金鑰，崔進(jìn)，梅連瑞，李經(jīng)緯，閆師杰，劉祥，*（1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津300384；.國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，天津300308；3.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津300384；4.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津300384）

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HPLC同時(shí)測(cè)定豆制品中3種堿性橙染料

金鑰1，2，崔進(jìn)2，梅連瑞2，李經(jīng)緯2，閆師杰3，4，*，劉祥2，*
（1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津300384；2.國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，天津300308；3.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津300384；4.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津300384）

摘要：建立腐竹等固體豆制品中堿性橙2、堿性橙21和堿性橙22染料含量的高效液相色譜檢測(cè)方法。樣品經(jīng)無水乙醇提取，超聲波輔助萃取，離心合并上清液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至近干，定容液溶解殘?jiān)?，離心吸取上清液，過0.45 μm膜經(jīng)高效液相色譜分離、檢測(cè)。所用色譜柱為C(18)，檢測(cè)波長(zhǎng)堿性橙2為449 nm，堿性橙21、堿性橙22為485 nm；流動(dòng)相為甲醇-乙酸銨水溶液。本方法檢測(cè)限為0.02 mg/kg；定量限為0.08 mg/kg。腐竹樣品加標(biāo)回收率試驗(yàn)所得回收率為83.1 %～116.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.02%～9.65%（n=6），3種染料在0.1μg/mL～20μg/mL濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，線性回歸系數(shù)（r）均大于0.9999。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；豆制品；堿性橙2；堿性橙21；堿性橙22

堿性橙是一種偶氮類堿性工業(yè)染料，主要用于紡織品、皮革制品及木制品的染色，對(duì)人有致癌、致畸變等影響。根據(jù)《中華人民共和國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》及《中華人民共和國(guó)食品安全法》的相關(guān)規(guī)定，為禁止用作食品添加劑的化學(xué)制品，而由于堿性橙染料比其它水溶性染料如檸檬黃、日落黃等更易于在鮮海魚和豆制品上染色且不易褪色，因此一些不法商販為了增加食品的色澤光亮，以次充好，在鮮海魚、豆制品、腐竹等食品中使用堿性橙染色[1]，極大危害了消費(fèi)者的身心健康。為保護(hù)消費(fèi)者的健康，通過對(duì)此類食品進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，有效地保障了食品的市場(chǎng)安全。

堿性橙染料的種類主要有堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22 3種[2]。目前較多使用高效液相色譜法進(jìn)行分析檢測(cè)，但前處理相對(duì)繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)且浪費(fèi)溶劑[3-4]。本研究建立了通過無水乙醇提取，超聲波輔助萃取的前處理方法，冷凍離心去除脂類，省去了液液萃取去除脂類的步驟，利用HPLC同時(shí)檢測(cè)堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22的含量，取得了滿意的效果。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

Waters H-Class高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測(cè)器：Waters公司；ML204/02天平：Mettler-Toledo公司；FB15060超聲波清洗器、ST 16R低溫高速離心機(jī)：美國(guó)Thermo Fisher公司；RV 10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、A11分析研磨機(jī)、VORTEX圓周混合器：德國(guó)IKA公司。

超純水：Milli-Q Integral 10，法國(guó)Merck Millpore公司；甲醇：色譜純，美國(guó)Honeywell公司；堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22：均為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，德國(guó)Dr.公司。1.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制

儲(chǔ)備液的配制：分別準(zhǔn)確移取100 mg（精確至0.1 mg）堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22，置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，混勻，4℃條件下避光保存；中間液的配制：分別準(zhǔn)確移取1 mL堿性橙染料標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用定容液至刻度，混勻；工作液的配制：準(zhǔn)確移取適量中間液于10 mL容量瓶中，分別配制為濃度0.1、0.5、1、2、20μg/mL，用定容液至刻度，混勻備用。用流動(dòng)相作為定容液進(jìn)行定容。

