,et al.Alpha-1 antitrypsin protein and gene therapiesdecrease autoimmunity and delay arthritis development in mouse model[J].J Transl Med,2011,9 (1):21-23.

[5]Evans CH,Ghivizzani SC,Robbins PD.Getting arthritis gene therapy into the clinic[J].Nat Rev Rheumatol,2011,7(4):244-249.

[6]Shi Q,Zhang XL,Dai KR,et al.siRNA therapy for cancer and non-lethal diseases such as arthritis and osteoporosis[J].Expert Opin Biol Ther,2011,11(1):5-16.

[7]劉娟，吳鳳林.超聲激勵(lì)微泡“空化效應(yīng)”在腫瘤治療方面的研究進(jìn)展[J].重慶醫(yī)學(xué)，2014，43（3）：358-361.

[8]Suzuki R,Oda Y,Utoguchi N,et al.Progress in the development of ultrasound-mediated gene delivery systems utilizing nano-and microbubbles[J].J Control Release,2011,149(1):36-41.

[9]Mannell H,Pircher J,Fochle F,et al.Site directed vascular gene delivery in vivo by ultrasonic destruction ofmagnetic nanoparitcle coated microbubbles[J].Nanomedicine,2012,8(9): 1309-1318.

[10]盛娓娓，黃晶，周大燕，等.超聲微泡介導(dǎo)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因轉(zhuǎn)染鼠缺血心肌的實(shí)驗(yàn)研究 [J].中國(guó)超聲醫(yī)學(xué)雜志，2009，25（8）：725-727.

[11]景香香，劉潔，楊炳昂，等.超聲聯(lián)合造影劑對(duì)正常大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織的生物學(xué)作用[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)影像技術(shù)，2010，26（3）：120-122.

[12]景香香，劉潔，楊炳昂，等.超聲輻照聯(lián)合造影劑微泡介導(dǎo)EGFP轉(zhuǎn)染類風(fēng)濕關(guān)節(jié)滑膜的實(shí)驗(yàn)研究 [J].中華超聲影像學(xué)雜志，2013，22（10）：74-77.

[13]Jing XX,Liu J,Yang BA,et al.EGFP gene transfection into the synovial joint tissues of rats with rheumatoid arthritis by ultrasound-mediated microbubble destruction[J].Exp Ther Med, 2014,7(5):1396-1402.

The effects of NF-κB antisense RNA gene on the levels of serum TNF-α and IL-1β in rheumatoid arthritis rats by ultrasound-mediated microbubble destruction

LIU Jie,JING Xiang-xiang,YANG Bing-ang,FU Shao-qing,WANG Dong-lin,WU Tang-na
(Hainan Provincial People’s Hospital,Haikou 570311,China)

Objective:To investigate the effect of NF-κB antisense RNA gene delivery mediated by ultrasound-mediated microbubble destruction on serum levels of TNF-α,IL-1β in rheumatoid arthritis(RA)rats and its feasibility for RA therapy.Methods:The layer-by-layer assembly technique was applied to attach multiple layers of gene and polyllysine onto prepared lipid-coated microbubbles(PLL+DNA+PLL Apply+DNA).Sixty rats were divided into six groups(10 rats with 20 knees in each group).Group A:normal control group;group B:blank control group of RA rats;group C:NF-κB antisense RNA gene plasmid group;group D:ultrasound+NF-κB antisense RNA gene plasmid group;group E:microbubbles+NF-κB antisense RNA gene plasmid group;group F:ultrasound+microbubbles+NF-κB antisense RNA gene plasmid group.The serum levels of TNF-α,IL-1β in RA rats were detected with ELISA.Results:The levels of serum TNF-α and IL-1β were obviously higher than normal control group.Those of group C to F were notably lower than that of the RA control group(P＜0.05,P＜0.01).There was no statistical difference in the levels of serum TNF-α and IL-1β among group C,D and E.But there was statistics difference between group F and group C to E(P＞0.05).Conclusion:NF-κB antisense RNA gene transfection efficiency on RA rat’s joints synovial tissues can be enhanced by ultrasound-mediated microbubble destruction,which can down-regulate the levels of serum TNF-α and IL-1β,and enhance the therapeutic effect of RA.

Arthritis,rheumatoid;Interleukin-1;Tumor necrosis factor-alpha;Ultrasonography,interventional

R593.22；R445.1

A

1008-1062（2016）12-0896-03

2016-03-28；

2016-06-02

劉潔（1970-），男，山西孝義人，主治醫(yī)師。E-mail：383432303＠qq.com

景香香，海南省人民醫(yī)院超聲科，570311。E-mail：jingxiangxiang＠sohu.com

國(guó)家自然科學(xué)基金（30860270）；海南省自然科學(xué)基金（30854，813208）。