1.3樣品處理方法

稱取5 g（精確到0.01 g）粉碎好的干腐竹[5]樣品于50 mL塑料離心管內(nèi)，加入2 g無水硫酸鈉[6]，10 mL無水乙醇超聲提取20 min，9 000 r/min，離心5 min，上層清夜置于另一離心管中，重復(fù)提取2次，合并提取液；再5 000 r/min，離心10 min；轉(zhuǎn)移上清液于圓底燒瓶中，在30℃，60 r/min減壓的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干；加入5 mL定容液，用超聲清洗儀溶解殘?jiān)黐7]，轉(zhuǎn)移至離心管，9000r/min，離心5min，吸取上清液，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，供高效液相色譜儀上機(jī)分析檢測(cè)。

1.4色譜分析條件

色譜柱：4.6 mm×150 mm，C18反相柱（5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：堿性橙2為449 nm；堿性橙21、堿性橙22為485 nm；流動(dòng)相：甲醇：水（含0.02 mol/L乙酸銨）為62∶ 38（體積比）；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10.0 μL。

2　結(jié)果與討論

2.1樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

分別考慮了無水乙醇、甲醇、乙腈對(duì)陽性樣品的萃取試驗(yàn)，結(jié)果3種有機(jī)試劑的提取效率差別不大，而考慮乙腈、甲醇毒性均比無水乙醇大，價(jià)格也相對(duì)比無水乙醇高，選擇無水乙醇作為提取劑；提取劑的用量比較了5、10、20 mL，結(jié)果為5 mL提取不充分，而20 mL浪費(fèi)提取劑且旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)慢，10 mL時(shí)提取充分且旋蒸快；對(duì)超聲萃取時(shí)間和提取次數(shù)綜合考慮，時(shí)間考慮了15、20、30 min，提取次數(shù)考慮了1、2、3次。結(jié)果顯示，無水乙醇超聲萃取20 min，提取2次，提取不但完全而且節(jié)約時(shí)間；而根據(jù)腐竹樣品中含有脂類，以往文獻(xiàn)均采用液液萃取的方法去除脂類，本文中定容液溶解殘?jiān)?，不?jīng)液液萃取，而是殘?jiān)D(zhuǎn)移至離心管中，用冷凍離心機(jī)進(jìn)行離心，去除樣品中脂類等雜質(zhì)，上清液過膜上機(jī)檢測(cè)。

2.2色譜分離條件的優(yōu)化

分別考慮了Waters symmetry C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）、Waters symmetry Shied RPC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）的色譜柱，結(jié)果為Waters symmetry C18（4.6 mm× 150 mm，5 μm）的分離效果好，各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間短、峰型好；檢測(cè)器方面對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了篩選，結(jié)果顯示堿性橙2的檢測(cè)波長(zhǎng)為449 nm；堿性橙21、堿性橙22的檢測(cè)波長(zhǎng)為485 nm；同時(shí)也比較了乙腈：水（含0.02 mol/L乙酸銨）、乙腈：水（含0.1 %甲酸）、甲醇：水（含0.02 mol/L乙酸銨）、甲醇：水（含0.1 %甲酸）不同流動(dòng)相體系[8]，綜合各種不同的流動(dòng)相和流動(dòng)相配比，發(fā)現(xiàn)甲醇：水（含0.02 mol/L乙酸銨）為62∶38（體積比）時(shí)，體系能夠更有效地分離，色譜峰形更優(yōu)，靈敏度更高，因此選用甲醇：水（含0.02 mol/L乙酸銨）為62∶38（體積比）作為流動(dòng)相。圖1、圖2為3種堿性橙染料的標(biāo)準(zhǔn)圖譜。

圖1堿性橙21、堿性橙22在485 nm下標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of basic orange 21 and basic orange 22 standards determined by UV detector at 485 nm

圖2堿性橙2在449 nm下標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of basic orange 2 standard determined by UV detector at 449 nm

2.3線性情況、定量限、檢出限、回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

用已經(jīng)配制好的標(biāo)準(zhǔn)工作液，各濃度分別進(jìn)樣10.0 μL，測(cè)定結(jié)果經(jīng)線性回歸，線性良好，結(jié)果如圖3、圖4、圖5。

圖3堿性橙2在線性范圍0.1 μg/mL～20 μg/mL的校正曲線Fig.3 Calibration curve of basic orange 2 in 0.1 μg/mL-20 μg/mL

圖4堿性橙21在線性范圍0.1 μg/mL～20 μg/mL的校正曲線Fig.4 Calibrationcurveofbasicorange21in0.1 μg/mL-20 μg/mL

圖5堿性橙22在線性范圍0.1 μg/mL～20 μg/mL的校正曲線Fig.5 Calibrationcurveofbasicorange22in0.1 μg/mL-20 μg/mL

用腐竹空白樣品作為基質(zhì)，添加不同量的堿性橙染料標(biāo)準(zhǔn)品后按“1. 2”處理后測(cè)定，確定各堿性橙染料的線性范圍、定量限（LOQ，S /N>10）、檢出限（LOD，S/N >3），見表1；不同添加量下的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，見表2；同時(shí)測(cè)定陰性樣品，得到空白樣品色譜圖，如圖6；添加水平1 mg/kg的樣品色譜圖，如圖7、8。

表1堿性橙染料的線性情況以及定量限、檢出限Table 1 Linear regression，correlation coefficient and the limit of detection and quantitation

表2堿性橙染料回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of test for recovery

圖6空白樣品色譜圖Fig.6 Chromatogram of blank sample

圖7堿性橙21、22添加1 mg/kg樣品色譜圖Fig.7 Chromatogram of basic orange 21 and 22 add 1 mg/kg

圖8堿性橙2添加1 mg/kg樣品色譜圖Fig.8 Chromatogram of basic orange 2 add 1 mg/kg

3　結(jié)論

建立了腐竹中禁用堿性橙染料的高效液相色譜檢測(cè)方法。用乙醇多次超聲萃取，用冷凍離心機(jī)去除脂類等雜質(zhì)，采用超聲法和冷凍離心機(jī)進(jìn)行的樣品前處理成本低、速度快；用甲醇-乙酸銨水溶液作流動(dòng)相。方法具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、回收率較高的特點(diǎn)，各項(xiàng)指標(biāo)滿足分析的要求，適合腐竹等固體豆制品中堿性橙染料的檢測(cè)。

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HPLC Determination of 3 Basic Orange Dyes in Bean Products

JIN Yue1，2，CUI Jin2，MEI Lian-rui2，LI Jing-wei2，YAN Shi-jie3，4，*，LIU Xiang2，*
（1. College of Aquaculture，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China；2. National Quality Supervision and Testing Center for Processed Food，Tianjin 300308，China；3. College of Food Science and Biological Engineering，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China；4. Tianjin Engineering and Technology Research Center of Agricultural Products Processing，Tianjin 300384，China）

Abstract：A method for the simultaneous determination of basic orange 2，basic orange 21 and basic orange 22 contents in bean products was developed by high performance liquid chromatography（HPLC）. The sample was extracted by ethanol and sonicator，then centrifuged by centrifuge，the extracts were combined in vacuum to dryness，the residue was dissolved in a given solution，drew supernatants were after centrifuged，separated and detected by HPLC after 0.45 μm membrane. The column was C(18)，the detection wavelength basic orange 2 is 449 nm，basic orange 21，basic orange 22 are 485 nm；mobile phase was methanol-aqueous ammonium acetate. The linear ranges of this method for determining the three pigments were 0.1 μg/mL-20 μg/mL and the correlation coefficients（r）all were higher than 0.999 9. The recoveries at three levels respectively ranged from 83.1 % to 116.7 %，and the RSDs were 1.02 %-9.65 %（n= 6）. The limits of detection were about 0.02 mg/kg，the limit of quantitation were about 0.08 mg/kg.

Key words：high performance liquid chromatography；bean products；basic orange 2；basic orange 21；basic orange 22

收稿日期：2015-04-17

*通信作者：閆師杰（1971—），男（漢），教授，博士，主要從事食品質(zhì)量與安全方面的研究與教學(xué)；劉祥（1976—），男（漢），正高級(jí)工程師，博士，主要從事食品安全檢測(cè)與分析。

作者簡(jiǎn)介：金鑰（1990—），女（漢），在讀碩士研究生，主要從事動(dòng)物性食品安全與營(yíng)養(yǎng)方面的研究。

基金項(xiàng)目：國(guó)家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)（2013YQ510391）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.036